实验七氨基酸的分离鉴定精修订

实验七氨基酸的分离鉴

定

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实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、目的

通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。

二、原理

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。

惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。

展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。

分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。

当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。

不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

层析溶剂由有机溶剂和水组成

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移

值）来表示的：

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、材料与方法

（1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮

（2）操作步骤

1.配置层析液置于密闭的层析缸中。

2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。

3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。

4．扩展?用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升15―20cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

5．显色?用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。

6．计算各种氨基酸的Rf值。

四、结果与分析

在显色反应中，脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质，其余皆为紫色，因为脯氨酸为亚氨基酸，与茚三酮反应并不释放氨气，而直接产生黄色物质。

混合氨基酸一定有赖氨酸和脯氨酸，可能有缬氨酸和苯丙氨酸，因为脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质，赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸与茚三酮反应生成紫色物质。

五、讨论与结论

本实验的关键是层析液的制备，点样点要小。由于层析时间较短，混合氨基酸没有完全分开，所以本次实验失败。

六、思考题

1.何为纸层析法答：纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

2.何谓Rf值影响Rf的主要因素是什么答：（1）氨基酸被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：Rf=原点到层析中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。（2）在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

3.怎样制备扩展剂答：扩展剂800-1000mL是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放人分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。

4.层析缸中平衡溶剂的作用是什么答：（1）防止或减少边缘效应的出现.所谓边缘效应,是指并列点样的同一物质经薄层展开后薄板边缘处的比移值比中间的要大的现象。（2）平衡剂起到使纸层析上吸附的溶剂达到饱和。是物质在展开剂和纸层析上吸附的溶剂中溶解度不同而进行分离。

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