最新聚合酶链式反应PCR
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
pcr的原理和步骤
pcr的原理和步骤
PCR（聚合酶链式反应）是一种基因扩增技术，可以通过复制DNA片段来产生大量的特定DNA序列。
PCR的原理和步骤
如下：
原理：
PCR基于DNA的体外扩增，使用DNA聚合酶来合成新的
DNA链。
其过程可以概括为三个主要步骤：变性、退火和延伸。
这些步骤在不同温度下进行，使用特定的引物来定向扩增目标DNA序列。
步骤：
1. 变性（Denaturation）：将含有所需DNA片段的DNA模板
加热至94-98℃的高温，使双链DNA解链成两条单链。
在此
过程中，氢键断裂，使两条链分离。
2. 退火（Annealing）：将温度降低至50-65℃，使引物与单链DNA模板的互补序列结合。
引物是DNA的短片段，其中一段序列与目标DNA序列的两端相互衔接。
3. 延伸（Extension）：将温度升高至72℃，加入DNA聚合酶
和足够的核苷酸（dNTPs），使DNA聚合酶沿着引物的互补
序列合成新的DNA链。
DNA聚合酶能够识别引物上的碱基对，并在其基础上合成新的DNA链。
此过程会在每一个DNA模
板两端的引物上进行。
以上步骤组成了PCR的一个循环。
通常，PCR会进行多个循
环，每个循环使DNA的数量翻倍，从而快速扩增目标DNA 序列。
PCR的结果是产生大量特定的DNA片段，可以用于分析、测序、克隆等应用。
聚合酶链式反应PCR实验报告
扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透
射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示 加入的为1号样，出现在
500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。 4、 讨论
1. Mg2+离子浓度对PCR扩增效 率影响很大，浓度过高可降 低PCR扩增的特 异性浓度过 低则影响PCR扩增产量甚至 使PCR扩增失败而不出扩增 条带。
1．H2O 12μl 2．模板 1μl 3．引物T7 1μl 4．引物 sp6 1μl 5．2*PCRmix 15μl PCR仪的热循环反应 把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模 板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
2. 变性温度低，变性时间短， 极有可能出现假阴性;退火 温度过低，可致非特异性扩 增而降低特异性扩增效率退 火温度过高影响引物与模板 的结合而降低PCR扩增效 率。
3. EB：溴化乙锭是一种高度灵 敏的荧光染色剂，用于观察 琼脂糖中的DNA，可与DNA 结合，用标准nm 紫外 光透射仪激发并放射出橙红 色信号。
2. 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后， 温度降至56℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3. 引物的延伸：经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的 半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。
实验二 聚合酶链式反应（PCR）
《聚合酶链式反应技术》 知识清单
《聚合酶链式反应技术》知识清单聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称 PCR）技术是现代分子生物学领域中的一项关键技术，它具有极其重要的应用价值。
一、PCR 技术的原理PCR 技术的基本原理其实并不复杂。
想象一下，我们有一条很长的DNA 链，就像一条长长的绳子。
我们的目标是把其中特定的一小段“剪”下来并进行大量复制。
首先，我们要知道这段特定 DNA 片段的两端序列，然后根据这两端的序列设计出一对引物。
引物就像是两个小钩子，能够特异性地与目标 DNA 片段的两端结合。
接下来，把 DNA 模板、引物、四种脱氧核苷酸（dNTPs）、耐高温的 DNA 聚合酶（比如 Taq 聚合酶）以及合适的反应缓冲液混合在一起，放入 PCR 仪中。
PCR 仪会按照设定的程序，先将反应体系加热到 90-95℃，使 DNA 双链变性，变成两条单链。
然后，温度降低到 50-65℃，引物与单链DNA 结合，这一步叫做退火。
最后，温度升高到 70-75℃，DNA 聚合酶沿着引物的方向合成新的 DNA 链，这就是延伸。
这样，经过一个循环，原来的一条DNA 双链就变成了两条。
然后，再经过多次这样的循环，目标 DNA 片段就会以指数形式大量扩增。
二、PCR 技术的反应体系一个完整的 PCR 反应体系通常包括以下几个主要成分：1、 DNA 模板：这是我们要扩增的对象，可以是基因组 DNA、质粒 DNA 或者 cDNA 等。
2、引物：引物是决定 PCR 特异性和扩增效率的关键因素。
它们是一小段人工合成的寡核苷酸序列，通常长度在 18-30 个碱基之间。
3、四种脱氧核苷酸（dNTPs）：包括 dATP、dTTP、dCTP 和dGTP，它们是合成新 DNA 链的原料。
4、 DNA 聚合酶：常见的有 Taq 聚合酶，具有耐高温的特性，能够在高温条件下保持活性。
5、反应缓冲液：提供合适的离子强度、pH 值等反应条件，以保证反应的顺利进行。
实验二PCR扩增(聚合酶链式反应)
实验二 PCR扩增（聚合酶链式反应）一、实验目的1.学习聚合酶链式反应概念及技术方法；2.掌握聚合酶链式反应操作过程。
二、实验原理（聚合酶链式反应）PCR是聚合酶链式反应，是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成1．模板DNA的变性模板DNA加热到90-95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
2．模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至37-65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。
聚合酶链式反应技术(PCR)
关键词：核酸标记通过核酸标记技术可将细胞因子cDNA作为基因探钊检测细胞内细胞因子基因组DNA或mRNA。
主要有以下几种方法：1.应用同位素（或非同位素）标记的cDNA探针，检测经Northern blot后细胞因子mRNA水平或采用打点杂交法。
2.应用标记cDNA探钊与细胞或组织切片进行原位杂交，然后进行放射自显影。
3.细胞因子mRNA经反转录为cDNA，用特异性细胞因子引物经聚合酶链反应（PCR）扩增细胞因子cDNA,Southern blot后用标记探针检测特异细胞因子DNA水平。
核酸扩增检测技术的研究进展(作者傅占江来源摘自：《国外医学临床生化学与检验学分册》)聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。
近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。
已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。
前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。
信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕获、侵染(Invader)和通过扩增替代分子来检测靶核酸等方法。
而滚环增（RCA）是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。
这些方法的区别见表1。
表1 不同核酸扩增技术的特性fig2058BDNA：枝状DNA,LCR：连接酶链式反应；NASBA：依赖性核酸序列的扩增；PCR：聚合酶链式反应；RCA：滚环扩增：RT-PCR：逆转录PCR; SDA: 链替代扩增；SNP：单核苷酸多态性：TMA：转录依赖的扩增；Invader:侵染检测技术1 反应（PCR）在DNA扩增方面,PCR一直是应用最广泛的方法。
美国食品与与药品管理局（FDA）已经批准一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒（Roche）,如HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等。
聚合酶链式反应pcr
聚合酶链式反应pcr
1 聚合酶链式反应PCR
聚合酶链式反应（PCR）是一种允许大量翻倍指定的DNA序列的分
子生物技术。
通过利用特殊的酶（聚合酶）将两个DNA片段分别相互“拉伸”，重复地迭代扩增，合成更长的片段。
1.1 PCR的原理
PCR主要利用DNA聚合酶的功能来调控DNA片段的重复扩增与合成。
扩增过程分为三个步骤，即引物扩增、双螺旋扩增、保守分裂。
引物
扩增过程中，首先将扩增片段与反转录引物结合起来，DNA聚合酶将其复制到双螺旋结构；双螺旋扩增过程中，DNA聚合酶会主动分裂双螺旋，然后重复复制双螺旋，产生DNA序列的复制品；最后，保守分裂过程中，会继续分裂DNA双螺旋，直到完成指定的扩增任务。
1.2 PCR的应用
PCR技术有着广泛的应用，主要包括临床诊断应用、筛检、疾病分子检测等。
其中，PCR已经被广泛应用在心脑血管疾病、肿瘤、感染性疾病以及遗传病的检测上，准确可靠地检测出各种疾病的抗原。
另外，PCR技术在基因组学研究中也有广泛应用，可以用来进行基因鉴定、基因表达研究、比较基因组研究等。
在微生物学研究中，PCR技术也可以用来识别和遗传分类各种细菌和病毒，可以研究它们的源头和传播路径。
由此可见，聚合酶链式反应PCR技术无疑是一种重要而有用的分子生物技术，它已经得到广泛的应用，在诊断、疾病研究以及基因组学研究中发挥着重要作用。
聚合酶链式反应
2、时间
第一次变性应给予足够时间（ 分钟） 第一次变性应给予足够时间（5 ~ 7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度， 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一 般为复性时间一般为30～ 般为复性时间一般为30～60sec 30 延伸时间：1Kb以内的DNA片段 延伸时间1min 以内的DNA片段， 1min（ 延伸时间：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（
PCR反应原理和反应过程 一、PCR反应原理和反应过程
DNA的体外复制包括3个步骤： DNA的体外复制包括3个步骤： 的体外复制包括 • 变性（denaturation）:94 °C ~95 °C 变性（denaturation） • 退火（annealing）:40 °C ~70 °C 退火（annealing） • 延伸（extension）:72 °C 延伸（extension） 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一 个步骤作为PCR的一个循环， PCR的一个循环 个循环，一个分子的模板被复制为二个， 个循环，一个分子的模板被复制为二个， 产物量以指数形式增长。 产物量以指数形式增长。
PCR技术的创建 PCR技术的创建
Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性, Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物 等提出在体外经DNA变性 杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 DNA聚合酶延伸 DNA的设想 杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术 发明了PCR技术, Khorana的设想得到 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到 实现。 实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶 Taq）引入了PCR 等将耐热DNA聚合酶（ PCR技 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技 术 1989年美国 Science》杂志列PCR 年美国《 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科 学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis 1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获 学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖。 1993年度诺贝尔化学奖。 年度诺贝尔化学奖
聚合酶链式反应%28PCR%29基本操作步骤
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA 聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此，PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
通常，PCR 在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．T aq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些，故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
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94℃30″，55 ℃ 30 ″，72 ℃ 1′， 35个循环，72 ℃延伸 5 ′。
五、PCR反应条件优化：
1、温度、循环参数：
⑴ 变性温度和时间：
保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成 功的关键。
加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子 也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调 整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可 使各种复杂的DNA分子完全变性。
温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活 性和dNTP分子造成损害。
⑵ 复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。
复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含 量确定，长度在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，一般位于40 ～ 60℃， 30 ～ 60 s。
复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越 低，产物特异性越低。
一般情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板 之间完全结合。
2. MgCl2: 1.5 ～ 2.0 mM
Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应 的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非 特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下 降。
3. dNTPs :
dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物
0.02 ～ 0.2 mM
dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度 与dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 ～ 2.5 mM。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 25 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
三、PCR的成分和作用：终浓度
1. 缓冲液：
10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4)
维持 Taq 酶作用环境的偏碱性
25 ～ 50 mM KCl
促进引物退火，>50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。
100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)
对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。
聚合酶链式反应PCR
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
PCR技 术 原 理
Tem plate D N A 5
5 5
C ycle 1
Prim er 1 5 Prim er 2
1U / 25 ～ 50μl
偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低
6. 模板DNA (Template): 最低102 ～ 105 bp DNA片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl 过高：非特异产物增加 过低：产量降低
7. 水： 去离子水，补足整个反应体积。
四、PCR反应体系：
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl
模板：
1μl
水：
30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
操作： 5份标本 总体积 30μl ×6 = 180μl
1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂：
10×buffer： 3μl ×6 = 18μl
MgCl2:
1.8μl×6 = 10.8μl
5 5
5 5
C ycle 2
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所 决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的 作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的 片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物 是介于两种引物5’ 端之间的DNA片段。
dNTPs:
0.6μl×6 = 3.6μl
引物 P：
2.4μl ×6 = 14.4μl
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl
水：
21μl × 6 = 126μl
共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时
混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。 3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混
循环次数越多，非特异扩增增加。
2、MgCl2浓度： 可显著影响PCR的产量及产物特异性 1.5 ～ 2.0 mM 过高：增加非特异扩增并影响产率 过低：酶活性显著下降。
率和室验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。
4. 引物 (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。
0.2 ～ 1 μM
偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。
偏低：产量降低。
5. Taq DNA 聚合酶：耐高热 0.5 ～ 5 U / 100 μl
⑶ 延伸温度和时间： 一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。
引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。
延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。
延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 ℃ 1′。
⑷ 循环数：
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于 模板DNA的浓度。
理论上说20 ～ 25次循环后，PCR产物的积累 即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产 率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少， 20 ～ 30次是比较合理的循环次数。