酶的化学修饰
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[5]伍志权,黄卓烈,金昂丹.酶分子化学修饰研究进展[J].生物技术通讯. 2007,18(5):869-71.
[6]黎春怡,黄卓烈.化学修饰法在酶分子改造中的应用[J].生物技术通报ຫໍສະໝຸດ Baidu 2011(09):39-43.
[7]韩鸿鹏,张丽琴,郝青梅,杨雪,付瑞敏.放线菌产纤维素酶的化学修饰[J].安徽农业科学. 2012,40(4):2298-300.
[9]张永帅,李元召,孙俊良.酶修饰研究进展[J].食品工业科技. 2014,35(2):350-3.
Key words:Enzyme; chemical modification; application
酶是生物催化剂，它具有底物专一性强、催化效率高和反应条件温和等显著特点[1]。在所有生物生命活动的物质代谢中, 各种生物化学反应都是在酶的催化作用下高效有序地进行。作为生物催化剂，酶虽然有许多优点，但是与化学催化剂相比较，又有很多缺点。比如对反应条件具有严格的要求, 一般要求温和的反应条件，如适宜的温度和pH值等，这就大大限制了酶在工业、农业生产中的应用[2]。如医用酶就有稳定性差、分子量过大、成本高、来源有限、有异体反应等缺点，这也使得酶的应用受到很大限制。这促使科研工作者须不断地开展新的研究，发现新的酶或者利用新方法来改变或提高酶的原有性质，以满足各种反应条件对酶的需求，克服天然酶的缺陷。酶的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，即利用化学手段将大分子或某些功能基团连接到酶分子上，改变酶的理化性质，最终达到改变酶的催化性质的目的[1, 3]。
酶化学修饰的目的在于人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。通常，酶经过改造后，会产生各种各样的变化包括提高生物活性，增强在不良环境中的稳定性，针对异体反应，降低生物识别能力。可以说，酶化学修饰在理论上为生物大分子结构与功能关系的研究提供了实验依据和证明，是改善酶学性质和提高其应用价值的一种非常有效的措施[6, 7]。
尽管基因改造已经大体上替代了化学修饰酶的方法，但化学修饰依然是一种提高蛋白质稳定性的有效方法。虽然基因操作技术有了巨大的成功，酶的化学修饰依然有一些明显的优势，比如化学修饰可以将各种各样的化学基团引入酶蛋白的结构中，不需要对蛋白的结构有清楚地了解，相对于基因操作更短的时间需要，及在酶蛋白正确折叠中的作用[4]。
4 展望
化学修饰可以提高酶的活力，稳定性和改变其最适温度，pH等，并具有快速廉价等优点，使酶在工业上的应用具有了广阔的前景，为提高生产效益提供了条件。同时，化学修饰改善和提高了酶和多肽药物在临床应用中的一些不良性质，弥补了天然酶的一些不足，并赋予了一些优良性质，从而显示了其良好的应用前景。大量的究结果表明，只要选择合适的修饰剂，利用化学修饰法可快速、廉价地提高酶的稳定性，甚至合成出新功的酶，酶的化学修饰具有广阔的发展前景。
3.酶化学修饰的应用
3.1工业上的应用
Dene等用MPEG修饰的过氧化氢酶在有机溶剂中的溶解性提高，在三氯乙烷中其酶活是天然酶200倍；在水溶液中其酶活是天然酶的15-20倍，而且MPEG修饰的酶比PEG修饰的酶活力更高[13]。Forde等将来自嗜热毁丝霉菌和毛栓菌的漆酶利用双官能团试剂（乙烯乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯（EGNHS）、戊二醛和单官能柠康酸酐）进行化学修饰，对热稳定性和活性进行评估，用EGNHS修饰的由嗜热毁丝霉菌产的漆酶热稳定性增加8.7倍，用戊二醛修饰的由嗜热毁丝霉菌产的漆酶热稳定性增5.7倍，，用柠康酸酐修饰的由嗜热毁丝霉菌产的漆酶活性增加3倍[14, 15]。
[4]Cowan DA, Fernandez-Lafuente R. Enhancing the functional properties of thermophilic enzymes by chemical modification and immobilization[J]. Enzyme and microbial technology. 2011,49(4):326-46.
3.3酶结构与功能的研究
化学修饰在研究酶的结构与功能方面的应用最多，研究也比较细, 是最简便的一种方法。特别是蛋白质的可逆化学修饰，在这方面能提供大量的信息。如定点修饰亲和修饰来研究酶的活性部位。化学修饰也常用于氨基酸顺序分析中。由于胰酶对精氨酸和赖氨酸具有高度特异性，故常用此酶水解蛋白质，以制备肽碎片，为防止精氨酸和赖氨酸相互干扰的问题，可利用选择性化学修饰剂修饰赖氨酸和精氨酸，使水解局限在其中一个残基的肽键上。
2.1酶分子表面的非选择性修饰
利用大分子或小分子修饰剂对酶分子表面进行共价修饰从而改变酶的功能和活性，以获得具有临床和工业应用价值的酶蛋白，是目前应用最广泛的酶化学修饰技术。小分子修饰: 酶表面的烃基、酚基和琉基等官能团，可与小分子化合物如氨基葡萄糖、乙酸酐等发生烷基化、酞化和醚化等反应，从而达到改善酶的分散性、提高酶活性、使酶产生新的理化性能和新功能等目的。Distel等用癸酰氯对碱性蛋白酶Proleather进行修饰，使其在氯仿中的溶解度高44 mg/mL，修饰酶在不同有机溶剂中活性提高4-22倍。
2，酶化学修饰的方法
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构的改变和对其侧链基团的改变。前者是分子生物学层次上的修饰，即在己知酶的结构与功能关系的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状，又称理性分子设计。理性分子设计主要应用于改造酶的底物特异性、催化特性及热稳定性等。然而，由于对酶的结构、功能和作用机制没有完全了解，而且仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸取代的标准, 加上氨基酸取代后有可能导致酶构象的改变，所以，并非所有的理性分子设计都能取得预期的效果，这就严重制约了理性分子设计的应用[8]。
[8]Rodrigues RC, Berenguer‐Murcia Á, Fernandez‐Lafuente R. Coupling chemical modification and immobilization to improvethe catalytic performance of enzymes[J]. Advanced Synthesis & Catalysis. 2011,353(13):2216-38.
关键词：酶；化学修饰；应用
Study onchemical modification of enzyme
Abstract:Enzymes areefficientbiocatalysts and is widely used in industry and clinical medicine.But because the enzymesthat are proteins has poor stability and wasaffected by external conditions, which restricts its application.Themethod of chemical modificationthatmodifiedenzymeat the molecular levelcan effectively improve the properties of the enzyme andprovide a broader prospect for application of enzyme widely. The main application ofenzymein chemical modification and chemical modification of enzyme in the field, and the latest progress.
参考文献
[1]翁樑,王志武,刘嵬.酶化学修饰的研究进展[J].成都大学学报:自然科学版. 2003,22(2):10-4.
[2]陈惠,刘彩云,陈伟.酶的人工修饰[J].中国食品添加剂. 2008(4):94-7.
[3]DeSantis G, Jones JB. Chemical modification of enzymes for enhanced functionality[J]. Curr Opin Biotechnol. 1999,10(4):324-30.
1，酶化学修饰的简介
通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的“化学修饰”对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术，称为酶分子的化学修饰。自然界本身就存在着酶分子改造修饰过程，如酶源激活、可逆共价调节等，这是自然界赋予酶分子的特异功能，提高酶活力的措施[5]。从广义上说，凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的转变都可看作是酶的化学修饰。从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控制的方式使一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变[6]。
大分子修饰: 大分子化合物通常用来对酶蛋白进行表面修饰，从而降低酶的免疫原性和增加酶的热稳定性。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)被广泛用于蛋白质化学修饰以降低被修饰蛋白质的抗原性。目前用于酶表面修饰PEG多为单甲氧基聚乙二醇(mPEG），分子量一般在500-20 000[11]。在降低修饰酶抗原性方面，大分子mPEG的修饰剂优于小分子的，分子量越大效果越好，其中以mPEG-5 000( n=150)修饰效果最好，在保持酶活性方面，小分子活化mPEG优于大分子[12]。
利用大分子或小分子修饰剂对酶分子的侧链进行改造，以获得具有工业应用价值的酶蛋白，是目前应用最广泛的酶化学修饰技术。例如2000 年,G′omez等利用果胶修饰酵母蔗糖酶，修饰酶的热稳定性和pH 稳定性得到显著提高，经过修饰后，蔗糖酶在65℃的半衰期5min延长2d，而在pH2.0和pH12.0的环境中，修饰酶的相对比活力分别比天然酶高27%和33%[9]。事实说明，利用化学修饰可快速，廉价地改变酶的特性，为开阔酶的应用前景提供了可能性[10]。
在工业领域，酶修饰可以提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐性，改变酶底物的专一性和最适pH等酶学性质，甚至可产生新的催化功能，使酶在工业上的应用更加适应人们的要求。
3.2在医药上的应用
通过酶修饰可以降低或者消除酶的抗原性，提高酶的稳定性，提高酶使用范围和应用价值的。Moderato等综述了PEG或活化的PEG修饰的蛋白在医学上的应用，其中包括抗癌药物（如天东酰氨酶、白介-2、抗生素、克隆刺激因子、肿瘤坏死因子、色氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、苯丙氨酸氨解酶），治疗遗传缺陷用酶（如腺甘脱氨酶、胆红素氧化酶、嘌呤核苷磷酸化酶等），抗炎症药（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶），抗血栓蛋白（如链激酶、水蛭素、脲激酶、纤溶酶原激活剂等）等多种医学用酶的化学修饰。
酶分子化学修饰研究
摘要：酶是高效的生物催化剂, 在工业和临床医药上有着广泛的应用。但由于酶是蛋白质, 稳定性差,受外界条件的影响大,因而严重制约了其应用。而通过化学手段在分子水平上对酶进行改造，可有效地改善酶的性质，为酶广泛的应用提供更广泛的前景。综述酶分子的化学修饰方法和酶化学修饰领域的主要应用，以及其最新进展。
2.2 对酶分子的特异位点进行选择性修饰
在已知酶的结构与功能的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或氨基酸残基，使酶产生新的性状，改造酶的底物特异性、催化特性以及热稳定性，通常通过基因重组和定点突变进行。Shaffer等通过定点突变使酪氨酸转氨酶的底物特异性发生变化，对Asp的亲和性(kcat /KM) 比Phe 高9倍。然而，应用基因重组和定点突变技术的修饰由于只能用天然氨基酸进行取代，且研究时间较长，投入成本较高。将定点突变和化学修饰进行结合，可以得到一种全新的化学修饰突变酶。用这种技术得到的化学修饰突变枯草杆菌蛋白酶，其催化性质、底物特异性和热稳定性都较天然酶有明显的提高。
[6]黎春怡,黄卓烈.化学修饰法在酶分子改造中的应用[J].生物技术通报ຫໍສະໝຸດ Baidu 2011(09):39-43.
[7]韩鸿鹏,张丽琴,郝青梅,杨雪,付瑞敏.放线菌产纤维素酶的化学修饰[J].安徽农业科学. 2012,40(4):2298-300.
[9]张永帅,李元召,孙俊良.酶修饰研究进展[J].食品工业科技. 2014,35(2):350-3.
Key words:Enzyme; chemical modification; application
酶是生物催化剂，它具有底物专一性强、催化效率高和反应条件温和等显著特点[1]。在所有生物生命活动的物质代谢中, 各种生物化学反应都是在酶的催化作用下高效有序地进行。作为生物催化剂，酶虽然有许多优点，但是与化学催化剂相比较，又有很多缺点。比如对反应条件具有严格的要求, 一般要求温和的反应条件，如适宜的温度和pH值等，这就大大限制了酶在工业、农业生产中的应用[2]。如医用酶就有稳定性差、分子量过大、成本高、来源有限、有异体反应等缺点，这也使得酶的应用受到很大限制。这促使科研工作者须不断地开展新的研究，发现新的酶或者利用新方法来改变或提高酶的原有性质，以满足各种反应条件对酶的需求，克服天然酶的缺陷。酶的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，即利用化学手段将大分子或某些功能基团连接到酶分子上，改变酶的理化性质，最终达到改变酶的催化性质的目的[1, 3]。
酶化学修饰的目的在于人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。通常，酶经过改造后，会产生各种各样的变化包括提高生物活性，增强在不良环境中的稳定性，针对异体反应，降低生物识别能力。可以说，酶化学修饰在理论上为生物大分子结构与功能关系的研究提供了实验依据和证明，是改善酶学性质和提高其应用价值的一种非常有效的措施[6, 7]。
尽管基因改造已经大体上替代了化学修饰酶的方法，但化学修饰依然是一种提高蛋白质稳定性的有效方法。虽然基因操作技术有了巨大的成功，酶的化学修饰依然有一些明显的优势，比如化学修饰可以将各种各样的化学基团引入酶蛋白的结构中，不需要对蛋白的结构有清楚地了解，相对于基因操作更短的时间需要，及在酶蛋白正确折叠中的作用[4]。
4 展望
化学修饰可以提高酶的活力，稳定性和改变其最适温度，pH等，并具有快速廉价等优点，使酶在工业上的应用具有了广阔的前景，为提高生产效益提供了条件。同时，化学修饰改善和提高了酶和多肽药物在临床应用中的一些不良性质，弥补了天然酶的一些不足，并赋予了一些优良性质，从而显示了其良好的应用前景。大量的究结果表明，只要选择合适的修饰剂，利用化学修饰法可快速、廉价地提高酶的稳定性，甚至合成出新功的酶，酶的化学修饰具有广阔的发展前景。
3.酶化学修饰的应用
3.1工业上的应用
Dene等用MPEG修饰的过氧化氢酶在有机溶剂中的溶解性提高，在三氯乙烷中其酶活是天然酶200倍；在水溶液中其酶活是天然酶的15-20倍，而且MPEG修饰的酶比PEG修饰的酶活力更高[13]。Forde等将来自嗜热毁丝霉菌和毛栓菌的漆酶利用双官能团试剂（乙烯乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯（EGNHS）、戊二醛和单官能柠康酸酐）进行化学修饰，对热稳定性和活性进行评估，用EGNHS修饰的由嗜热毁丝霉菌产的漆酶热稳定性增加8.7倍，用戊二醛修饰的由嗜热毁丝霉菌产的漆酶热稳定性增5.7倍，，用柠康酸酐修饰的由嗜热毁丝霉菌产的漆酶活性增加3倍[14, 15]。
[4]Cowan DA, Fernandez-Lafuente R. Enhancing the functional properties of thermophilic enzymes by chemical modification and immobilization[J]. Enzyme and microbial technology. 2011,49(4):326-46.
3.3酶结构与功能的研究
化学修饰在研究酶的结构与功能方面的应用最多，研究也比较细, 是最简便的一种方法。特别是蛋白质的可逆化学修饰，在这方面能提供大量的信息。如定点修饰亲和修饰来研究酶的活性部位。化学修饰也常用于氨基酸顺序分析中。由于胰酶对精氨酸和赖氨酸具有高度特异性，故常用此酶水解蛋白质，以制备肽碎片，为防止精氨酸和赖氨酸相互干扰的问题，可利用选择性化学修饰剂修饰赖氨酸和精氨酸，使水解局限在其中一个残基的肽键上。
2.1酶分子表面的非选择性修饰
利用大分子或小分子修饰剂对酶分子表面进行共价修饰从而改变酶的功能和活性，以获得具有临床和工业应用价值的酶蛋白，是目前应用最广泛的酶化学修饰技术。小分子修饰: 酶表面的烃基、酚基和琉基等官能团，可与小分子化合物如氨基葡萄糖、乙酸酐等发生烷基化、酞化和醚化等反应，从而达到改善酶的分散性、提高酶活性、使酶产生新的理化性能和新功能等目的。Distel等用癸酰氯对碱性蛋白酶Proleather进行修饰，使其在氯仿中的溶解度高44 mg/mL，修饰酶在不同有机溶剂中活性提高4-22倍。
2，酶化学修饰的方法
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构的改变和对其侧链基团的改变。前者是分子生物学层次上的修饰，即在己知酶的结构与功能关系的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状，又称理性分子设计。理性分子设计主要应用于改造酶的底物特异性、催化特性及热稳定性等。然而，由于对酶的结构、功能和作用机制没有完全了解，而且仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸取代的标准, 加上氨基酸取代后有可能导致酶构象的改变，所以，并非所有的理性分子设计都能取得预期的效果，这就严重制约了理性分子设计的应用[8]。
[8]Rodrigues RC, Berenguer‐Murcia Á, Fernandez‐Lafuente R. Coupling chemical modification and immobilization to improvethe catalytic performance of enzymes[J]. Advanced Synthesis & Catalysis. 2011,353(13):2216-38.
关键词：酶；化学修饰；应用
Study onchemical modification of enzyme
Abstract:Enzymes areefficientbiocatalysts and is widely used in industry and clinical medicine.But because the enzymesthat are proteins has poor stability and wasaffected by external conditions, which restricts its application.Themethod of chemical modificationthatmodifiedenzymeat the molecular levelcan effectively improve the properties of the enzyme andprovide a broader prospect for application of enzyme widely. The main application ofenzymein chemical modification and chemical modification of enzyme in the field, and the latest progress.
参考文献
[1]翁樑,王志武,刘嵬.酶化学修饰的研究进展[J].成都大学学报:自然科学版. 2003,22(2):10-4.
[2]陈惠,刘彩云,陈伟.酶的人工修饰[J].中国食品添加剂. 2008(4):94-7.
[3]DeSantis G, Jones JB. Chemical modification of enzymes for enhanced functionality[J]. Curr Opin Biotechnol. 1999,10(4):324-30.
1，酶化学修饰的简介
通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的“化学修饰”对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术，称为酶分子的化学修饰。自然界本身就存在着酶分子改造修饰过程，如酶源激活、可逆共价调节等，这是自然界赋予酶分子的特异功能，提高酶活力的措施[5]。从广义上说，凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的转变都可看作是酶的化学修饰。从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控制的方式使一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变[6]。
大分子修饰: 大分子化合物通常用来对酶蛋白进行表面修饰，从而降低酶的免疫原性和增加酶的热稳定性。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)被广泛用于蛋白质化学修饰以降低被修饰蛋白质的抗原性。目前用于酶表面修饰PEG多为单甲氧基聚乙二醇(mPEG），分子量一般在500-20 000[11]。在降低修饰酶抗原性方面，大分子mPEG的修饰剂优于小分子的，分子量越大效果越好，其中以mPEG-5 000( n=150)修饰效果最好，在保持酶活性方面，小分子活化mPEG优于大分子[12]。
利用大分子或小分子修饰剂对酶分子的侧链进行改造，以获得具有工业应用价值的酶蛋白，是目前应用最广泛的酶化学修饰技术。例如2000 年,G′omez等利用果胶修饰酵母蔗糖酶，修饰酶的热稳定性和pH 稳定性得到显著提高，经过修饰后，蔗糖酶在65℃的半衰期5min延长2d，而在pH2.0和pH12.0的环境中，修饰酶的相对比活力分别比天然酶高27%和33%[9]。事实说明，利用化学修饰可快速，廉价地改变酶的特性，为开阔酶的应用前景提供了可能性[10]。
在工业领域，酶修饰可以提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐性，改变酶底物的专一性和最适pH等酶学性质，甚至可产生新的催化功能，使酶在工业上的应用更加适应人们的要求。
3.2在医药上的应用
通过酶修饰可以降低或者消除酶的抗原性，提高酶的稳定性，提高酶使用范围和应用价值的。Moderato等综述了PEG或活化的PEG修饰的蛋白在医学上的应用，其中包括抗癌药物（如天东酰氨酶、白介-2、抗生素、克隆刺激因子、肿瘤坏死因子、色氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、苯丙氨酸氨解酶），治疗遗传缺陷用酶（如腺甘脱氨酶、胆红素氧化酶、嘌呤核苷磷酸化酶等），抗炎症药（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶），抗血栓蛋白（如链激酶、水蛭素、脲激酶、纤溶酶原激活剂等）等多种医学用酶的化学修饰。
酶分子化学修饰研究
摘要：酶是高效的生物催化剂, 在工业和临床医药上有着广泛的应用。但由于酶是蛋白质, 稳定性差,受外界条件的影响大,因而严重制约了其应用。而通过化学手段在分子水平上对酶进行改造，可有效地改善酶的性质，为酶广泛的应用提供更广泛的前景。综述酶分子的化学修饰方法和酶化学修饰领域的主要应用，以及其最新进展。
2.2 对酶分子的特异位点进行选择性修饰
在已知酶的结构与功能的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或氨基酸残基，使酶产生新的性状，改造酶的底物特异性、催化特性以及热稳定性，通常通过基因重组和定点突变进行。Shaffer等通过定点突变使酪氨酸转氨酶的底物特异性发生变化，对Asp的亲和性(kcat /KM) 比Phe 高9倍。然而，应用基因重组和定点突变技术的修饰由于只能用天然氨基酸进行取代，且研究时间较长，投入成本较高。将定点突变和化学修饰进行结合，可以得到一种全新的化学修饰突变酶。用这种技术得到的化学修饰突变枯草杆菌蛋白酶，其催化性质、底物特异性和热稳定性都较天然酶有明显的提高。