肝脏蛋白的提取和浓度测定.2013
肝糖原的提取、鉴定与定量-第七实验室
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级:组别:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称Folin—酚试剂法测定蛋白质含量实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。
需强调的地方请用蓝颜色标出。
不得出现多行、多页空白现象。
一、实验目的1、学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法；2、学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法;3、学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式；4、正确掌握使用离心机的方法步骤；5、熟练运用溶液混匀的各种方法；6、正确掌握溶液转移的操作；7、正确掌握使用分光光度计的方法步骤二、实验原理实验1肝糖原的提取与鉴定糖原是生物的主要储能物质之一,主要储存与肝细胞中，采用研磨匀浆等方法可以使肝细胞破碎。
肝细胞破碎，细胞内容物流出.低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶并且使蛋白质沉淀，糖原则能够稳定地保存在上清液中，从而达到分离糖原与蛋白质等其他成分的目的。
糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。
糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。
这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。
此外，糖原还可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。
糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后会出现砖红色沉淀。
CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2↓2Cu(OH）2 + C6H12O6 = 2CuOH +氧化型葡萄糖+ H2O2CuOH = H20 + Cu2O↓ （红色）Cu（OH)2 ==== H2O + CuO↓ （黑色）实验2肝糖原定量测定糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其他成分，保留肝糖原。
dna提取及测定实验报告
dna提取及测定实验报告DNA 提取及测定实验报告一、实验目的本次实验的主要目的是掌握从生物样本中提取 DNA 的方法，并对提取的 DNA 进行浓度和纯度的测定，以了解样本中 DNA 的质量和数量。
二、实验原理DNA 是遗传信息的携带者，存在于细胞核和线粒体等细胞器中。
在提取 DNA 的过程中，需要破碎细胞，使 DNA 释放出来，然后通过一系列的化学和物理方法去除蛋白质、RNA 等杂质，从而获得纯净的DNA 。
DNA 在 260nm 处有特征性的吸收峰，其吸收值与 DNA 的浓度成正比。
同时，通过测定 260nm 和 280nm 处的吸光度比值（A260/A280），可以评估 DNA 的纯度。
纯 DNA 的 A260/A280 比值约为 18。
三、实验材料和仪器1、实验材料新鲜的动物肝脏组织裂解液（包含 TrisHCl、EDTA、NaCl 等）蛋白酶 K无水乙醇氯仿：异戊醇（24:1）RNA 酶TE 缓冲液（TrisHCl、EDTA）2、实验仪器高速冷冻离心机移液器恒温水浴锅紫外分光光度计微量移液器离心管玻璃棒四、实验步骤1、样本处理称取约 05g 新鲜的动物肝脏组织，用剪刀剪碎后放入匀浆器中，加入适量的裂解液，充分匀浆。
2、消化蛋白质将匀浆液转移至离心管中，加入蛋白酶 K 至终浓度为100μg/ml，在 55℃水浴锅中孵育 1-2 小时，期间不时轻轻搅拌，以充分消化蛋白质。
3、去除蛋白质和 RNA加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），轻轻颠倒离心管充分混匀，然后在 4℃下以 12000rpm 离心 15 分钟。
吸取上清液至新的离心管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒离心管，可见白色的 DNA 沉淀出现。
4、洗涤 DNA将沉淀用 70%的乙醇洗涤 2 次，每次在 4℃下以 12000rpm 离心 5 分钟，去除上清液。
5、溶解 DNA待乙醇挥发干净后，加入适量的 TE 缓冲液溶解 DNA ，置于 4℃冰箱保存备用。
动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告
动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸DNA,为英文Deoxyribonucleic acid的缩写,又称去氧核糖核酸,是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分,同时也是组成基因的材料;有时也被称为“遗传微粒”,原因是在繁殖过程中,父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中,从而完成性状的传播;DNA是高分子聚合物,DNA溶液为高分子溶液,具有很高的粘度,可被甲基绿染成绿色;DNA对紫外线260nm有吸收作用,利用这一特性,可以对DNA进行含量测定;当核酸变性时,吸光度升高,称为增色效应；当变性核酸重新复性时,吸光度又会恢复到原来的水平;较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性,即DNA双链碱基间的氢键断裂,双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋;在细胞内,DNA能与蛋白质结合形成染色体,整组染色体则统称为染色体组;对于人类而言,正常的体细中含有46条染色体;染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制,细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA 合成后期;对于真核生物,如动物、植物及真菌而言,染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物,如细菌而言,则主要存在于细胞质中的拟核内;染色体上的染色质蛋白,如组织蛋白,能够将DNA进行组织并压缩,以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用,进而调节基因的转录;脱氧核糖核酸的结构DNA的结构： DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平;DNA是一种长链聚合物,组成单位为四种脱氧核苷酸,即腺嘌呤脱氧核苷酸dAMP脱氧腺苷、胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTMP 脱氧胸苷、胞嘧啶脱氧核苷酸dCMP 脱氧胞苷、鸟嘌呤脱氧核苷酸dGMP 脱氧鸟苷;而脱氧核糖五碳糖与磷酸分子借由酯键相连,组成其长链骨架,排列在外侧,四种碱基排列在内侧;每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连,这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列,可组成遗传密码,指导蛋白质的合成;读取密码的过程称为转录,是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA信使RNA的核酸分子;DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’, 5’-磷酸二酯键相连构成的长链;大多数DNA含有两条这样的长链,也有的DNA为单链,如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等;DNA有环形DNA和链状DNA之分;在某些类型的DNA中,5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶,其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富;在某些噬菌体中,5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶;40年代后期,查加夫发现不同物种DNA的碱基组成不同,但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数A=T,鸟嘌呤数等于胞嘧啶数G=C,因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和,一般用几个层次描绘DNA的结构;浓盐法从动物组织中提取DNA核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白DNP/RNP的形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在 M的盐溶液中溶解度很低,而RNP则可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来;将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出;肝脏细胞肝脏是由肝细胞组成,肝细胞极小,肉眼看不到,必须通过显微镜才能看到;人肝约有25亿个肝细胞,5000个肝细胞组成一个肝小叶,因此人肝的肝小叶总数约有50万个;肝细胞为多角形,直径约为20-30/加微米,有6-8个面,不同的生理条件下大小有差异,如饥饿时肝细胞体积变大;每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种;肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构:如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成;二、实验目的1.掌握浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术三、实验原理核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白DNP/RNP的形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在 M的盐溶液中溶解度很低,而RNP则可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来;将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出;四、实验器材和材料试剂实验器材：①匀浆器②量筒③离心机④离心管⑤试管⑥吸管⑦恒温水浴锅实验材料：①猪肝实验试剂：①L L 柠檬酸钠溶液②95%乙醇.③NaCl固体.④5%SDS溶液5g SDS 定容至100ml⑤V氯仿：V异戊醇20：1的混合液五、实验操作1.称量①称取一定质量的猪肝,加入2倍肝重的L L柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎已完成;2.提取DNA①量取肝糜4 ml 于10毫升离心管,在4000r/min下离心10min ,沉淀中再加入8 ml缓冲液于4000r/min离心5 min；②弃上清,取沉淀；③将沉淀用10 ml柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、加入5 ml 氯仿-异戊醇混合液、1 ml SDS,振荡30min保鲜膜封口；④缓慢加入固体NaCl约,使其最终浓度为1mol/L；⑤将溶液分装到2个10毫升离心管中,在4000r/min离心5 min,取上清水相；⑥在上述水相溶液中分别加等体积冷95%乙醇,边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动,将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇,即得DNA粗品；⑦用8ml蒸馏水溶解DNA粗品于10ml离心管中;3.标准曲线的绘制按下表加入各种试剂,混匀,于60℃恒温水浴锅45min,冷却后,在595nm波长下于分光光度计比色测定,以吸光度对DNA浓度作图,制作标准曲线;4.样品的测定将DNA粗品定容至25ml容量瓶,再取DNA样液,加入蒸馏水,混匀;然后准确加入二苯胺试剂,混匀,于60℃恒温水浴锅45min,冷却后,595nm波长下于分光光度计比色测定,根据所测的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量ug;5.计算100g猪肝中DNA含量w=m1/m2×100%w：DNA的质量分数%m1：样液中测得的DNA的质量ugm2：样液中所含样品的质量ug六、实验数据处理1.标准曲线2.实验结果处理猪肝质量为DNA提取液体积为根据公式w=m1/m2×100%得：w=％则100g猪肝中DNA含量为：w×100=七、思考题1.实验中的乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用答：①柠檬酸的钠盐在实验中既充当DNA酶的抑制剂,也是pH缓冲溶液；②SDS是表面活性剂,可以让蛋白质与DNA分开；③氯仿是有机溶剂,可以使蛋白质聚集沉淀,便于分离出去；④异戊醇是消泡剂,可以减少泡沫的发生；⑤氯仿-异戊醇的作用是使蛋白质变性、膜溶解；⑥NaCl固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液,在这样的环境中DNA核蛋白能溶解,RNA核蛋白则溶解度很低,可以利用这一性质分离两种核酸;八、实验注意事项主要集中在细胞核中,因此,通常选用细胞核含量比例大的生活组织作为提取制备DNA的材料,小牛胸腺组织中细胞核比例较大,因而DNA含量丰富,同时其脱氧核苷酸酶活性较低,制备过程中DNA被降解的可能性相对较低,所以是制备DNA的良好材料,但其来源较困难,脾脏或肝脏易获得,也是实验室制备DNA常用的材料,本实验用新鲜肝脏作为实验材料;2.为了防止大分子核酸在提取过程中被降解,须采取以下措施：整个过程必须在低温下进行,可加入某些物质抑制核酸酶的活性,如柠檬酸钠、EDTA、SDS等,EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制剂;3.从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多,经常采用的有：氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等,他们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚,并释放出核酸;4.使用离心机时,对称放置的离心管必须用天平调平衡;5.避免剧烈振荡,如研磨过程、搅拌过程等;九、实验结果误差分析及讨论经过对本次实验结果进行分析,得出100g猪肝中DNA含量大约为的结论,在上网查阅相关资料后发现：猪肝中DNA含量与本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合;由此可知,本次试验结果是相对比较成功的,较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量,并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术,基本达到了本次实验的目的;但是本次实验结果只是粗略测量,并未达到精确测量猪肝中DNA的含量,且实验数据较理论值偏低,这是由于某些误差导致,在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差,经分析得出以下几点：①在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中,由于猪肝组织表面较滑不易磨碎,且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残留,因此可能导致猪肝中DNA 提取不充分,致使实验数据较理论值偏低；②研磨过程中,可能由于操作不当,导致部分液体溅出,因此可能使得提取液中部分DNA损失,导致实验数据偏低；③在粗提取DNA操作中,频繁地将DNA提取液转移至各个仪器内,可能有极小部分DNA提取液未倒净,残留在仪器壁上损耗掉,导致实验误差；④在使用移液枪的过程中,可能因为操作不当或移液枪经常错误使用,出现仪器误差,导致吸取的DNA样液不精确,出现实验误差；⑤在水相中加入乙醇析出DNA时,不是所有DNA均析出,有小部分依旧融在溶液,导致提取出的DNA含量偏低；⑥标准曲线制作过程中出现些许误差；总的来讲,本次试验结果是相对比较成功的,较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量,并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术,基本达到了本次实验的目的;在今后的实验中会着重注意实验操作的严谨性,严格按照实验前拟定完全的实验步骤进行,保证将实验操作过程中可能出现的误差概率降到最低,尽可能达到预期的实验效果,完成自我的学习及锻炼过程;。
动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告
动物肝脏中DNA勺提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA为英文Deoxyribo nucleic acid的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。
有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA勺一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。
DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。
DNA寸紫外线（260nm有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。
当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。
较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开一也称为DNA 的解螺旋。
在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。
对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。
染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。
对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟核内。
染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。
脱氧核糖核酸的结构DNA勺结构：DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。
DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP脱氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP 脱氧鸟苷）。
而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。
每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。
肝组织蛋白提取[指南]
![肝组织蛋白提取[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/9ddc1fadbdeb19e8b8f67c1cfad6195f312be864.png)
肝组织蛋白提取[指南]1肝组织蛋白的提取准备物品:PBS (提前消毒，4?过夜备用)，平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP管(以上物品需高压消毒备用)，冰盒(所有操作均在冰上)1)取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状 2)加入组织裂解液约500μL(裂解液:PMSF=100:1)，冰上作用20~30min3)吸取组织液到已高压灭菌的Ep管中，4?离心，12000rpm×15min4) 取出EP管放在冰盒内,仔细吸取上清，取2μl的上清用于蛋白浓度的测定5)剩余上清，按蛋白:5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min6)瞬时离心，放入-20?冰箱冻存备用。
2蛋白浓度测定1)蛋白标准液(用BSA配制)25mg/ml储存液，稀释为0.5mg/ml，稀释步骤:例:10μL 25mg/ml的蛋白标准液，90μL PBS混合成2.5mg/ml蛋白标准液20μL 2.5mg/ml的蛋白标准液，80μL PBS混合成0.5mg/ml蛋白标准液2)需设置八个标准孔以绘出标准曲线，采用BCA试剂盒测出蛋白浓度，标准孔设置及所加试剂量如下:试剂添加量(μL)蛋白标准液(0.5mg/ml) 0 1 2 4 8 12 16 20PBS 20 19 18 16 12 8 4 03)配制BCA蛋白测定液，溶液A:溶液B=50:1先混合均匀，至完全互溶备用4)待测蛋白孔加:2μL蛋白液+18μL PBS，每孔的体积均为20μL5)每孔加180μL配好的BCA蛋白测定液，使每孔总体积均为200μL;6)室温避光放置两个小时或37?放置30min; 7)用酶标仪测出每孔的吸光度，(570nm)，测三次;。
肝组织蛋白提取
1肝组织蛋白的提取准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作均在冰上）1）取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状2）加入组织裂解液约500μL（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20~30min3）吸取组织液到已高压灭菌的Ep管中，4℃离心，12000rpm×15min 4）取出EP管放在冰盒内,仔细吸取上清，取2μl的上清用于蛋白浓度的测定5）剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min 6）瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。
2. RNA抽提1、取等量肝组织，液氮中磨碎；2、加入TRIZOL Reagent lml，室温孵育5min；3、 )b[I)k2001al氯仿剧烈振荡l 5sec，室温孵育2min；4、 4℃，12，000rpm，离心15min；5、吸取上层含有RNA的水相入新管，Dla入500rtl异丙醇沉淀RNA，室温孵育l 0min；6、 4℃，12，000rpm，离心l 5min；7、弃上清，加入lml 75％的乙醇洗涤RNA沉淀，4"C，75009，离一L,5min；8、干燥RNA，用20tal DEPC水溶解RNA；9、用紫外分光光度计测定RNA的含量，．20℃保存，准备做RT．PCR。
2蛋白浓度测定1）蛋白标准液（用BSA配制）25mg/ml储存液，稀释为0.5mg/ml，稀释步骤：例：10μL 25mg/ml的蛋白标准液＋90μL PBS混合成2.5mg/ml蛋白标准液20μL 2.5mg/ml的蛋白标准液＋80μL PBS混合成0.5mg/ml蛋白标准液2）需设置八个标准孔以绘出标准曲线，采用BCA试剂盒测出蛋白浓度，标准孔设置及所加试剂量如下：试剂添加量（μL）蛋白标准液3）配制BCA蛋白测定液，溶液A：溶液B=50：1先混合均匀，至完全互溶备用4）待测蛋白孔加：2μL蛋白液+18μL PBS，每孔的体积均为20μL5）每孔加180μL配好的BCA蛋白测定液，使每孔总体积均为200μL；6）室温避光放置两个小时或37℃放置30min；7）用酶标仪测出每孔的吸光度，（570nm），测三次；8）用excel工具根据标准孔的数据作散点图，并做出直线及公式。
细胞组织裂解(提蛋白)方法
第一种方法蛋白匀浆缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl5 mM EDTA1 % NP-40 1 mM PMSF操作步骤直接用这个进行组织匀浆然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。
我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。
将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。
上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。
70v浓缩，150v分离第二种方法裂解液配方：尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤：取300mg样品在液氮环境下研磨，加入1ml裂解液混匀，室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），15000g离心1小时，取上清测定蛋白质浓度。
在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。
建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。
IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？（可以的，最后上胶条的时候可以再加）不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。
裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。
用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好）第三种方法建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定-实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。
利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。
3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸1%BaCl溶液氨基黑染色液2漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液电泳仪、电泳槽实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）实验步骤：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。
小鼠肝脏提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 熟悉小鼠肝脏解剖方法。
2. 掌握小鼠肝脏提取和保存方法。
3. 学习组织样品的制备和储存技术。
二、实验原理肝脏是人体重要的代谢器官，具有合成、储存、解毒等多种功能。
本实验通过解剖小鼠，提取肝脏组织，旨在为后续的实验研究提供材料。
三、实验材料与仪器1. 实验动物：健康成年小鼠一只。
2. 仪器：解剖剪、解剖针、手术刀、剪刀、镊子、培养皿、酒精棉球、生理盐水、福尔马林固定液、冰盒、解剖显微镜等。
四、实验步骤1. 实验动物处死：用酒精棉球擦拭小鼠，使其昏迷，然后迅速用剪刀剪断小鼠颈部，使小鼠死亡。
2. 解剖：将小鼠放入解剖盘中，用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹腔。
3. 提取肝脏：用解剖剪剪开肝脏周围的结缔组织，用镊子将肝脏轻轻夹出，放入培养皿中。
4. 清洗：用生理盐水冲洗肝脏表面，去除杂质。
5. 固定：将肝脏放入装有福尔马林固定液的培养皿中，浸泡固定。
6. 保存：将固定好的肝脏取出，放入装有酒精的容器中，密封保存。
五、实验结果与分析1. 成功解剖小鼠并提取肝脏组织。
2. 肝脏表面有明显的红褐色，质地柔软，易于夹取。
3. 肝脏表面无明显杂质，清洗过程中保持肝脏组织完整。
六、实验讨论1. 实验过程中，解剖操作要轻柔，避免损伤肝脏组织。
2. 肝脏固定过程中，福尔马林固定液浓度不宜过高，以免影响后续实验结果。
3. 实验动物处死过程中，要确保小鼠死亡，避免实验过程中出现意外。
七、实验结论本实验成功解剖小鼠并提取肝脏组织，为后续实验研究提供了可靠的组织样品。
在实验过程中，掌握了组织样品的制备和储存技术，为今后相关实验奠定了基础。
八、实验改进1. 在解剖过程中，可使用解剖显微镜观察肝脏结构，提高解剖效率。
2. 在肝脏固定过程中，可选用其他固定液，如4%多聚甲醛，以提高固定效果。
3. 在实验动物选择上，可根据实验需求，选用不同品种、年龄的小鼠。
第2篇一、实验目的1. 学习小鼠肝脏的解剖方法。
2. 掌握肝脏细胞的提取方法。
动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告
动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸〔DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写〕，又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。
有时也被称为“遗传微粒〞，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一局部复制传递到子代中，从而完成性状的传播。
DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。
DNA对紫外线〔260nm〕有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进展含量测定。
当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。
较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋构造解开—也称为DNA的解螺旋。
在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体那么统称为染色体组。
对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。
染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。
对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，那么主要存在于细胞质中的拟核内。
染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进展组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进展交互作用，进而调节基因的转录。
脱氧核糖核酸的构造DNA的构造：DNA的构造一般可划分为一级构造、二级构造、三级构造和四级构造四个水平。
DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸〔dAMP 脱氧腺苷〕、胸腺嘧啶脱氧核苷酸〔dTMP 脱氧胸苷〕、胞嘧啶脱氧核苷酸〔dCMP 脱氧胞苷〕、鸟嘌呤脱氧核苷酸〔dGMP 脱氧鸟苷〕。
而脱氧核糖〔五碳糖〕与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。
每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。
生化实验4动物肝脏DNA的提取和鉴定
▪ 1、核酸的理化性质
▪ RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结 晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。 除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核 苷酸大都呈酸味。
▪ DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物， 一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机 溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水， RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA 在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸 性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或 弱碱性溶液中较稳定。
酸钠混合盐）
（2） 提取液（ SDS 2mMOL/L溶液） （3）氯仿：辛醇溶液 （4）无水乙醇（置冰箱中冷却） （5）H2SO4溶液 （6）二苯胺溶液溶液 （7）NAOH溶液 （8）AgNO3溶液 (9)钼酸胺－溶液 （10）Vc---氯化亚锡溶液
三．操作步骤
取鸡肝2.5克，用剪刀剪碎，置乳钵（或 匀浆器）中研磨5分钟，加匀浆液5ml，进一 步研碎，倾入离心管离心（3500r.p.m ╳10 ),弃上清（RNP部分），
实验五
动物肝脏DNA的提取和鉴定
(教材1A在细胞内多以核蛋白体形 式存在---DNP 、 RNP．
分离提取核酸时首先要破碎细胞去除蛋 白质和其他物资, 用0.14mol/L Nacl(含柠 檬酸钠)匀浆液溶解细胞中的RNA及其他物资, 离心，去上清,然后加入提取液（十二烷基硫 酸钠，SDS）溶液溶解DNA，然后加入氯仿 -辛醇，以去除其余核蛋白和杂蛋白．再离心 除去沉淀(杂蛋白)部分,收集上清部分(DNA).
▪ RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在 0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，
▪ 常用此法分离这两种核蛋白。
将提取得到的DNA放在滤纸上,将液体吸干,将 其置于试管内,加入3毫升硫酸进行酸水解，进而分 三份，分别对其脱氧核糖、嘌呤碱、及磷酸进行 鉴定。
蛋白质浓度测定、Km测定、DNA提取PPT教学课件
2020/12/09
1
1、0.1g 细胞→ 2ml epp，混匀。
2、＋700μl bufferA，65℃，10m’，中间混匀一次
3、＋苯酚350μl，＋氯仿350μl，混匀5m，12000rpm，5m’
4、上清500μl 至1.5ml epp，＋500μl（等体积）氯仿，
混匀5m’，12000rpm，10m’
2020/12/09
13
DNS-aa的聚酰胺薄膜层析
2020/12/09
14
一、实验原理：
荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨（DNS-Cl）,能与氨基酸的N末 端结合生成荧光物质DNS-aa，DNS-Cl也可与多肽或蛋白 质的游离氨基结合，生成DNS-Pr或DNS-肽，经酸水解后 释放出DNS-aa，各种DNS-aa在聚酰胺薄膜的分配系数不 一样，DNS-aa在360或280nm紫外光下发黄色荧光。
0
0
0
[Pr](μg/mL)
CBBG-250（mL）
5.0
A595nm
（2）以A595nm-[Pr]作标准曲线，求待测蛋白浓度
2020/12/09
8
比较三种方法的优缺点！
2020/12/09
9
蔗糖酶km值的测定
2020/12/09
10
一、实验目的：
掌握蔗糖酶km测定的实验方法。 二、实验原理：
管号
1
2
3
456Fra bibliotekBSA（mL） 0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0
D.W(mL) 4.0 3.5 3.0 2.0 1.0
0
[Pr](mg/mL)
A280nm
（2）以A280nm-[Pr]作标准曲线，求待测蛋白浓度
考马斯亮蓝法测肝脏蛋白质含量
实验设计优势：
（1）试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，耗时短。
（2）取材方便，用量少，节约原料，经济环保。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
样品蛋白质含量（微克/克鲜肝脏）=A .提取液总体积/测定取样体积/样品重
A为标准曲线上差得的蛋白质含量
五、可行性分析：
考马斯亮蓝法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种目前灵敏度最高且最常用的微量蛋白质快速测定方法。
2、样品提取液中蛋白质含量的测定：
动物肝脏中DNA的提取检测实验报告
动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。
有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。
DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。
DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。
当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。
较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。
在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。
对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。
染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。
对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟核内。
染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。
脱氧核糖核酸的结构DNA的结构：DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。
DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP 脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP 脱氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP 脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP 脱氧鸟苷）。
而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。
每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。
动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告
动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸〔DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写〕，又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。
有时也被称为“遗传微粒〞，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一局部复制传递到子代中，从而完成性状的传播。
DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。
DNA对紫外线〔260nm〕有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。
当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。
较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。
在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体那么统称为染色体组。
对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。
染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。
对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，那么主要存在于细胞质中的拟核内。
染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。
脱氧核糖核酸的结构DNA的结构：DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。
DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸〔dAMP 脱氧腺苷〕、胸腺嘧啶脱氧核苷酸〔dTMP 脱氧胸苷〕、胞嘧啶脱氧核苷酸〔dCMP 脱氧胞苷〕、鸟嘌呤脱氧核苷酸〔dGMP 脱氧鸟苷〕。
而脱氧核糖〔五碳糖〕与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。
每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。
实验五.大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定1 实验目的学会大鼠肝S9的制备及其蛋白含量的测定。
2 实验材料与方法2.1实验动物大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周龄，150g左右2.2试剂1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、多氯联苯、β-萘黄酮Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约800ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml2.3器材低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等2.4 实验操作2.4.1试剂的配制（1）Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml（2）考马斯亮兰G-250染料：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1升，滤纸过滤。
2.4.2肝S9的制备（1）诱导苯巴比妥钠80mg/kg，腹腔注射，连续3～5d，最后一次给药后24h后采样。
（2）采样采样前禁食24h，但可以自由饮水；断头处死；无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。
（3）肝匀浆的制备弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 Tris-HCl缓冲液溶液3mL/g （肝湿重），转入冰浴，用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器匀浆。
（4）制备S9 将肝匀浆于低温高速离心机0～4℃ 000g 离心 10min上清液即为S9。
（5）分装保存将制备好的S9于无菌冷冻管或安瓿中保存，每个安瓿2mL左右。
于液氮速冻后置-80℃低温保存。
深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。
2.5蛋白含量测定（考马斯亮兰染色法）2.5.1测定原理考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm 变为595nm ，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。
肝脏蛋白的提取和浓度测定.2013
1.肝脏组织的提取 （3）冰上放置：
裂解完全后，冰 上放置30分钟
1.肝脏组织的提取 （4）4度离心：
放入离心机中， 4℃ 12000rpm离心 5min
1.肝脏组织的提取 （5）吸取上清：
取上清分装于 0.2ml离心管中并置 于－20℃保存，待 用
超声匀浆 要保持低温
注意 事项
超声强度 以不产生泡沫 为准
以标准液的蛋白质浓度为横坐标，吸光度值
为纵坐标绘制标准曲线。
A（吸光度）OD
Ax
cx
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/mL
16 C（蛋白浓度）
实验内容
◆肾脏蛋白的提取 ◆蛋白的浓度测定
认真操作--仔细观察--用心分析--完成报告
18
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法
BCA法
紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年 由 Bradford 建 立 的 考 马 斯 亮 兰 法 （ Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。 考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种
肝脏蛋白的提取 和浓度测定
医学基础实验室
了解并掌握 蛋白质的提 取方法
了解掌握考 马斯亮蓝法 （Braford法） 测定蛋白质 含量的原理 和方法
实验目的
实验内容
◆肝脏组织蛋白 的提取 ◆蛋白的浓度测 定
1.肝脏组织的提取
原理：
RIPA裂解液是一种传统的细胞组 织快速裂解液，主要裂解成分含1% Triton X-100, 0.5% 胆氧胆酸钠 （sodium deoxycholate）, 0.1% SDS， 得到的蛋白样品可以用于常规的 Western。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法
BCA法
紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年 由 Bradford 建 立 的 考 马 斯 亮 兰 法 （ Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。 考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种
肝脏蛋白的提取 和浓度测定
医学基础实验室
了解并掌握 蛋白质的提 取方法
了解掌握考 马斯亮蓝法 （Braford法） 测定蛋白质 含量的原理 和方法
实验目的
实验内容
◆肝脏组织蛋白 的提取 ◆蛋白的浓度测 定
1.肝脏组织的提取
原理：
RIPA裂解液是一种传统的细胞组 织快速裂解液，主要裂解成分含1% Triton X-100, 0.5% 胆氧胆酸钠 （sodium deoxycholate）, 0.1% SDS， 得到的蛋白样品可以用于常规的 Western。
以标准液的蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标Biblioteka 制标准曲线。A（吸光度）OD
Ax
cx
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/mL
16 C（蛋白浓度）
实验内容
◆肾脏蛋白的提取 ◆蛋白的浓度测定
认真操作--仔细观察--用心分析--完成报告
18
1mg/mL牛血清 白蛋白溶液
蒸馏水 待测样品 考马斯亮蓝 G250
0 1.0 – 5
0.2 0.8 – 5
0.4 0.6 – 5
0.6 0.4 – 5
0.8 0.2 – 5
1.0 0 – 5
0 0 1 5
2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管
调零，测定各管吸光度值。
15
绘制标准曲线：
结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰
在 465nm ，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大 吸收峰改变为 595nm。在 595nm下，光密度与蛋白质
含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
实验步骤
1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:
试剂(ml)
空白管 管号 0 1 标准管 2 3 4 5 测定管 6
1.肝脏组织的提取 （3）冰上放置：
裂解完全后，冰 上放置30分钟
1.肝脏组织的提取 （4）4度离心：
放入离心机中， 4℃ 12000rpm离心 5min
1.肝脏组织的提取 （5）吸取上清：
取上清分装于 0.2ml离心管中并置 于－20℃保存，待 用
超声匀浆 要保持低温
注意 事项
超声强度 以不产生泡沫 为准
1.肝脏组织的提取
组织取材 超声匀浆
操作 步骤
冰上放置 4度离心 吸取上清
1.肝脏组织的提取 （1）组织取材：
取约100mg大鼠 肝脏组织，用灭菌 的剪刀将组织块尽 量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中
1.肝脏组织的提取 （2）超声匀浆：
加0.5mlRIPA裂解 液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀 浆器进行匀浆,超声 每次10秒，重复3次