gfp基因的克隆与表达
gfp融合基因 -回复
gfp融合基因-回复GFP融合基因，全名绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein），是一项重要的生物技术进展，被广泛应用于生物体的研究中。
本文将一步一步回答关于GFP融合基因的问题，以帮助读者更好地了解该技术。
第一步：什么是GFP融合基因？GFP融合基因是将GFP基因与其他目标基因融合在一起的技术。
通过此技术，将GFP蛋白与目标蛋白合并在一起，使得目标蛋白在生物体内可被荧光显色。
第二步：GFP融合基因的原理是什么？在GFP融合基因技术中，GFP基因会被克隆到目标基因的编码区域之后，它们会共享同一段编码序列。
这意味着目标蛋白在翻译时，GFP蛋白也会一同合成，从而实现目标蛋白与GFP蛋白的融合。
第三步：为什么要使用GFP融合基因？GFP融合基因技术是一种非常有用的工具，可在活体中实时监测与目标蛋白相关的生物过程。
通过融合GFP蛋白，研究者可以追踪目标蛋白的位置、表达模式以及运动轨迹。
这有助于研究者更好地理解目标蛋白的功能和相关的生物过程。
第四步：如何构建GFP融合基因？构建GFP融合基因的第一步是通过PCR扩增GFP基因和目标基因的DNA片段。
之后，将这些片段进行连接并进行测序确认。
完成测序确认后，将GFP融合基因克隆到表达载体中。
然后，将表达载体转染至目标细胞中，让目标细胞表达融合蛋白。
第五步：GFP融合基因在研究中的应用领域有哪些？GFP融合基因技术广泛应用于多个研究领域。
在细胞生物学中，研究者可以通过此技术追踪细胞器和蛋白在细胞内的分布情况。
在生物医学研究中，可以利用GFP融合基因研究某些疾病的发生机制。
此外，还可用于研究生物体的发育过程、基因表达模式以及细胞信号传导通路等。
第六步：GFP融合基因的优点和局限性是什么？GFP融合基因的优点是可以实时地监测目标蛋白的表达和定位，无需使用很多其他的检测方法。
此外，GFP融合基因遗传稳定，不会对目标蛋白的功能产生明显影响。
然而，GFP融合基因也存在一些局限性。
细胞示踪技术与应用(GFP)
降低成本与普及推广
降低成本
通过规模化生产和优化生产过程，降低绿色荧光蛋白的 生产成本，使其更容易被广大科研人员所接受和使用。
普及推广
加强绿色荧光蛋白技术的宣传和培训，提高科研人员对 其的认识和应用能力，促进其在生物学、医学和生物工 程领域更广泛的应用和推广。
07 结论
GFP技术在细胞示踪中的优势与局限性
细胞示踪技术与应用（GFP）
目录
• 引言 • 细胞示踪技术概述 • GFP技术原理与特性 • GFP技术在生物学研究中的应用 • GFP技术在医学研究中的应用 • GFP技术的挑战与未来发展 • 结论
01 引言
目的和背景
细胞示踪技术是一种用于追踪和观察 细胞生长、分裂、迁移等行为的方法 ，对于研究细胞生物学和疾病机制具 有重要意义。
发光机制
在蓝色光激发下，GFP分子中的生色团（由6个疏水性的色氨酸残基组成）吸收 能量后，从基态跃迁至激发态，随后通过能量传递回到基态，释放出绿色荧光。
GFP的荧光特性与稳定性
荧光特性
GFP发出的荧光呈鲜艳的绿色，且不受其他荧光物质干扰， 易于与其他荧光标记物区分。
稳定性
在大多数细胞内环境中，GFP荧光相当稳定，不易淬灭，可 长时间保持亮度。
1994年
该实验室的另一位科学家发现，通过将GFP与其他蛋白质 结合，可以实现对特定蛋白质的荧光标记，从而开启了细 胞示踪技术的新篇章。
2000年以后
随着其对细胞生长、分裂等行为的影响，进一步加深 了对细胞生物学和疾病机制的理解。
02 细胞示踪技术概述
用于追踪药物在体内的分 布、代谢和排泄过程，评 估药物的疗效和安全性。
用于研究干细胞分化和再 生过程，为组织工程和再 生医学提供技术支持。
南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白EGFP的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。
本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。
关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆实验日期2015- ~2015-实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性切酶进行DNA酶切的原理和方法。
2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。
4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。
5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。
7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300r pm,1min瞬时离心悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min13000rpm,1min13000rpm,2min13000rpm,1min2)PCR扩增目的基因GFP取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：O 6μlH2质粒DNA（pEGFP-N1）2μl引物GFP1 (10μM) 1μl引物GFP2 (10μM) 1μlPremix Taq 10μl总体积20μl加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。
gfp融合基因 -回复
gfp融合基因-回复什么是gfp融合基因？GFP融合基因是一种用于研究和观察生物体中特定蛋白质的表达和定位的工具。
GFP（Green Fluorescent Protein）是一种由Aequorea victoria 这种海葵类动物产生的一种蛋白质。
GFP可以发出绿色荧光，因此被广泛用于生物学研究。
融合基因是指将GFP基因与目标基因连接在一起，通过表达目标基因在生物体内产生荧光。
GFP融合基因的制备过程：1. 目标基因选择：选择需要研究的目标基因，并确定其DNA序列。
2. 基因克隆：将目标基因的DNA序列扩增得到目标基因的适用载体。
可采用PCR技术或其他克隆方法，将目标基因片段插入含有GFP基因的载体中。
3. 转染：将融合基因载体导入到感兴趣的细胞或生物体中。
可以使用多种方法进行转染，如基因枪法、细胞器方法或病毒载体介导的转染。
4. GFP蛋白的表达：当融合基因载体成功导入细胞后，融合基因将会被细胞内的转录和翻译机制读取并表达为蛋白质。
由于GFP基因和目标基因连接在一起，GFP蛋白会与目标蛋白结合并被产生出来。
5. GFP蛋白的荧光观察：由于GFP蛋白本身具有荧光性质，它会发出绿色荧光。
通过使用荧光显微镜等技术，可以直接观察和检测到目标蛋白的位置和表达情况。
GFP融合基因的应用：1. 蛋白质定位研究：通过将GFP与目标蛋白融合，可以实时观察目标蛋白在细胞或生物体中的定位和追踪。
这对于研究蛋白质在生物体中的功能和相互作用起着重要作用。
2. 基因表达研究：GFP融合基因可以用来研究基因的表达模式和调控机制。
通过观察和分析GFP蛋白的表达情况，可以了解目标基因的表达时间、空间和水平。
3. 细胞追踪和标记：通过将GFP融合基因导入细胞中，可以标记和追踪具有特定功能的细胞。
这对于研究细胞迁移、增殖和分化等生物学过程非常重要。
4. 转基因生物的制备：GFP融合基因可以用于制备转基因生物，使其表达GFP蛋白并发出绿色荧光。
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达
实验用品
PEGFP -N3模板、菌株E. coli DH5 α、E. coli BL21 、质粒 pET28a 、 限制性内切酶 EcoRⅠ、 Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、1 kb DNA ladder
DNA 凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、 PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出 粉、琼脂粉等。
转化 筛选及复筛及酶切验证
PCR检测 IPTG诱导表达
SDS-PAGE检测目的蛋白
包涵体检测 分离纯化
电泳检测 酶切
pET28a质粒酶切位点选择
实验用品及方法介绍
方法介绍
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌 体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导 表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆
目
1 实验背景
2 实验用品及方法介绍
录
3 实验流程
4 实验原理
5 具体实验步骤
6 实验结果预测
7 参考文献
实验背景
200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由 日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学 家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方 面取得了突出成就。
目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）。 EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光 强度比GFP大6倍以上。
所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞 分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等
绿色荧光蛋白GFP基因的克隆表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言 (3)2 实验目的 (5)3 实验设备 (5)4 材料及试剂 (6)5 实验操作步骤 (6)5.1操作流程 (6)5.2质粒DNA的分离与纯化 (7)5.2.1 质粒的培养 (7)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (7)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (8)5.3酶切及连接 (9)5.3.1 双酶切 (9)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (10)5.3.3 连接 (11)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (11)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (11)5.4.2．感受态细胞的制备(CaCl2法) (11)5.4.3 转化涂板 (12)5.5GFP蛋白的诱导表达 (13)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (13)参考文献 (14)附录 (15)1LB培养基的配制： (15)2.溶液Ⅰ (15)3.溶液Ⅱ (15)4.溶液Ⅲ（100ML） (15)5.DN ASE-FREE RN ASE A (15)6.TE缓冲液（P H8.0） (15)7.20×TBE (16)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (16)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (16)10．P ET-28A质粒全图谱 (17)1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达
/view/992207.ht m /view/2261117.h tm 郝福英 周先碗 朱玉贤 主编《基础分子生物 学实验》 北京大学出版社 2010年11月第 一版
实验仪器 实验材料 实验试剂
将pET-28a-GFP重组质粒转化入表达菌株 · 制备BL21（DE3）菌株的感受态细胞
10uL BL21（DE3）菌液接入3mL LB液体培养基，摇床培养过夜
二次活化：1:50比例接入新的试管摇床培养2h
1.5mL冰上10min
4 度，4000r/min离心2min收集细胞
涂平板： a）分别取50、100、150uL加入重组质粒的感 受态细胞悬液涂布于含抗生素的平板 b）抗生素板+IPTG+100uL重组质粒的感受态 细胞悬液 c）对照组感受态细胞100uL+抗生素平板 d）正面向上放置片刻，后37度倒置培养20h
重组阳性克隆菌接至3mL LB（Kan）液体培养基中，37度 培养16h 过夜菌1:50比例接种至4支试管中（每支试管含3mL LB(Kan)），扩大培养2h，测量A600值为0.5，停止 分别使用IPTG（最后总浓度为1mmol/L）诱导 0,2,4h 离心并照相
丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸 生色基团 蛋白质折叠，生色基团得以“亲密接触”, 经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此 时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的 条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋 白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形 式。
蓝光、绿光与黄光 基因克隆 变体
分子标记 药物筛选 融合抗体 生物传感器 信号传导
标记！
真核细胞表达载体，pEGFP-N3载体上携带 有EGFP蛋白表达基因 很强的复制能力 高效的功能强大的启动子SV40和PCMV 多克隆位点 具有neo基因，可以采用G418来筛选已成 功转染了该载体的靶细胞
水稻遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果，通过构建基因表达载体，将目的基因导入水稻细胞中，从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料：水稻品种为南桂占，农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105，目的基因（GFP基因）载体为pBI121。
2. 试剂：农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆：将GFP基因从质粒载体pBI121中切出，插入到农杆菌载体pBin19中，构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化：将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中，在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合，用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上，28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒：将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染：将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上，用无菌滤纸轻轻擦拭叶片，使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导：将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中，28℃条件下培养5-7天，诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选：将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中，28℃条件下培养3-4周，筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生：将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中，28℃条件下培养2-3周，诱导再生植株。
9. 抗性鉴定：将再生植株种植于田间，对植株进行潮霉素筛选，筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测：对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测，验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆：成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化：农杆菌转化效率较高，大部分叶片出现愈伤组织。
GFP实验报告
绿色荧光蛋白的克隆摘要：目的：研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。
方法：分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒，将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化，用抗生素抗性筛选后，通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白 DNA重组The cloning of green fluorescent proteinAbstract：Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid.Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子。
发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。
1996 年 GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 .实验一质粒DNA 的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。
该法用于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。
二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。
迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到200kb 。
质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
在大多数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制10-200 个拷贝。
当宿主细胞的蛋白时所用的酶是相同的。
有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。
gfp 实验步骤
gfp 实验步骤GFP实验步骤GFP（绿色荧光蛋白）是一种广泛应用于生物学研究中的荧光标记物质，它可以通过荧光显微镜观察到其在细胞或组织中的分布情况。
下面将介绍GFP实验的步骤。
1. GFP基因的克隆需要将GFP基因克隆到感兴趣的载体中。
通常，可以使用限制性内切酶对GFP基因和载体进行酶切，并通过连接酶将两者连接在一起。
连接后的重组载体可以通过大肠杆菌的转化来复制。
2. 细胞培养接下来，将含有重组载体的大肠杆菌进行培养，以扩增GFP基因。
培养条件要求适当的温度和培养基。
当细菌生长到一定程度时，可以进行提取。
3. GFP的纯化提取细菌后，需要进行GFP的纯化。
纯化步骤可以使用亲和层析、离心、电泳等方法。
通过这些步骤，可以得到高纯度的GFP。
4. GFP的表达将纯化后的GFP溶液加入到感兴趣的细胞中，使其表达GFP。
可以通过转染、转化等方法将GFP引入到细胞中。
在细胞培养的过程中，可以观察到GFP表达的情况。
5. 荧光显微镜观察使用荧光显微镜观察GFP在细胞中的分布情况。
荧光显微镜可以通过激发光源激发GFP发出的绿色荧光，并通过镜头观察到荧光现象。
可以通过调节显微镜的对焦、放大倍数等参数来观察GFP的细节。
6. 数据分析观察到GFP的荧光后，可以进行数据分析。
可以计算GFP的表达量、观察GFP在细胞中的定位、动力学等。
通过数据分析，可以得到关于GFP在细胞中的信息。
7. 应用GFP广泛应用于生物学研究中。
例如，在细胞生物学中，可以利用GFP标记蛋白质、细胞器等，观察它们在细胞中的动态变化；在遗传学研究中，可以利用GFP标记基因，观察其在不同组织中的表达情况。
总结：GFP实验的步骤包括GFP基因的克隆、细胞培养、GFP的纯化、GFP的表达、荧光显微镜观察、数据分析和应用。
通过这些步骤，可以获得GFP在生物体内的相关信息，为生物学研究提供重要的实验手段。
GFP作为一种荧光标记物质，在生物学研究中具有广泛的应用前景。
绿色荧光蛋白(EGFP)克隆并在大肠杆菌表达
绿色荧光蛋白（EGFP）克隆并在大肠杆菌表达详细项目实施计划书生物技术1001班①EGFP基因完整的序列: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTA AACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAG TTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTG CAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGC TACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTC GAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTG GGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGC ATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAG CAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCC CTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATC ACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTA②PCR引物引物序列（5’-3’）酶切位点描述Pl GAC GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGABamHI5’GFP geneP2GCC GAATTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATG EcoR I 3’GFP gene实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达综述
分子生物学综合实验论文题目: 绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达中国·黄石2010年12月绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达胡丽丹（湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石 43500）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过Bam H I和Not I双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。
取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。
重组有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1 μL/mL 的卡纳霉素的LB培养基上培养。
当A600达到0.7时，用终浓度为0.8 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。
关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆荧光蛋白水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight, College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,hasbeen found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28αwas harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with Bam H I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28α-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(Bam H I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21the competent cells. E. coLi BL-21containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 μL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key words:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin目录1.前言： (1)1.1绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP） (1)1.1.1 GFP研究背景 (1)1.1.2 GFP研究应用 (2)1.2基因的克隆与表达 (3)2.实验试剂及实验仪器： (5)2.1实验试剂与材料： (6)2.2实验仪器： (7)3.实验方法 (7)3.1质粒提取方法: (7)3.2琼脂糖凝胶电泳及回收: (9)3.3酶切及连接： (11)3.4E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入： (12)3.5酶切验证重组质粒： (13)3.6GFP基因的表达 (14)3.6.1活化菌种 (14)3.6.2扩大培养 (14)3.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达 (14)4.结果与分析 (14)4.1质粒提取过程中现象与结果： (14)4.2琼脂糖凝胶电泳 (15)4.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入结果： (16)4.4酶切验证重组质粒 (16)4.5GFP基因的表达结果： (17)5.讨论： (18)5.1提取质粒出现图六的原因是： (18)5.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因： (18)5.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入出现图九、十原因: .. 19 5.4酶切验证重组质粒出现图十一原因： (19)5.5GFP基因的表达结果如图十二、十三原因： (19)6.参考文献 (20)前言：1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）1.1.1 GFP 研究背景绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
gfp的应用原理及步骤
GFP的应用原理及步骤1. GFP概述GFP（Green Fluorescent Protein）是一种来源于海洋水母的蛋白质，具有绿色荧光。
它在生物科学研究中被广泛应用，特别是在生物标记、基因表达、蛋白定位等方面。
本文将介绍GFP的应用原理及相关步骤。
2. GFP的应用原理GFP的应用原理基于其自身的荧光特性。
GFP蛋白质在受到紫外线（或蓝光）激发后，能够发出绿色荧光。
这种荧光不需要外部辅助物质激发，因此是一种非侵入性标记技术。
应用GFP进行标记的细胞或生物体，可以通过观察其发出的绿色荧光来确定其位置和活动状态。
3. GFP的应用步骤使用GFP进行生物标记需要经过一系列步骤，下面将详细介绍：3.1. 克隆GFP基因首先，需要从源细胞中提取GFP基因，然后经过PCR扩增和限制性内切酶酶切等操作，将GFP基因克隆至目标表达载体中。
常用的载体包括pUC19、pEGFP-N1等。
3.2. 转染目标细胞将目标表达载体与目标细胞进行转染，使GFP基因能够被目标细胞表达和产生。
转染的方法包括化学法、电穿孔法、病毒转染法等，具体选择根据细胞类型和实验要求决定。
3.3. GFP蛋白质的表达和折叠转染后，目标细胞会开始表达GFP基因，合成GFP蛋白质。
然而，GFP蛋白质在合成后需要正确折叠才能发出荧光。
因此，细胞内的折叠机制起着重要作用。
确保细胞内适宜的温度、氧气含量、蛋白质合成及折叠的机制，可以提高GFP蛋白质的表达和荧光强度。
3.4. GFP荧光观察将转染后的目标细胞置于荧光显微镜下观察其产生的荧光信号。
GFP蛋白质通过自身荧光特性发出绿色荧光，在合适的荧光显微镜条件下，可以清晰观察到目标细胞或组织的位置和分布情况。
3.5. GFP信号采集和分析利用荧光显微镜或其他相关仪器对GFP产生的荧光信号进行采集和分析。
可以使用图像处理软件对采集到的荧光图像进行处理和分析，例如测量荧光强度、定位细胞或蛋白等。
3.6. GFP应用领域举例目前，GFP在生物科学的研究中应用广泛，包括下述几个领域： - 基因表达研究：通过将GFP与感兴趣的基因进行融合，可以研究基因在细胞中的表达模式及调控机制。
基因克隆和表达的实验设计
基因克隆和表达的实验设计实验目的研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
实验方法；通过分别将0M-5a（pEGFP-N3）和0M-5a（pET-28a）提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入0M-5a感受态细胞中进行转化，通过限制性核酸内切酶Not l与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后，通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体Bl-2/内进行表达，再用IPTG诱导GFP 基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。
材料与方法：实验材料克隆菌0W-5a、表达菌6l-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H1、Not I仪器设备Eppendof 离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管。
实验原理生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或类核中。
DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DWA制品的污染常影响到以后的DWA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。
苯酚、氟仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。
经苯酚、氟仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。
DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase 去除RNA污染。
实验步骤1、100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。
2、加TE悬浮沉淀，并加10%S0S，50ul20mg/ml（或1mg干粉）蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时。
gfp mcherry 流程
gfp mcherry 流程
GFP（绿色荧光蛋白）和mCherry（红色荧光蛋白）是两种广泛应用于生物学研究的荧光标记蛋白。
以下是使用GFP和mCherry进行荧光标记的一般流程：
1. 获得GFP和mCherry基因：可以通过购买或从其他实验室获取这两种蛋白的基因。
2. 克隆GFP和mCherry基因：将GFP和mCherry基因插入到适当的表达载体中，例如质粒或病毒载体。
3. 转染细胞：将表达GFP和mCherry的载体转染到目标细胞中。
转染方法可以是化学转染、电转染或病毒转染等。
4. 选择稳定表达细胞系：在转染后，使用适当的选择剂筛选和培养稳定表达GFP和mCherry的细胞系。
5. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜检查细胞是否成功表达GFP和mCherry。
GFP通常在蓝光激发下发出绿色荧光，而mCherry在红光激发下发出红色荧光。
6. 其他应用：根据实验需要，可以对GFP和mCherry标记的细胞进行进一步的研究和分析，如荧光激活细胞分选、共定位研究等。
需要注意的是，具体的实验流程可能会因研究目的、细胞类型和实验条件等因素而有所不同。
因此，在进行实验前最好参考相关文献
或咨询经验丰富的研究人员。
gfp融合基因 -回复
gfp融合基因-回复什么是gfp融合基因？GFP融合基因是一种常用的研究生物学领域的技术手段，它能够将报告基因gfp（绿色荧光蛋白）与感兴趣的基因相连，从而使得该基因在生物体内表达时可以产生绿色荧光。
这种技术的应用广泛，可以用于研究基因的转录、翻译和定位等。
下面将对gfp融合基因的制备和应用过程进行详细解析。
一、gfp融合基因构建1. 选择合适的载体：在构建gfp融合基因时，首先需要选择一个合适的载体，通常可以选择常用的质粒载体，如pEGFP-C1或pEGFP-N1等。
这些载体具有高效的转染和表达能力，适用于多种生物体系。
2. 制备模板：接下来，需要制备感兴趣的基因的DNA模板。
可以通过PCR扩增、酶切片段或合成DNA片段的方式获得。
3. 进行连接：将gfp和基因片段按照设计的连接方式进行连接。
一般情况下，可以利用同源重组或PCR扩增的方法进行连接。
连接时需要注意选择正确的连接位点，避免破坏gfp和基因的功能。
4. 进行双酶切：将连接产物进行双酶切，以验证连接是否成功。
双酶切时需要选择合适的限制酶，将连接产物切割为预期大小的特异性片段。
5. 克隆验证：将切割后的连接产物进行电泳分析，验证连接的正确性。
当连接成功时，连接产物将会产生与预期大小相符的片段。
6. 测序验证：为了进一步确认gfp融合基因的正确性，可以将连接产物进行测序验证。
通过测序，可以得到gfp和基因的序列信息，确保其与设计一致。
二、gfp融合基因的应用1. 转染：将gfp融合基因导入到感兴趣的生物体系中，通常采用转染的方式。
可以选择适合该生物体系的转染方法，如病毒转染、化学转染或电穿孔等。
2. 表达检测：通过检测绿色荧光的表达情况，可以判断gfp融合基因是否被成功表达。
可以通过荧光显微镜观察，或者进行流式细胞仪等技术的检测。
3. 研究基因功能：通过诱导gfp融合基因的表达，可以研究其在生物体内的功能。
例如，可以观察该基因的转录和翻译过程，或者通过定位研究其在细胞中的分布情况。
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基因工程实验设计题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达专业：生工1001 姓名：刘会淼2013年3月13实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
实验方法; 通过分别将DH-5α(pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。
1.材料与方法：1.1.1 实验材料克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H1、Not Ⅰ1.1.2 仪器设备Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管1.1.3 试剂及溶液分装后于121 ℃高压灭菌20 min。
（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）；溶液Ⅰ50 mL葡萄糖50 mmol/LTris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/LEDTA (pH 8.0) 10 mmol/L121℃高压灭菌15 min后置于0~4℃贮存；溶液Ⅱ100 mLNaOH 0.2 mol/LSDS 1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；溶液Ⅲ100 mLKOAc (5 mol/L) 60 mL冰乙酸11.5 mLH2O 28.5 mL121 ℃高压灭菌15 min后置于0~4 ℃贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲。
灭菌的0.1 mol/L CaCl2，标准相对分子质量的DNA；溴乙锭（EB）储存液0.5 µg/mL；LB/Kan （50 µg/mL）固体培养基；IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 ℃保存备用；卡那霉素（Kan）配成浓度为100 ug/mL水溶液，-20 ℃保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4 ℃；无水乙醇：放在0~4 ℃；RNase 母液：将RNase 溶于10 mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl 配成的试剂中，配成10 mg/mL的溶液，在100 ℃加热15 min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20 ℃；1.2方法：1.2.1 大肠杆菌DH-5α (pEGFP-N3)染色体DNA的提取1.2.2、实验目的：掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。
1.2.3，器材：⑴，微量移液器、高速离心机、1.5mlＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml 管架、胶头滴管、冰箱⑵，消化缓冲液: CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml；其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。
1.2.4实验原理生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。
DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。
苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。
经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。
DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。
1.2.5、实验步骤1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。
2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。
3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。
5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。
7、加 1/10 体积3mol/L NaAc，及２.５倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀。
－２０℃沉淀３０min。
12000rpm15min，弃上清8、加70%乙醇1ml，轻轻混匀，12000rpm15min，弃上清。
9、ＥＰ管放置于烘箱中烘干。
10、加３０ul TE或ddH2O溶解ＤＮＡ。
11、琼脂糖凝胶电泳检测注意，实验室中一般用的1.5ml的EP管，可根据自己需要按比例调节加样量。
DH-5α(pET-28a)的载体质粒也可根据同样方法提取。
1.3.1ＰＣＲ扩增1.3.2实验目的１、学习ＰＣＲ扩增的基本原理。
２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作。
３、了解ＰＣＲ扩增的参数设计。
1.3.3实验原理１、聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。
２、ＰＣＲ反应体系引物、dNTP、Mg２＋、模板、Taq DNA聚合酶，Buffer。
３、ＰＣＲ循环参数①9５℃5min②9５℃30s③5２℃30s④72℃30s⑤goto②２９times⑥72℃10min1.3.4器材1，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统2，Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液3，引物：1.3.5实验步骤１、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。
dd water 10.5ul10×PCR buffer（不含MgCl2）3ul25mM MgCl2 2ul10mmol/L dNTP 1ul10μmol/L 引物1 1ul10μmol/L 引物2 1ul模板1ulTaq酶0.5ul总体积20ul２、在离心机中混匀。
３、ＥＰ管放入ＰＣＲ仪中，按照原理中的条件设置程序，进行ＰＣＲ反应。
４、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测1.4凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接1.4.1、实验目的1. 学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。
2. 掌握DNA体外连接的方法。
1.4.2，实验原理1，DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关：DNA分子大小DNA分子构象琼脂糖凝胶浓度电泳所用电压电泳缓冲液2. 利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。
3. Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3’端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。
1.4.3，仪器1，凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯，1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65℃水浴锅2，PCR产物，1×TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000 marker1.4.4，实验步骤1，2%琼脂糖凝胶电泳2，在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量3，加入5个凝胶体积量的DR-ⅠBuffer4，混匀65℃加热融化凝胶块5，加入DR-ⅠBuffer量的1/2 体积的DR-ⅡBuffer, 当目的片段小于400bp再加入终浓度为20% 的异丙醇6，将上述溶液short后转移至spin coloumn中12000rpm, 1min 弃滤液7，加入500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液8，加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液9，同810，将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测11，链接反应（冰上操作）在一支0.2 ml EP管中加入以下试剂：纯化的目的DNA片段 4.5ulVector 0.5ul连接液5ul混匀16℃连接过夜1.5 DH-5α和BL-21感受态细胞的制备1)将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。
2)将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。
3)取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min离心5 min。
弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。
冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。
4)弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。
1.6 感受态细胞的转化1) 取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。
2) 加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
3) 42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。
4) 加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。
5) 取200 μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿，37 ℃培养倒置12-16 h。
1.7碱法提质粒1) 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 ℃, 180 r/min 振荡培养过夜。