酶的化学修饰
酶分子的化学修饰
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
04酶分子的化学修饰
猪肝尿酸酶 糜蛋白酶 吲哚-3 -链烷羟化酶 猪肝尿酸酶 产沅假丝酵母尿酸酶
修饰剂
白蛋白 肝 素 聚丙烯酸 PEG PEG
天然酶
10.5 8.0 3.5 8.2 8.2
修饰酶
7.4 - 8.5
9.0 5.0 - 5.5 9.0 8.8
作业题：
1、名词解释：酶分子修饰 2、酶分子的化学修饰方法有哪些？ 3、酶肽链的大分子共价修饰的修饰剂和修 饰反应有哪些？ 4、分析说明修饰酶的性质。
一、被修饰酶的性质 （一）酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，
作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质， 抑制剂的性质等。
（二）酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心
的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子 等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。
（三）酶侧链基团的性质与反应性 1、对巯基的化学修饰： 常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。 2、氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂友乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、 2，4-二硝基氟苯、烷基化时剂、丹磺酰氯(DNS)和 苯异硫氰酸酯（ PITC)等。 3、羧基的化学修饰： 水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、 甲醇-盐酸酯化反应等。 4、咪唑基的修饰反应： 焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。
（三）酶蛋白修饰反应的主要类型 酯化及相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 溴化氰裂解反应
第三节 酶蛋白肽链的大分子修饰
一、聚乙二醇及其修饰反应：聚乙二醇（PEG）是线 性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体 内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶分子 的抗原性，被广泛用于酶的修饰。 聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子 被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改 变，从而产生许多有用的性质，如可以在广泛的 pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移 率下降等。 主要的修饰方法有：叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均 嗪法、羰二亚胺法、重氮法。
酶分子的化学修饰
2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
酶的化学修饰
第五章酶分子的化学修饰主要内容：●酶的活性中心●酶化学修饰的目的●酶化学修饰的原理●酶化学修饰的设计●酶化学修饰的应用第一节酶的活性中心（active site）一、活性中心的概念P12酶的必需基团(essential group): 与酶活性有关的基团酶的活性中心(active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.酶的必需集团在一级结构上并不互相毗邻，往往分散在氨基酸系列中，甚至分布在不同肽链上。
当肽链盘曲、折叠形成空间结构时，互相隔离的必需基团彼此靠近，集中在酶分子表面而形成具有三维结构的特定区域。
该区域能与底物结合并发挥催化作用，故称酶的活性中心(active center)活性部位（active site）。
对于结合酶来说，辅酶或辅基参与酶活性中心的组成。
活性中心的重要化学基团——7种氨基酸出现的频率最高：Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr和Ser（兰天果拌猪肉丝）。
某些功能基团（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基）是酶的必需基团。
图释左图：丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基右图：天冬氨酸和谷氨酸的羧基、赖氨酸的氨基、酪氨酸和丝氨酸的羟基。
二、活性中心的共性P12(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。
(2)活性部位是一个三维实体(entity)(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。
(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。
1．The active site takes up a relatively small part of the total volume of an enzyme.左图：肌球蛋白模型。
只显示出α-碳原子，红的为血红素，绿的是两种关键的组氨酸残基。
右图：来自胞质热激蛋白的ATP酶片段的结构图。
ADP（红的）位于两个结构域（黄和蓝的）之间的裂缝中。
05-酶的化学修饰
（二）酶蛋白主链的修饰 ——主要是靠酶法进行修饰，用 蛋白酶对主联进行部分水解，可 以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰 ——通过选择性修饰催化活性氨 基酸的侧链来实现氨基酸残基的 取代，使一种氨基酸侧链转化为 另一种氨基酸侧链，这种方法又 称为化学突变法。
（四）肽链伸展后的修饰 ——酶蛋白经过脲、盐酸胍处理， 使肽链充分伸展，对酶分子内部 的疏水基团进行修饰，然后在适 当条件下，重新进行折叠。
（三）酶的大分子修饰作用 ——非共价修饰 ——共价修饰
1、大分子非共价修饰
——利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互 作用，对酶进行有效的保护 ——例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定 于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连， 从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚 氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护 酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用， 排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶 的稳定性增加。
在基础酶学研究上
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 酶蛋白一级结构的测定
酶蛋白的结构变化与运动
酶蛋白部分区域的构象状态 酶的作用机理与催化反应历程 酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态 酶的固定化技术 酶纯度的分析与检测
在疾病治疗上
—克服酶在体内的不稳定性
—消除或降低酶的抗原性 —有助于酶分子到达并集中于病灶细胞 在工业上的应用
第五章
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰
——在分子水平上对酶进行改造，以达 到改变结构和改性的目的。在体外将酶 分子通过人工的方法与一些化学物质， 特别是一些有生物相容性的物质进行共 价连接，从而改变酶的结构和性质。这 些化学物质称为修饰试剂，酶化学修饰 主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。
第三章第三节酶的化学修饰ppt课件
9）、二硫键的修饰
2、酶分子表面的化学修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精 细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。
水溶性大分子： ＰＥＧ及其衍生物：是线性分子，具有良好的生物相容性和水
溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗 原性。 右旋糖酐及其衍生物：右旋糖苷是由α—葡萄糖通过α—1， 6—糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和 水溶性。 糖肽：糖肽是蛋白酶水解人纤维蛋白或Y一球蛋白所得到的产 物。其分子上具有游离氨基，活化后与酶分子上氨基反应，从 而可修饰酶。 其他天然大分子（肝素、血清白蛋白） 其它合成大分子多聚物：聚N—乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇 （PVA）聚丙烯酸(PAA)饰的定义
通过化学方法对酶分子施行的各种改造和 修饰，以改变酶理化性质及生物活性的方法。
二、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用
范围。（70年代末之后） 1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2）保护酶活性部位与抗抑制剂 3）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4）消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
如：PEG-腺苷脱氨酶、PEG-超氧化物歧化、 PEG-溶血类蛋白、PEG-天门冬酰氨酶、
缺点： 扩散速度受限； 生物活性降低； 选择性不高，稳定性不够理想。
极性氨基酸
1）无电荷的极性氨基酸（共7种）：
丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T),
酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),
天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),
酶的化学修饰
酶的化学修饰
聂继龙
酶化学修饰的概念：通过主链的 切割剪接和侧链基团的化学修饰 对蛋白酶进行分子改造，以改变 其理化性质及生物活性。这种用 化学方法对酶分子施行种种手术 的方法称为“酶分子的化学修 饰”。
广义上讲:凡涉及共价键或部分共价 键的形成或破坏的转变都可以看作 是酶的化学修饰。从狭义上讲：酶 的化学修饰在较温和的条件下，以 可控制的方式使一种酶同某些化学 试剂起特异反应，从而引起单个氨 基酸残基或其功能基团发生共价的 化学修饰。
7、对组织分布能力的改变 一些酶经化学修士后，对组织的 分布能力有所改变能在血液中被 靶器官选择性的吸收
酶化学修饰的应用 （1）酶结构与功能的研究 可以通过修饰剂对酶的作用，以及 修饰的部位来判断酶的结构 (2）在医学方面的应用，主要是治 疗和诊断方面的应用。 （3）在工业方面的应用 主要是提高产量，减少成本，而且 将少对环境的污染。
5、肽链的延伸：为了有效的修 饰酶分子的内部区域，可以先用 脲或盐酸胍处理，使酶分子的肽 链充分伸展，这就提供了化学修 饰酶分子内部疏水基团的可能性。 然后让修饰酶的伸展肽链在适当 条件下，重新折叠成某种具有催 化活力的酶。
通过定点突变的化学修饰。通过 一些可控制的方法在酶或蛋白质 特殊的位点引入特定分子来修饰 酶或蛋白质，结合定点突变引入 一种非天然氨基酸侧链来进行化 学修饰，从而得到一些新颖的酶 制剂。
酶的化学修饰的目的：人为的改变 天然酶的一些性质，创造天然酶不 具有的某些优良性质甚至创造新的 活性，来扩大酶的应用领域促进生 物技术的发展。概括起来有三点：1、 提高生物活性。2、增强不良环境中 的稳定性。3、针对特异反应，降低 生物识别能力。
化学修饰的方法： 1，酶的表面修饰，（1）大分子修 饰，可溶性大分子，如聚乙二醇， 聚乙烯比咯烷酮，聚丙烯酰胺、葡 聚糖、环糊精、肝素等。一般聚乙 二醇的分子量在500~2000应用最 广。聚乙二醇是两亲性分子，化学 修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇。
酶分子的化学修饰方法具体实例
酶分子的化学修饰方法1.酶的表面修饰2.酶分子的内部修饰3.与辅因子相关的修饰4.金属酶的金属取代1.1酶的表面修饰1.1.1化学固定化例如:①固定在电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH向碱性(阴离子载体)或向酸性(阳离子载体)方向偏移。
这样，在生产工艺中需几个酶协同作用时，由于固定化可使不同酶的最适pH彼此靠近。
②将糖化酶固定在阴离子载体上，其最适pH由4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适PH(7.5)靠近，这样，可简化高果糖浆生产工艺。
如果载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统Km值增加；带相反电荷，Km值降低。
当酶与载体连接点达到一定数目时，可增加酶分子构象稳定性，防止其构象伸展而失活。
1.1.2 酶的小分子修饰作用例如:③将α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的NH2COOH并达到一定程度时，酶的热稳定性在60℃时，提高了1000倍，温度更高时稳定化效应更强烈。
这个稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活.1.1.3酶的大分子修饰例如:④聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能够有效地起作用。
嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链裂解，但用聚乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。
1.1.4 分子间交联例如:⑤戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。
这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白酶的自溶作用降低，也使其反应器体积减少。
将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联而形成的杂化酶，可作为部分代谢途径的模型，则有可能在体内将它们输送到同一部位而提高药效。
1.2酶分子的内部修饰1.2.1非催化活性基团的修饰例如: ①将胰凝乳蛋白酶的Met192氧化成亚砜，则使该酶对含芳香族或大体积脂肪族取代基的专一性底物的束缚口袋有关．也说明底物的非反应部分束缚在酶的催化作用中有重要作用。
1.2.2酶蛋白主链修饰例如: ②用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了5.5倍。
名词解释酶的化学修饰
名词解释酶的化学修饰酶的化学修饰是指酶在细胞内经过一系列化学反应，导致其分子结构发生变化，从而改变其生物学活性的过程。
这种修饰过程可以发生在酶的分子内部或表面，并且可以引起酶的活性增加、降低或改变。
以下是对酶的化学修饰的几种主要类型的解释：1.磷酸化磷酸化是一种常见的酶修饰方式，是通过将磷酸基团添加到酶的分子上而实现的。
磷酸化可以影响酶的活性、调节酶的底物特异性、改变酶的分子大小和电荷分布等。
例如，在糖原磷酸化酶的修饰中，磷酸化可以使其活性增加，促进糖原分解为葡萄糖的过程。
2.乙酰化乙酰化修饰是在酶的分子上添加乙酰基团的过程。
这种修饰通常影响酶的活性中心，改变酶对底物的亲和力和催化效率。
例如，在乙酰化转移酶的修饰中，乙酰化可以增加酶对乙酰基团的转移能力，从而促进脂肪酸的合成。
3.甲基化甲基化修饰是在酶的分子上添加甲基基团的过程。
甲基化可以影响酶的活性、调节酶的底物特异性和稳定性。
例如，在组蛋白甲基转移酶的修饰中，甲基化可以影响染色体的结构和基因表达水平。
4.糖基化糖基化是在酶的分子上添加糖链的过程。
糖基化可以改变酶的分子大小、调节酶的溶解性和稳定性、保护酶免受细胞外酶的降解等。
例如，在免疫球蛋白糖基转移酶的修饰中，糖基化可以调节抗体的抗原特异性，影响免疫应答的效果。
5.硫化硫化修饰是在酶的分子上添加硫原子或硫基团的过程。
硫化修饰通常发生在某些金属蛋白酶中，可以影响酶的活性中心和底物特异性。
例如，在胱氨酸蛋白酶的修饰中，硫化可以使其对底物的催化效率提高数百倍。
6.肽化肽化修饰是通过将肽键添加到酶的分子上而实现的。
肽化可以改变酶的分子大小、调节酶的底物特异性和溶解性等。
例如，在胰岛素原的修饰中，肽化可以使其转化为有活性的胰岛素，从而调节血糖水平。
7.氧化还原氧化还原修饰是通过改变酶分子上的氧化态或还原态的硫基团、氮基团或碳基团来实现的。
这种修饰可以影响酶的活性、调节底物特异性、改变酶对氧化剂或还原剂的敏感性。
酶的化学修饰
第四节 酶的亲和修饰
• 亲和标记：
• 又称专一性的不可逆抑制主要指的是修饰 剂具有与底物相类似的结构，对酶活性部 位具有高度的亲和性，能对活性部位的氨 基酸残基进行共价标记。
• 亲和试剂作为底物类似物应具有的条件： 1）在酶不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形 成可逆的复合物 2）没有反应性的竞争性的配体存在 3）试剂的体积不能过大，防止空间障碍的产 生 4）修饰产物稳定，有利于分析
• 酶的化学修饰（chemical modification）： 酶的化学修饰（chemical modification）： • 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价
结构发生改变。
• 酶选择性化学修饰： • 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
二、酶化学修饰的目的
第三章 酶的化学修饰
酶作为生物催化剂，其高效性和专 一性是其他催化剂无法比拟的，但是天 然酶的半衰期短，不稳定性等问题限制 了它的应用，如何延长半衰期，提高酶 的稳定性，降低抗原性等越来越引起人 们的关注了。酶的化学修饰是可以从分 子的水平上来改造酶，弥补天然酶缺陷 的一种重要的手段。
一、酶化学修饰的概念
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范 围。（70年代末之后） 围。（70年代末之后） 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能 力）。 4）产生新的催化能力。
②化学修饰数据的分析
•
化学修饰的时间进程分析 根据获得的 时间进程曲线，可以了解修饰残基的性质 和数目、修饰残基与蛋白质生物活性之间 的关系等，实际是通过测定蛋白质的失活 速度常数的测定。大多实验中，修饰剂远 远多于被修饰的残基，可认为是假一级反 应，然后用残余活力的对数对时间作图， 得出失活常数。
酶的化学修饰
酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。
二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。
三、酶分子修饰的意义⏹提高酶的活力⏹增强酶的稳定性⏹降低或消除酶的抗原性⏹研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。
四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。
使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。
“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
酶的化学修饰
的保持时间。
＋ HCl
• 焦碳酸二乙酯（DPC)和碘代乙酸， DPC对 抗凝血、抗血栓、降血脂活性，修饰溶栓酶类增加疗效。
+ HI
+
2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB)和4－硝基
组氨酸残基有较好的专一性，240nm。 交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其它分子之间发生交联反应。
修饰试剂应具备以下特征:
①选择性地与一个氨基酸残基反应; ②酶蛋白不变性; ③标记的残基在肽中稳定 ④反应的程度能用简单的技术测定。
2、反应条件的选择
①不造成蛋白质的不可逆变性。 ②有利于专一性修饰蛋白质。
3. 反应的专一性
①利用蛋白质分子中某些基团的特殊性。 例：二异丙基氟磷酸酯(DFP)能与胰凝乳蛋白
E－SH + R－S－S－R
E－S－S－R
+ R－SH
E－SH + E－S－S－R
E－S－S－E
+ R－SH
与—SH进行二硫键交换后，—SH被修饰，试剂 的另一半以单体放出。
常用的二硫键交换试剂： DTNB， 5, 5’-dithio-bis-(2-Nitrobenzoate)
二硫二吡啶，4, 4’-dithiodipyridine （或2, 2’-dithiodipyridine）
酶的化学修饰
概念
酶的化学修饰（Chemical modification） 化学手段将某些原子或化学基团结合到酶 分子上，或将酶分子中某基团改变，改变 酶的催化性质及一些生理生化性质。
易实现，作用快，成本
例如：
1、用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基， 对60°C热处理的稳定性增高了1000倍。
第六章 酶分子化学修饰
三、研究酶活性中心的方法
1.物理学方法： 用X射线衍射法直接检测底物或其
类似物与酶形成的中间复合物（包括酶
和底物）的相对位臵。
2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为
1)非专一性化学修饰
用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。
若某基团被修饰后：
酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团
酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团
Trp
吲哚基
N-溴代琥珀酰亚胺
但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活，
（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分
子侧链上特定的功能基团发生化学反应。
•侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。
主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。
•侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基 酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。
•酶的化学修饰（chemical modification）： 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价 结构发生改变。 •酶选择性化学修饰：
描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
二、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（70年代末之后）
二、活性中心的共性
(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 (2)活性部位是一个三维实体。 (3)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (4)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水 作用等次级键结合。
酶化学修饰
b 酶共价连接于载体上的固定化，原则上 可以增加酶分子的构象稳定性，防止酶构 象伸展而失活。但酶与载体的连接点必须 达到一定数目，才能使酶构象坚固稳定。
c 固定化能改变酶对底物的亲和力。如果载 体和底物带相反电荷的话，米氏常数（Km） 将降低；带相同电荷时， Km将增加。
一、化学修饰在酶的结构与功能 研究中的应用
3. 测定酶分子中某种氨基酸的数量 当需要测定某一种氨基酸的数量时，就
可以定量的化学修饰方法，如用三硝基 苯磺酸测定氨基。
二、化学修饰酶在医学和 生物技术中的应用
作为生物催化剂的酶存在的问题： 酶是生物催化剂，它具有底物专一性强、
催化效率高和反应条件温和等显著特点， 但是与化学催化剂相比较,又有很多缺点
酶化学修饰
酶的表面化学修饰
大分子修饰 小分子修饰 交联修饰 固定化修饰
分子内部修饰 结合定点突变的化学修饰
1 酶的表面化学修饰
（1）大分子修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖
苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的 表面，形成一层覆盖层。要根据酶分子的 结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大 分子。
第三章 酶蛋白的化学 修饰
第六节 酶化学修饰的应用
酶分子修饰的目的：
研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金 属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响
提高酶的活力 增强酶的稳定性 降低或消除酶的抗原性
酶化学修饰的应用
化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 化学修饰酶在医学和生物技术中的应用 蛋白质化学修饰的局限性
肽链延伸后的修饰
用脲、盐酸胍或其他办法处理酶，使肽 链延伸，对内部疏水基团就行修饰，修饰 后重新折叠成具有催化活力构象。
酶分子化学修饰(1)
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（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰） 1 概念 •定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链 上特定的功能基团发生化学反应。 •侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有： 氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 •侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链 易被修饰，它们一般具有亲核性。
（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶
分子共价结合。
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3. 应用： 如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）
PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如：用Dextran 右旋糖酐 修饰-淀粉酶，－淀粉酶，胰 蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。
为修饰剂）。
（与前面化学蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中 的一种：
1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化 部位，酶活力提高。 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行， 称肽链有限水解。
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但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子 内部的必需基团，不易被修饰。
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（三）交联修饰（交联法） 用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同
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化学修饰可以提高酶的活力，稳定性和改变其最适温度，pH等，并具有快速廉价等优点，使酶在工业上的应用具有了广阔的前景，为提高生产效益提供了条件。同时，化学修饰改善和提高了酶和多肽药物在临床应用中的一些不良性质，弥补了天然酶的一些不足，并赋予了一些优良性质，从而显示了其良好的应用前景。大量的究结果表明，只要选择合适的修饰剂，利用化学修饰法可快速、廉价地提高酶的稳定性，甚至合成出新功的酶，酶的化学修饰具有广阔的发展前景。
2.2 对酶分子的特异位点进行选择性修饰
在已知酶的结构与功能的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或氨基酸残基，使酶产生新的性状，改造酶的底物特异性、催化特性以及热稳定性，通常通过基因重组和定点突变进行。Shaffer等通过定点突变使酪氨酸转氨酶的底物特异性发生变化，对Asp的亲和性(kcat /KM) 比Phe 高9倍。然而，应用基因重组和定点突变技术的修饰由于只能用天然氨基酸进行取代，且研究时间较长，投入成本较高。将定点突变和化学修饰进行结合，可以得到一种全新的化学修饰突变酶。用这种技术得到的化学修饰突变枯草杆菌蛋白酶，其催化性质、底物特异性和热稳定性都较天然酶有明显的提高。
[8]Rodrigues RC, Berenguer‐Murcia Á, Fernandez‐Lafuente R. Coupling chemical modification and immobilization to improvethe catalytic performance of enzymes[J]. Advanced Synthesis & Catalysis. 2011,353(13):2216-38.
3.3酶结构与功能的研究
化学修饰在研究酶的结构与功能方面的应用最多，研究也比较细, 是最简便的一种方法。特别是蛋白质的可逆化学修饰，在这方面能提供大量的信息。如定点修饰亲和修饰来研究酶的活性部位。化学修饰也常用于氨基酸顺序分析中。由于胰酶对精氨酸和赖氨酸具有高度特异性，故常用此酶水解蛋白质，以制备肽碎片，为防止精氨酸和赖氨酸相互干扰的问题，可利用选择性化学修饰剂修饰赖氨酸和精氨酸，使水解局限在其中一个残基的肽键上。
尽管基因改造已经大体上替代了化学修饰酶的方法，但化学修饰依然是一种提高蛋白质稳定性的有效方法。虽然基因操作技术有了巨大的成功，酶的化学修饰依然有一些明显的优势，比如化学修饰可以将各种各样的化学基团引入酶蛋白的结构中，不需要对蛋白的结构有清楚地了解，相对于基因操作更短的时间需要，及在酶蛋白正确折叠中的作用[4]。
3.酶化学修饰的应用
3.1工业上的应用
De溶解性提高，在三氯乙烷中其酶活是天然酶200倍；在水溶液中其酶活是天然酶的15-20倍，而且MPEG修饰的酶比PEG修饰的酶活力更高[13]。Forde等将来自嗜热毁丝霉菌和毛栓菌的漆酶利用双官能团试剂（乙烯乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯（EGNHS）、戊二醛和单官能柠康酸酐）进行化学修饰，对热稳定性和活性进行评估，用EGNHS修饰的由嗜热毁丝霉菌产的漆酶热稳定性增加8.7倍，用戊二醛修饰的由嗜热毁丝霉菌产的漆酶热稳定性增5.7倍，，用柠康酸酐修饰的由嗜热毁丝霉菌产的漆酶活性增加3倍[14, 15]。
酶分子化学修饰研究
摘要：酶是高效的生物催化剂, 在工业和临床医药上有着广泛的应用。但由于酶是蛋白质, 稳定性差,受外界条件的影响大,因而严重制约了其应用。而通过化学手段在分子水平上对酶进行改造，可有效地改善酶的性质，为酶广泛的应用提供更广泛的前景。综述酶分子的化学修饰方法和酶化学修饰领域的主要应用，以及其最新进展。
2，酶化学修饰的方法
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构的改变和对其侧链基团的改变。前者是分子生物学层次上的修饰，即在己知酶的结构与功能关系的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状，又称理性分子设计。理性分子设计主要应用于改造酶的底物特异性、催化特性及热稳定性等。然而，由于对酶的结构、功能和作用机制没有完全了解，而且仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸取代的标准, 加上氨基酸取代后有可能导致酶构象的改变，所以，并非所有的理性分子设计都能取得预期的效果，这就严重制约了理性分子设计的应用[8]。
酶化学修饰的目的在于人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。通常，酶经过改造后，会产生各种各样的变化包括提高生物活性，增强在不良环境中的稳定性，针对异体反应，降低生物识别能力。可以说，酶化学修饰在理论上为生物大分子结构与功能关系的研究提供了实验依据和证明，是改善酶学性质和提高其应用价值的一种非常有效的措施[6, 7]。
关键词：酶；化学修饰；应用
Study onchemical modification of enzyme
Abstract:Enzymes areefficientbiocatalysts and is widely used in industry and clinical medicine.But because the enzymesthat are proteins has poor stability and wasaffected by external conditions, which restricts its application.Themethod of chemical modificationthatmodifiedenzymeat the molecular levelcan effectively improve the properties of the enzyme andprovide a broader prospect for application of enzyme widely. The main application ofenzymein chemical modification and chemical modification of enzyme in the field, and the latest progress.
1，酶化学修饰的简介
通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的“化学修饰”对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术，称为酶分子的化学修饰。自然界本身就存在着酶分子改造修饰过程，如酶源激活、可逆共价调节等，这是自然界赋予酶分子的特异功能，提高酶活力的措施[5]。从广义上说，凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的转变都可看作是酶的化学修饰。从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控制的方式使一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变[6]。
[9]张永帅,李元召,孙俊良.酶修饰研究进展[J].食品工业科技. 2014,35(2):350-3.
利用大分子或小分子修饰剂对酶分子的侧链进行改造，以获得具有工业应用价值的酶蛋白，是目前应用最广泛的酶化学修饰技术。例如2000 年,G′omez等利用果胶修饰酵母蔗糖酶，修饰酶的热稳定性和pH 稳定性得到显著提高，经过修饰后，蔗糖酶在65℃的半衰期5min延长2d，而在pH2.0和pH12.0的环境中，修饰酶的相对比活力分别比天然酶高27%和33%[9]。事实说明，利用化学修饰可快速，廉价地改变酶的特性，为开阔酶的应用前景提供了可能性[10]。
Key words:Enzyme; chemical modification; application
酶是生物催化剂，它具有底物专一性强、催化效率高和反应条件温和等显著特点[1]。在所有生物生命活动的物质代谢中, 各种生物化学反应都是在酶的催化作用下高效有序地进行。作为生物催化剂，酶虽然有许多优点，但是与化学催化剂相比较，又有很多缺点。比如对反应条件具有严格的要求, 一般要求温和的反应条件，如适宜的温度和pH值等，这就大大限制了酶在工业、农业生产中的应用[2]。如医用酶就有稳定性差、分子量过大、成本高、来源有限、有异体反应等缺点，这也使得酶的应用受到很大限制。这促使科研工作者须不断地开展新的研究，发现新的酶或者利用新方法来改变或提高酶的原有性质，以满足各种反应条件对酶的需求，克服天然酶的缺陷。酶的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，即利用化学手段将大分子或某些功能基团连接到酶分子上，改变酶的理化性质，最终达到改变酶的催化性质的目的[1, 3]。
[5]伍志权,黄卓烈,金昂丹.酶分子化学修饰研究进展[J].生物技术通讯. 2007,18(5):869-71.
[6]黎春怡,黄卓烈.化学修饰法在酶分子改造中的应用[J].生物技术通报. 2011(09):39-43.
[7]韩鸿鹏,张丽琴,郝青梅,杨雪,付瑞敏.放线菌产纤维素酶的化学修饰[J].安徽农业科学. 2012,40(4):2298-300.
大分子修饰: 大分子化合物通常用来对酶蛋白进行表面修饰，从而降低酶的免疫原性和增加酶的热稳定性。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)被广泛用于蛋白质化学修饰以降低被修饰蛋白质的抗原性。目前用于酶表面修饰PEG多为单甲氧基聚乙二醇(mPEG），分子量一般在500-20 000[11]。在降低修饰酶抗原性方面，大分子mPEG的修饰剂优于小分子的，分子量越大效果越好，其中以mPEG-5 000( n=150)修饰效果最好，在保持酶活性方面，小分子活化mPEG优于大分子[12]。
参考文献
[1]翁樑,王志武,刘嵬.酶化学修饰的研究进展[J].成都大学学报:自然科学版. 2003,22(2):10-4.
[2]陈惠,刘彩云,陈伟.酶的人工修饰[J].中国食品添加剂. 2008(4):94-7.
[3]DeSantis G, Jones JB. Chemical modification of enzymes for enhanced functionality[J]. Curr Opin Biotechnol. 1999,10(4):324-30.
在工业领域，酶修饰可以提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐性，改变酶底物的专一性和最适pH等酶学性质，甚至可产生新的催化功能，使酶在工业上的应用更加适应人们的要求。