第三章 发酵培养基的制备及灭菌

6、其它微量元素：
Cu、Co、Zn在合成培养基中须加（如：CuSO4， ZnSO4, CoCl等）。
五、生长因子
凡能调节微生物代谢活动的微量有机物，都 称生长因子，一般是指B簇维生素。 生长因子不是一切微生物都需要的营养要素， 只对某些不能自己合成的微生物有意义，如糖质 为原料的谷氨酸产生菌绝大多数为生物素缺陷型， 须添加生物素以生物素为生长因子。生物素的作 用主要是影响细胞膜渗透性，同时影响代谢途径， 生产上所需的生长因子，大多是由天然原料中提 供，如玉米浆，麦芽汁，酵母膏等均含有丰富的 生长因子。
2、代谢调ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ剂
（1)、促进剂
既不是营养，也不是前体，但加入后可明 显提高产量的物质。例：
L-甲硫氨酸 β－巴比妥
头孢菌素 利福霉素
促进剂在酶制剂生产中用得较广泛，许多酶为 诱导酶，另外为组成酶。酶的诱导物常见有两类：
①、酶的基质（底物）及基质（底物）的结构类似物
酶 β-半乳糖苷酶 纤维素酶 Try酶 青霉素-β-内酰胺酶 葡萄糖氧化酶 基质 类似诱导物 乳糖 异丙基-β-D-硫半乳糖苷 纤维素 2－葡萄糖-β-葡萄糖苷 L－Try D-Try D-苯丙氨酸 苄青霉素 甲霉素 葡萄糖 α-甲基-D-葡萄糖
NADH +H NAD
前体物质一般说来，少加可提高产 量，但浓度不可过高，因为：
1、前体物质对产生菌有毒性，不应多加 。 2、微生物对前体有氧化（解毒）作用 ，高浓度时 将其氧化而不能进入产物。因此，多加，不仅成本 高，且无作用。 由于这两个原因，前体与加入应采用少量 多次 或连续滴加（流加），以避免前体物质浓度过大。 如：在青霉素发酵中分5－8次分批加入。
花生饼
黄豆饼
菜籽饼
棉籽粕
缺点：大多为天然原料加工制作的天然化合物， 成分比较复杂不稳定。产地不同、加工方法不 同和储存时间等都会影响发酵水平。 如抗生素生产：（麦白霉素）黄豆饼粉质量 要求：黄色粉末霉变虫蛀（热榨） 。
四、无机盐及微量元素：
作用： 微量元素常作为一些酶的辅基或激活剂。如 Mg、S 、P、 Fe、 K、 Na、 Mn、 Co、 Zn 等。
N
COOH
① 菌体本身能够合成的前体（内前体）：如Cys Val ② 菌体不能合成或合成得少（外前体）： 外界加入
前体物质的加量对青霉素产量的影响
苯乙酸加量 （％） 0.1 0.2 0.3 0.4 青霉素效价 （u/ml） 7750 8515 9630 9200 青霉素G的比 例（％） 57.3 73.0 90.6 95.6
4、 S
S是菌体细胞蛋白质的组成部分，参与合成含硫氨基酸 的元素及含S杂质含量，抗生素分子中的元素（如青霉素， 头孢菌素），如青霉素分子中的S，所以加硫酸氨（无机氮 源），MgSO4. 7H2O (Mg2+)亦可。
5、K+
K+维持细胞渗透压。另外，在谷氨酸生产中。钾离子控 制：钾离子降低，长菌体，生长需钾离子0.01％ 钾离子升 高，产酸，产酸需钾离子0.02－0.1％（以K2SO4计）。
（3）、表面活性剂
如：吐温-80（Tween80）等，起分散剂作用， 改善发酵液的传质条件。又如新洁尔灭，在低 浓度时对菌体分散有利。
（4）、缓冲剂
控制培养基的pH，特别是在有机酸发酵中， 产物为酸（如乳酸等），添加CaCO3作为pH缓 冲剂。
（5）、消泡剂
发酵培养基中含丰富的蛋白质，加之通气， 搅拌，因而产生大量泡沫。泡沫过多，一方面 容易造成逃液，另一方面增加染菌机会。因此 培养基中须加消泡剂。加入方式有两种： ① 基础料中添加，防止前期产生泡沫。 ② 有些菌对油敏感，亦可在产生泡沫时加。由 于消泡剂对氧的传递有阻碍作用，故应尽量少 加。
2、 P
作用: 磷酸盐是核酸，核蛋白等重要细胞物 质的组成部分，在糖代谢磷酸化中也需要 P（为高能磷酸键的组成部分），在菌体 生长，繁殖和代谢活动中起着及其重要的 作用。 P含量的控制： 在抗生素生产中特别注意：
生长期： 微生物经糖代谢，产生大量菌丝， P有刺激生长作用。 生产期： 产物合成，此阶段 P 含量较低， 不易检测出，磷酸盐如何影响抗生素合成， 有大量文献报道（有关抗生素的生物合成 机制研究）。另外，谷氨酸合成中， P 过 高会抑制6－磷酸葡萄糖脱氢酶活性，使菌 体生长旺盛，而产酸很低。
氨基酸 丝氨酸 苏氨酸
O CH CH3
菌株 嗜甘油棒状杆菌 谷氨酸小球菌
前体物质 甘氨酸 高丝氨酸
OH
＋ NaHSO3
HO
C CH3
OSO2Na
2ADP 2ATP 2ADP 葡萄糖 1.6-二磷酸果糖 3-磷酸甘油醛
2ATP 丙酮酸
NaHSO3 乙醛 Pi 甘油 H 2O 加成物
NAD NADH +H 磷酸二羟丙酮 α-磷酸甘油
三、氮源
作用： 构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质， 核酸）和含N代谢物的组分（如含N抗生素， 青霉素）。 常用N源可分为二类： （1） 无机氮源 （2） 有机氮源
1、 无机氮源：
如：氨水，硫酸氨，NaNO3、NH4NO3等 优点：无机N成分稳定，引起生产波动性 小，易吸收。利用快，而蛋白质利用时需 蛋白酶分解成氨基酸后再行利用，在抗生 素生产中无机氮源常作为辅助氮源。 缺点：有些无机氮源利用过程中会使培养 基的pH发生变化。既可以引起pH上升， 也可以引起pH下降。如：
例2：谷氨酸发酵中使用青霉素
以废糖蜜为原料时，若原料中生物素含量 很高，则无法直接利用（影响产物分泌）。 添加青霉素，可解除生物素过剩的影响而生 成谷氨酸。原因是青霉素使菌体细胞壁的生 物合成受阻，细胞壁失去了保护细胞膜的性 能，又由于膜内外渗透压差引起了二次膜的 变化，而使细胞膜受到机械损伤，失去渗透 障碍物，遂使谷氨酸排出。
配制培养基时注意： （ 1 ） CaCO3 要待培养基 pH 调好后在加入， 将 pH调到中性， CaCO3 起作用，在酸性中， 碳酸钙则失去作用。 （ 2）培养基中钙盐过多时，会引起磷酸钙 沉淀，降低了培养基中可溶性P的含量，因 此，当培养基中磷和钙均要求较高浓度时， 可将二者分别灭菌或逐步补加。 （3）轻质碳酸钙和重质碳酸钙两种规格， 控制其中氧化钙等。
六、发酵培养基的专用添加剂
1.前体
定义：一些化合物，当添加到发酵液中，可直 接结合到所需的产物中而本身没有明显改变。换 言之，这类物质是产物分子的组成部分，在微生 物代谢中直接参加，而本身没有显著改变的物质， 加入后可很快吸收，使产量大大提高。例如：
青霉素生产：
R CO
NH CH OC S CH3 CH3 C H
油脂 脂肪酶 甘油 ＋ 脂肪酸
β-氧化过程分解
有氧代谢
1分子脂肪酸
129个ATP
在某些抗生素（链霉素，青霉素、土霉 素）发酵中，完全用脂肪代替糖，发酵单 位并不比含糖培养基低 。发酵过程中加入 的油脂有消沫和补充C源双重作用。
3、 有机酸、低碳醇类及烃类物质
放线菌和霉菌对许多有机酸（如：乳酸，琥珀 酸，乙酸等）氧化能力很强，有机酸氧化产生能 量可供给菌体使用。石油发酵微生物可利用甲醇 （生产SCP的主要C源），有些菌利用14－18C 烃类物质合成产物。 有机酸及其盐作碳源，同时调节发酵过程中 pH易引起pH升高 。 一般使用有机酸盐，其氧化产生碱性物质： CH3COONa + 2O2 → 2CO2 + H2O + NaOH
第一节
培养基成分
水 碳 源
培养基的五大要素
氮 源 生长因子 无机盐
一、水：
作用： （1）水是组成微生物细胞的主要成分（约 占78％）其余为蛋白质，核酸，脂肪等。 （2）水还是发酵过程中所有生化反应的溶 剂，营养及O2（DO）的吸收，废物的 排泄等均通过水来进行。 （3）分泌的产物也在水相中。水的多少， 影响到传质。
二、碳 源
作用： 用来供给菌种生命活动所需的能量， 构成菌体细胞及代谢产物的 C 架来源。是 培养基中的主要组分之一。 常用的碳源主要有三类： A、 糖类：葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，淀粉， 湖精，乳糖等。 B、脂肪和油 。 C、 有机酸及低碳醇类，烃类物质等其他 。
1、糖 类
如:葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，淀粉，湖精， 乳糖等。 由于微生物所含酶系统并不完全一样， 各种菌种能利用的C源有所不同。 如：葡萄糖，麦芽糖，乳糖，糊精和淀 粉是霉菌和放线菌容易利用的C源，大部分 细菌不含淀粉酶，不能直接利用淀粉。
酰胺酶活力 N－甲基乙酰胺（非基质、诱导物）
乙酰胺 （基质、诱导物） 酰胺诱导物浓度（mm）
②另一类是产物而非基质为酶的诱导物。
酶 葡萄糖淀粉酶 淀粉酶 葡聚碳酶 微生物 黑曲霉 基质 淀粉 产物诱导物 麦芽糖 异麦芽糖 麦芽 糊精 异麦芽糖
嗜热芽孢杆菌 淀粉 青霉菌 葡聚糖
(2)、抑制剂
添加到发酵液中可增加所需代谢产物的浓度 而抑制副产物的产生 。 例1：四环素发酵采用金色链霉菌 通过添加溴化物竞争性抑氯剂和其它抑氯剂 （巯基抑氯剂、M-促进剂）,抑制氯原子进入四 环素的分子结构中，而使7-氯四环素（金霉素， 氯化物为金霉素合成的前体）产量减到最少， 提高四环素产量。
淀粉 淀粉酶 液化 糖化酶 葡萄糖
由于大多数细菌，酵母不能直接利用 淀粉，生产中增加－制糖过程，如： 北京棒状杆菌发酵生产味精大米→淀粉 蕃薯淀粉（鲜蕃薯或蕃薯干）→葡萄糖 链霉菌生产螺旋霉素：复合C源→淀粉 ＋葡萄糖
2、脂肪和油
霉菌和放线菌除糖外还可利用油和脂肪 作为C源，因其含脂肪酶。利用过程：
1、Fe
作用：铁是细胞色素细胞色素氧化酶和过氧化 氢酶的组成部分，因此是菌体有氧代谢不可缺 少的元素。 铁对谷氨酸菌有促进生长作用，但培养基中的 铁含量过高，会使发酵单位降低。 在抗生素生产中，培养基中铁含量过高，可能 会抑制抗生素合成。如：
青霉素：培养基中Fe2＋含量 6ug/ml 无影响 60 ug /ml 降低30％ 300 ug /ml 降低90％ 链霉素：铁对灰色链霉菌的生长影响较 小但对其合成影响较大，浓度增大，显著 抑制链合成，其最适浓度为1－2ppm 除 Fe2＋ 的 方法：对于新制或搁置多日的 铁罐须先用 硫酸氨 或 稀硫酸 洗涤后，再以 不接种的培养基空转几天，进行预处理， 以消除Fe2+的影响，然后再投入正式生产， 有条件的单位可采用不锈钢罐。
2、有机氮源
如：黄豆饼粉，酵母粉，鱼粉，棉籽饼 粉，蛋白胨等。 特点：营养丰富，除含丰富的蛋白胨外， 还含许多游离氨基酸，这些氨基酸直接被 微生物所利用，另外还有一些多肽，生长 素等。有些氨基酸还可作为产物的组成。 如：青霉素，头孢菌素的合成前体α－ 氨基己二酸、半胱氨酸，缬氨酸，使用氮 源的目的除供给菌体生长繁殖的营养外， 还为抗生素合成提供前体物质。
良好的培养基应该满足下列要求：
1、营养丰富，配比合理：营养全（C、N、 无机盐、生长因子），且比例适当，特别 是C/N. 2、利于产物提取（丰产不丰收，拿不到产 品，利于提炼工艺的收率质量如：残糖低， 油量少，减少乳化，粘度，色素。 3、理化性质稳定：指培养基的各个组分。 4、来源丰富，价格低影响到生产成本。
第三节 淀粉水解糖的制备
发酵工业中的生产菌种，有的不能直接利用淀 粉，而只能利用糖类进行发酵，如谷氨酸、啤酒、 酒精生产，必须先将淀粉质原料，如大米，小麦 等制成淀粉水解液（糖），才能供发酵用。即淀 粉水解糖的制备。这成为许多发酵工厂必不可少 的一道生产工序。
(NH4)2SO4 → 2NH3 + H2SO4 NH3 通过转氨作用被利用，使发酵液 中不存在NH3 生理酸性物质：在微生物作用下，体现 出酸性的无机盐类。 NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH 先还原硝基氮为氨，再利用 生理碱性物质：代谢后能产生碱性物 质的盐类。 所以(NH4)2SO4 ，NaNO3 既可用作氮源， 又可用于调节pH。
3、Mg2＋、Ca2+
Mg2+ 作为许多重要酶的激活剂，另外是蛋 白质合成不可缺少的元素。 对氨基糖苷类抗生素其作用： （1）提高菌对自身产生的代谢物的耐受性。 （2）利于抗生素透过细胞膜，获得高单位。 Ca2＋能控制细胞透性，另外，更重要的一点 是调节发酵培养基的pH值。以CaCO3可与代谢 过程中产生的酸起反应，形成中性化合物及 CO2气体，有稳定pH的作用，许多有机酸 柠 檬酸发酵中（如2－酮基－葡糖酸，乳酸等酸 性产物均加有CaCO3作为缓冲剂）。