一,RTPCR的基本知识

一、RT—PCR的原理
逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。

在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR 进行DNA扩增。

RT-PCR的整体过程：首先由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。

原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

RT-PCR 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。

RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

二、常用RT-PCR定量分析的方法
1、实时荧光PCR（Quantitative Real-time PCR）
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

在荧光信号中常用的荧光物质分为两种物质，荧光探针和荧光染料
(1)SYBRGreenⅠ荧光染料法
在RT-PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

这种方
法可以用已知浓度的稳定核酸的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量。

标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。

在标准曲线和未知样品反应过程中，通过荧光染料将产物标记，用相应的仪器随着反应的进行记录实验的实时结果。

(2).TaqMan探针法
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链式反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

另外通过探针法可以对不同基因型的样品用不同的染料标记，每种染料只对某种特定的基因进行染色。

检测时分别将样品放入不同的染料通道中检测是否含有特定的染料。

在完成检测后，分析不同样品中含有那些染料，分析基因是纯合杂合还是野生型。

2、Delta-deltaCt法和双标准曲线法
基因表达调控研究中，常用的相对定量方法主要有两种，Delta-deltaCt 法和双标准曲线法。

由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。

常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。

因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。

（1）Delta-deltaCt法
由Delta-delta Ct的公式可以看出，该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致。

Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用：1. Comparative Delta-delta Ct法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。

2. 每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。

用Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。

Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线
的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。

反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。

此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。

（2）双标准曲线法
双标准曲线法考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率。

双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用：1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优化。

2. 其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。

并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。

每种相对定量方法都会有一定的局限性，对于双标准曲线法，比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对Delta-delta Ct法更为简单。

下面是某科研用户用双标准曲线法进行相对定量分析的实例。

要用该方法进行分析，
客户在一轮反应中，对目的基因和看家基因分别做了一组标准曲线，同时也分别扩增的待测样品的目的基因和看家基因。

三、RT-PCR的分析
传统的定量分析方法中大部分都是重点检测，在PCR到达后期之后再进行检测，而PCR经过对数期的扩增之后，检测重现性差，所得结果差异很大，因此往往无法达到准确的定量分析。

而实时荧光PCR和Delta-deltaCt法和双标准曲线法等
RT-PCR的检测方法可以在每次的PCR循环过程之后对样品PCR的情况进行检测，并记录在相应的电脑软件中，部分消除终产物定量的不准确性。

同时RT-PCR还具有高灵敏度和简便操作的优点，在进行定量分析的实验中RT-PCR的准确性是很高的。

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