一种纳米抗体稳定

Nb80和β2AR胞浆面相互作用的细节 Nb80和β2AR胞浆面相互作用的细节
高亲和力的β2AR激动剂 高亲和力的β2AR激动剂
• 为了进一步稳定β2AR的活跃状态，我们筛选了多于50个 商业的和专属的β2AR的配体。在这些配体中，BI167107(勃林殷格翰药业公司)有最有利的效力、亲和力和 解离速率概况。BI-167107是有Kd=84pM解离常数的结合 到β2AR上的全激动剂(补充图表2.a和b)。正如在补充图表 2c和d中所显示的，BI-167107在杂环化合物bimane结合 到Cys265上的荧光强度和最大吸收波长λmax上比激动剂 异丙肾上腺素诱导了一个更大的改变。而且，BI-167107 的解离速率极其低，用一个过量的中性拮抗剂阿普洛尔/ 烯丙洛尔置换BI-167107需要150小时才能完成。相比之 下，异丙肾上腺素只需要五秒钟。
一种纳米抗体稳定的β2肾上腺素 一种纳米抗体稳定的β2肾上腺素 受体活跃状态的结构
Structure of a nanobody-stabilized active state of the b2 adrenoceptor
摘要
• G蛋白藕联受体在对天然的和人工合成的配体的反应中显 示了一定范围的功能行为。近期的晶体结构为几个G蛋白 偶联受体的不活跃状态提供了洞见。努力获取一种激动剂 结合的活跃状态的GPCRS结构已经证明是很困难的，因 为在不存在G蛋白时的这种状态的固有的不稳定性。我们 合成了一种针对人类β2肾上腺素受体的骆驼抗体片段（纳 米抗体），它显示了G蛋白一样的行为，并且获得了受 体—纳米抗体复合物的一种激动剂结合的活跃状态的晶体 结构。和不活跃状态的β2AR结构的比较显示了在结合位 点的微小变化。然而，这种微小变化和跨膜片段6胞浆终 点的11A外向运动以及跨膜片段5和7的重排相关联，这和 在视蛋白，一种活跃形式的视紫红质中观察到的非常相似。 这种结构为激动剂结合和活化过程提供了洞察。
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Gs 的代替物是什么？！ --Nanobody（纳米抗体） --Nanobody（纳米抗体）
(兴奋性G蛋白） 兴奋性G
• 我们识别出了对β2AR展示了像G蛋白一样行为的骆驼抗体片段-Nanobody 。 • 骆驼亚目(双峰驼、单峰驼、无峰驼）已经形成了一类独特的缺乏轻 链的功能抗体分子。 • 一个纳米抗体是这样一个骆驼重链抗体的重组的最小型号的完整抗原 结合域，并且它大约只有常见Fab片段25% β2AR的大小。 • 为了合成受体专一的纳米抗体，一个无峰驼用在高浓度下被重组成磷 脂囊胞的被纯化的激动剂结合的β2AR免疫。 • 由此一个单链纳米抗体克隆文库被组建成并用激动剂结合的受体筛选。 • 我们鉴定出七种能够识别激动剂结合的β2AR的纳米抗体克隆。在这 些克隆抗体中，Nb80被选出因为当它结合到野生型β2AR和β2ART4L时展示了像G蛋白一样的特性。
Gs和Nb80对β2AR在激动剂亲和力上的效果
β2AR被重组成高密度脂蛋白 微粒和在存在或不存在Gs 和Nb80时进行了激动剂竞 争结合实验，在不存在其中 的任何一种蛋白质时，异丙 肾上腺素有一个107nM的抑 制常数(Ki)，在存在Gs时两 种亲和状态都被观察到了， 因为并不是所有的β2AR都 偶联了Gs.在Gs偶联的状态 异丙肾上腺素的亲和力增加 了百分之百(Ki=1.07nM).相 似的，在存在Nb80时异丙 肾上腺素的亲和力增加了 95%(Ki=1.13nM)（图形1e 和补充图表1）。相比之下， Nb80对β2AR结合到反激动 剂ICI 118,551上有较小的 效果。这种结合数据显示了 Nb80在野生型β2AR中稳定 了一种构象，这种构想与被 Gs稳定的构象非常相似， 以至于激动剂的活跃偶联和 和Gs的结合被Nb80如实的 模仿了。
monobromobimane (mBBr)
Bimane is a heterocyclic chemical compound. Bimane forms the core of a class of fluorescent dyes known as bimane dyes. the blue-fluorescent (380/458) bimane is one of the smallest fluorophores available。Bromobimane (or monobromobimane) is a 。 heterocyclic compound and bimanedye that is used as a reagent in biochemistry. It alkylates thiol groups, replacing the H with a fluorescent tag (λemission = 478 nm). Its alkylating properties are comparable to iodoacetamide. Bromobimane (or monobromobimane) 是一种在生物化学中被用做反应试剂的杂环化合物和bimane染色。
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儿茶酚胺激动剂异丙肾上腺素和Gs都稳 Gs 定了活跃状态的构象。但是在存在异丙 肾上腺素时Gs的效果更大，和激动剂与 Gs在β2AR结构上的共同作用是一致。 单独Nb80对非配体β2AR的杂环化合物 荧光和最大吸收波长（λmax）的影响 与Gs对两者的影响相似。这种效果在 β2AR结合到反向激动剂ICI-118,551上 时没有被观测到。在10 mM异丙肾上腺 素存在时Nb80的效果增加了，这种结 果说明Nb80不能识别β2AR的不活跃状 态构象,但是能有效的结合到激动剂占据 的β2AR上并且在杂环化合物荧光上产 生了一种改变，这种改变与存在Gs和异 丙肾上腺素时观察到的不同。
β2AR-T4L-Nb80复合物的结晶 β2AR-T4L-Nb80复合物的结晶
• 利用两种不同的方法β2AR被原始的结晶结合到反向激动剂卡拉洛尔上，第 一个晶体结构从β2AR结合到一个能够识别由连接跨膜螺旋5和6的第三胞 内环的N端和C端组成的一个抗原表位的Fab片段上而获得（ref.8）。在第 二种方法中，第三个胞内环被T4溶菌酵素取代（β2AR-T4L）7.结晶β2ARFab复合物和β2AR-T4L结合到BI-167107和其他激动剂上努力没有成功地 合成对结构判断有足够数量的晶体。我们因此试图结晶BI-167107结合到 β2AR上和β2AR-T4L与Nb80的复合物。尽管在油脂bicelles和油脂立方相 （LCP）两种晶体复合物都被获得，高分辨率衍射图只从在油脂立方相 LCP中生长的β2AR-T4L-Nb80复合物的晶体中获得。这些晶体在pH为8.0 的 39–44% 聚乙二醇400, 100mM三羟甲基胺基甲烷, 4% 二甲基亚砜 和 1% 1,2,3-庚三醇环境下生成. 在3.5A的一个合并的数据集合从23个晶体中被获得（补充图表二）。这种 结构这个结构利用卡拉洛尔（β受体阻断剂、反向激动剂）结合的β2AR的 结构和一个纳米抗体作为研究模型被分子置换解决。补充图形3a显示了在 晶格中β2AR-T4L-Nn80复合物的包裹形式。受体在和晶格邻位的的几个方 向上都有相互作用，并且对于大多数的寡肽用很容易解释的电子密度来相 当好的排序。Nb80结合到β2AR的胞浆终点上，用第三个互补决定区 （CDR）环插入到受体中心（图形2a和补充图形4）。
连接了荧光团杂环化合物的跨莫螺旋在受体被激动后 的 运动以及荧光强度的降低和吸收波长的红移
• 在激动剂激活时跨莫螺旋6相对于跨莫螺 旋3和5运动。我们先前已经证明这种荧光 团杂环化合物共价地结合到赖氨酸265上 的周围环境随不论是激动剂结合还是G蛋 白偶联都会改变，导致荧光强度的降低和 最大吸收波长λmax15的红移
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β2AR被激动剂稳定时的结构改变 β2AR被激动剂稳定时的结构改变
• 图形2的b-d比较了不活跃状态的β2AR结构（从卡拉洛尔结合的 β2AR-T4L结构）和β2AR-T4L-Nb80复合物的激动剂结合的β2AR部 分，它们最大的不同在受体的胞浆部分在β2AR-T4L-Nb80复合物中相 对于非活性构象有TM5和TM6的外向替换和一个TM7和TM3的内向运 动。在细胞外的表面有相当小的改变（图形2.c）在TM3和TM4之间 的第二个包内环采纳了2个转折的а螺旋（图形。2d）,这与在火鸡式 的β2AR结构中所观察到的相似。在非活跃状态的β2AR结构中这种螺 旋的缺乏可能反映了涉及第二个包内环（ICI2）的晶格连接点。
配体激活的人类β2AR 配体激活的人类β2AR
一种非光而是配体激活的G 一种非光而是配体激活的G蛋白偶联受体
• Unlike the activation of rhodopsin by light, agonistsare much less efficient at stabilizing the active state of the b2AR,makingit difficult to capture this state in a crystal structure. • 用一个被构象敏感荧光针标记的β2AR所做的实验显示活跃状态的 稳定需要激动剂和兴奋性G蛋白（Gs）——对腺苷环化酶起激活作 用的G蛋白---的共同作用。 • 激动剂+GPCR+G蛋白---生物效应 • 努力获得激动剂--GPCR--G蛋白复合物是非常重要的；然而，这是 一个特别困难的努力因为在对GPCR和G蛋白同时作用时的生物化 学上的挑战，和在清洁剂中这种复合物固有的不稳定性。 • 作为一条另选途径，我们合成了一种优先地结合并稳定活性构像的 结合蛋白，作为兴奋性G蛋白（Gs）的代替品。
• β2AR-T4L是β2AR-T4溶菌酶融合蛋白用来获得高分辨率 的不活跃状态的晶体结构。
如何比较了Nb80和Gs对β2AR结构和激动剂 结合亲和力的效果 ??
β2AR用荧光团monobromobimane（一种杂环化合物）在跨莫蛋白螺 旋6胞浆终点的265赖氨酸处被标记并被重组成高密度脂蛋白微粒。 Bimane
该论文的结构
第一部分：对G蛋白偶联受体和 其相关蛋白的介绍 • 第一段：GPCRS的不同效力的激动剂和拮抗剂。 • 第二段：一种GPCR---视紫红质的两种状态：结合视黄酮的非活性状态和光 敏感的活性状态。 • 第三段：β2AR 活跃转台的稳定需要激动剂和Gs,和Gs的代替物。 第二部分；纳米抗体稳定的β2AR的活跃状态 • 第四段：纳米抗体Nb80的获得。 • 第五段：Nb80和Gs对β2AR结构和激动剂结合亲和力的效果 的比较。 • 第六段：Gs和Nb80对β2AR在激动剂亲和力上的效果 • 第七段； 高分辨率的β2AR非活跃状态的结构的获得。 第三部分；高亲和力的β2AR激动剂--——BI-1167107. 第四部分： β2AR—T4L—Nb80复合物的结晶。 第五部分；激动剂稳定的β2AR的结构改变
关于arrestin的生物作用 关于arrestin的生物作用
其本质是一种视黄铜蛋白（这将与第二段有关）
在第二段中有关蛋白的关系
G蛋白偶联受体：视蛋白、视紫红质蛋白 有七个跨莫螺旋结构 视蛋白+视黄酮=视紫红质蛋白
光激活的生色团 11-顺-视黄酮
传递G蛋白（ 传递 蛋白（Gt-transducin） 蛋白 ）
Dihydroalprenolol is a hydrogenated alprenolol derivative. It is a radiolabeled form of alprenolol. Being a beta-adrenergic blocker, it is used to label the beta-adrenergic receptor for isolation.[1] d-f图为ISO（异丙肾上腺素)和[3H]-DHA竞争的配体结合曲线