最新聚合酶链式反应PCR
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加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子 也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调 整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可 使各种复杂的DNA分子完全变性。
温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活 性和dNTP分子造成损害。
⑵ 复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。
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C ycle 2
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目录
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Cycle 3
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25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所 决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的 作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的 片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物 是介于两种引物5’ 端之间的DNA片段。
循环次数越多，非特异扩增增加。
2、MgCl2浓度： 可显著影响PCR的产量及产物特异性 1.5 ～ 2.0 mM 过高：增加非特异扩增并影响产率 过低：酶活性显著下降。
1U / 25 ～ 50μl
偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低
6. 模板DNA (Template): 最低102 ～ 105 bp DNA片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl 过高：非特异产物增加 过低：产量降低
7. 水： 去离子水，补足整个反应体积。
四、PCR反应体系：
延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 ℃ 1′。
⑷ 循环数：
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于 模板DNA的浓度。
理论上说20 ～ 25次循环后，PCR产物的积累 即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产 率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少， 20 ～ 30次是比较合理的循环次数。
复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含 量确定，长度在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，一般位于40 ～ 60℃， 30 ～ 60 s。
复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越 低，产物特异性越低。
一般情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板 之间完全结合。
匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸 发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。 4. 反应条件：PCR扩增仪
94℃30″，55 ℃ 30 ″，72 ℃ 1′， 35个循环，72 ℃延伸 5 ′。
五、PCR反应条件优化：
1、温度、循环参数：
⑴ 变性温度和时间：
保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成 功的关键。
2. MgCl2: 1.5 ～ 2.0 mM
Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应 的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非 特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下 降。
3. dNTPs :
dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物
0.02 ～ 0.2 mM
dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度 与dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 ～ 2.5 mM。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入
三、PCR的成分和作用：终浓度
1. 缓冲液：
10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4)
维持 Taq 酶作用环境的偏碱性
25 ～ 50 mM KCl
促进引物退火，>50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。
100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)
对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。
聚合酶链式反应PCR
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
PCR技 术 原 理
Tem plate D N A 5
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C ycle 1
Prim er 1 5 Prim er 2
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl
模板：
1μl
水：
30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
操作： 5份标本 总体积 30μl ×6 = 180μl
1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂：
10×buffer： 3μl ×6 = 18μl
MgCl2:
1.8μl×6 = 10.8μl
dNTPs:
0.6μl×6 = 3.6μl
引物 P：
2.4μl ×6 = 14.4μl
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl
水：
21μl × 6 = 126μl
共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时
混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。 3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
ຫໍສະໝຸດ Baidu
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 25 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
率和室验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。
4. 引物 (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。
0.2 ～ 1 μM
偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。
偏低：产量降低。
5. Taq DNA 聚合酶：耐高热 0.5 ～ 5 U / 100 μl
⑶ 延伸温度和时间： 一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。
引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。
延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。
温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活 性和dNTP分子造成损害。
⑵ 复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。
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C ycle 2
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Cycle 3
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25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所 决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的 作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的 片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物 是介于两种引物5’ 端之间的DNA片段。
循环次数越多，非特异扩增增加。
2、MgCl2浓度： 可显著影响PCR的产量及产物特异性 1.5 ～ 2.0 mM 过高：增加非特异扩增并影响产率 过低：酶活性显著下降。
1U / 25 ～ 50μl
偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低
6. 模板DNA (Template): 最低102 ～ 105 bp DNA片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl 过高：非特异产物增加 过低：产量降低
7. 水： 去离子水，补足整个反应体积。
四、PCR反应体系：
延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 ℃ 1′。
⑷ 循环数：
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于 模板DNA的浓度。
理论上说20 ～ 25次循环后，PCR产物的积累 即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产 率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少， 20 ～ 30次是比较合理的循环次数。
复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含 量确定，长度在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，一般位于40 ～ 60℃， 30 ～ 60 s。
复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越 低，产物特异性越低。
一般情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板 之间完全结合。
匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸 发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。 4. 反应条件：PCR扩增仪
94℃30″，55 ℃ 30 ″，72 ℃ 1′， 35个循环，72 ℃延伸 5 ′。
五、PCR反应条件优化：
1、温度、循环参数：
⑴ 变性温度和时间：
保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成 功的关键。
2. MgCl2: 1.5 ～ 2.0 mM
Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应 的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非 特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下 降。
3. dNTPs :
dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物
0.02 ～ 0.2 mM
dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度 与dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 ～ 2.5 mM。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入
三、PCR的成分和作用：终浓度
1. 缓冲液：
10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4)
维持 Taq 酶作用环境的偏碱性
25 ～ 50 mM KCl
促进引物退火，>50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。
100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)
对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。
聚合酶链式反应PCR
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
PCR技 术 原 理
Tem plate D N A 5
5 5
C ycle 1
Prim er 1 5 Prim er 2
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl
模板：
1μl
水：
30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
操作： 5份标本 总体积 30μl ×6 = 180μl
1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂：
10×buffer： 3μl ×6 = 18μl
MgCl2:
1.8μl×6 = 10.8μl
dNTPs:
0.6μl×6 = 3.6μl
引物 P：
2.4μl ×6 = 14.4μl
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl
水：
21μl × 6 = 126μl
共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时
混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。 3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
ຫໍສະໝຸດ Baidu
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 25 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
率和室验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。
4. 引物 (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。
0.2 ～ 1 μM
偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。
偏低：产量降低。
5. Taq DNA 聚合酶：耐高热 0.5 ～ 5 U / 100 μl
⑶ 延伸温度和时间： 一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。
引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。
延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。