高纯度黑色素细胞培养方法的改进

收稿日期:2002-07-23;修回日期:2002-10-26

作者简介:刘源(1974-),男,山东济南人。博士生(导师:金岩),助教高纯度黑色素细胞培养方法的改进

刘　源,金　岩,王新文,赵　宇

(第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032)

[摘　要] 目的:探讨如何以简便快捷的方法获得大量生长状态良好的高纯度黑色素细胞。方法:以包皮组织作为细胞来源,用消化法获得表皮细胞悬液,用本实验室设计的方法对细胞进行纯化,然后用两种不同培养基M C1、M C2培养细胞,Dopa 染色和透射电镜鉴定细胞来源,通过M T T 和流式细胞仪分析观察细胞的生长状态。结果:用本实验室的纯化方法获得的黑色素细胞中未见角朊细胞和成纤维细胞污染,M T T 和流式细胞仪检测结果显示用M C2培养的黑色素细胞处于旺盛的增殖状态,明显高于M C1培养的黑色素细胞。结论:结果表明本实验方法可以获得大量处于良好生长状态的高纯度黑色素细胞。

[关键词]皮肤;黑色素细胞;培养

[中图号]R780.2 [文献标识码]A [文章编号]1005-2593(2003)01-0021-03

[牙体牙髓牙周病学杂志,2003,13(1):21]

Improvements in culturing skin melanocytes

LIU Yuan ,JIN Yan ,WANG Xin -wen ,et al

(College of S tomatology ,The Fourth Military Medical University ,X i ′an 710032,China )

[A bstract ] AIM :To develop a rapid and reproducible method for the isolation of pure melanocy tes in good condi -tions from foreskin .METH ODS :T he melanocytes were isolated and purified by a method employed in our lab .Two different media MC1and M C2were used to culture the cells .T he biological conditions of the cells were examined by M T T detection and flowcy tometry (FCM )analysis .RESULTS :T he melanocy tes obtained by this method were free of keratinocytes and fi -broblasts contamination .And the cells maintained in M C2showed better proliferation abil ity than those cultured in MC1.C ONC LUSION :The pure melanocytes in good conditions can be attained rapidly by our method .

[Key words ]skin ;melanocy te ;tissue culture

[Chinese Journal of Conservative Dentistry ,2003,13(1):21]

黑色素细胞(melanocy te ,M C )位于表皮的基

底层,与表皮细胞共同组成表皮黑素单位,其主要

功能是产生黑素小体保护皮肤免受损害[1]。关于

黑色素细胞培养技术的探讨最早始于1957年,迄

今为止已经建立了许多黑色素细胞的培养方

法[2-4]。但是如何在短时间内获得大量生长状态

良好的高纯度黑色素细胞一直是众多学者关注的

焦点。本实验拟在细胞的培养方法上做一定的改

进,从而以快捷的方法获得大量生长状态良好的高

纯度黑色素细胞。

1　材料和方法1.1　材料青少年包皮环切术后包皮组织;DM EM 培养基(低糖型,GIBCO ),F12培养基(GIBCO ),谷氨酰胺(GIBCO ),K -SFM 角朊细胞培养基(GIBCO ),胎牛血清(GIBCO ),胰酶(Sigma ),Dispase (Sigma ),TPA (Sig ma ),IBMX (Sigma ),霍乱毒素(Sigma )。1.2　方法1.2.1　培养液的配制M C1:参照司徒镇强等方法配制[5],DMEM 和F12各一份混合,加入100m L /L 胎牛血清,TPA

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21·牙体牙髓牙周病学杂志(Chin J Conserv Dent )2003,13(1)DOI :10.15956/j .cn ki .chin .j .conserv .dent .2003.01.011

85nmol/L,霍乱毒素2.5nmol/L,IBMX0.1 nmol/L,谷氨酰胺6nmol/L。

M C2:本实验室设计配制,以K-SFM为基础培养基,加入TPA10ng/mL,50mL/L胎牛血清。

1.2.2　黑色素细胞的分离纯化

①取新生儿或青少年包皮环切术后包皮组织,处理前在750m L/L乙醇中浸泡1min;将包皮组织转入培养皿中,用加入抗生素的PBS清洗,用眼科剪和眼科镊去除皮下组织,将组织分切为2mm ×10mm,用1.2U/m L的Dispase4℃消化过夜。

②将表皮与真皮分离,收集表皮,2.5g/L胰酶消化10min,反复吹打以获得单细胞悬液,将细胞分为两份,用含100mL/L血清的DMEM培养基接种细胞,在37℃孵箱中放置1h,倾弃上清,加入角朊细胞培养液K-SFM培养3d,以抑制成纤维细胞的生长,然后将培养液分别更换为黑色素细胞培养液MC1和MC2,继续培养7d即可获得纯净的黑色素细胞。

③原代细胞长满70%～80%时,用2.5g/L 胰酶消化传代。

1.2.3　黑色素细胞的鉴定

取第三代细胞做Dopa染色、透射电镜观察,同时结合细胞形态鉴定细胞来源。

1.2.4　M TT检测

取第四代细胞,以4×103/m2的密度接种于96孔板。培养3d后,每孔加入M TT(5g·L-1) 20μL,继续培养4h,吸弃上清,加入150μL DMSO振荡15min,用酶联免疫检测仪测定490nm 的A值。组间进行统计学分析。

1.2.5　流式细胞仪分析

取第四代细胞5×106,800r/min,离心5min,弃上清,用PBS洗两次,700m L/L乙醇固定,4℃过夜。上机前离心去除乙醇,PBS洗两次,加入PI (溴化丙锭)染液1mL,4℃闭光染色30min,上机检测分析。组间进行统计学分析。

2　结果

2.1　黑色素细胞的生长和鉴定

细胞接种4h后,即可见细胞贴壁伸展,第二天细胞呈典型的树突状,随培养时间的延长突起更加明显。原代细胞培养10d后即可传代,此时细胞密集,形态呈长梭型,类似雪旺氏细胞,未见角朊细胞和成纤维细胞污染(图1,见彩插);Dopa染色可见细胞浆内阳性着色(黑色或灰色颗粒)(图2,见彩插),苏木精衬染未见阴性细胞;透射电镜显示细胞浆内有黑色素颗粒(图3,见彩插),此外在M C2组细胞中可见核分裂(图4,见彩插),显示细胞增殖旺盛,而在M C1组细胞中未见核分裂。

2.2　M T T检测

如表1所示,MC2组细胞活力高于M C1组。组间比较有统计学差异,P<0.05。

表1　M T T检测结果

组别n A值

M C1100.412±0.022

M C2100.604±0.024

2.3　流式细胞仪分析结果

结果(表2)与M TT检测相符合,M C2组细胞增殖能力明显高于MC1组。

表2　流式细胞仪分析结果

组别G1S G2M

PrI(S+

G2M) M C180.811.87.4

M C270.717.411.9

3　讨论

黑素的合成代谢被认为与皮肤色素沉着病、恶性黑色素瘤和Parkinson′s病等密切相关[6]。而黑色素细胞的培养在研究正常及病变组织中黑素合成代谢的作用具有重要意义。虽然黑色素细胞的培养可以追溯到50年代,但是直到80年代才真正建立了可靠的黑色素细胞培养方法[7]。由于黑色素细胞仅占表皮细胞数量的3～7%,因此,如何在培养过程中去除角朊细胞是黑色素细胞培养的重点。采用既能促进黑色素细胞生长又能抑制角朊细胞的TPA (12-o-tetradecanoyl phorbol-13-ac etate)和霍乱毒素基本上解决了上述问题[8]。为了促进细胞增殖,大多数黑色素细胞培养液中都加入了一定量的血清,所以即使在培养过程中混入了极少量的成纤维细胞也会导致培养的失败。而即使是最有经验的细胞培养者也很难保证无成纤维细胞的混杂[9]。一旦发生了成纤维细胞的混杂,大多数学者采用加入G418等有丝分裂细胞抑制剂的方法以去除成纤维细胞[10]。此外也有学者用降低钙离子浓度或机械刮除等方法,但是大多数方法在抑制成纤维细胞的同时也影响了黑色素细胞的生长。

本实验室在前期培养角朊细胞的时候发现,黑