脂质体的制备及包封率的测定

• 【注意事项】 • (1)在整个实验过程中禁止用火。 • (2)磷脂和胆固醇的乙醇溶液应澄清，不能在 水浴中放置过长时间。磷脂和胆固醇的比例可 以采用4：1或5：1或6：1，如果磷脂和胆固醇 的质量不好，建议采用6：1 。 • (3)磷脂、胆固醇形成的薄膜应尽量薄。 • (4)60-65℃水浴中搅拌水化10-20min时，一定 要充分保证所有脂质水化，不得存在脂质块。
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脂质体的制备方法有多种，根据药物的性质或研究 需要来进行选择。 • (1)薄膜分散法 这是一种经典的制备方法，它可形成多 室脂质体，经超声处理后得到小单室脂质体。此法优点 是操作简便，脂质体结构典型，但包封率较低。 • (2)注入法 有乙醚注入法和乙醇注入法等。“乙醇注入 法”是将磷脂等膜材料溶于乙醇中，在搅拌下慢慢滴于 55-65℃含药或不含药的水性介质中，蒸去乙醇，继续搅 拌1—2h，即可形成脂质体。 • （3）逆相蒸发法 系将磷脂等脂溶性成分溶于有机溶剂， 如氯仿、二氯甲烷中，再按一定比例与含药的缓冲液混 合、乳化，然后减压蒸去有机溶剂即可形成脂质体。该 法适合于水溶性药物、大分子活性物质，如胰岛素等的 脂质体制备，可提高包封率。
• （4）取预热的PBS 30ml，加至含有磷脂膜的烧 瓶中，65-70℃水浴中搅拌水化10-20min。取出 脂质体液体于烧杯中，置于磁力搅拌器上，室温 下，搅拌30-60min，如果溶液体积减少，可补加 水至30m1，混匀，即得。（整个过程也可在旋转 蒸发仪上完成，其它的脂质体制备也可在旋转蒸 发仪上完成。） • （5）取样，在油镜下观察脂质体形态，画出所 见脂质体结构，记录最多和最大的脂质体的粒径； 随后将所得脂质体溶液通过0.8m微孔滤膜两遍， 进行整粒，再于油镜下观察脂质体的形态，画出 所见脂质体结构，记录最多和最大的脂质体粒径。
（二）实验部分
1．空白脂质体的制备（用于测定柱分离度用）
【处方】 注射用大豆卵磷脂 胆固醇 无水乙醇 磷酸盐缓冲液
0.9g 0.3g 2-20m1 适量 制成约30m1脂质体
• 【制备】 • （1）磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 称取磷酸 氢二钠（Na2HPO4﹒12H2O）0.37g与磷酸二氢钠 （NaH2PO4﹒2H2O）2.0g,加蒸馏水适量，溶解并 稀释至1000ml（pH约为5.7）。 • （2）称取处方量磷脂、胆固醇于100ml（也可 以是250ml、500ml或1000ml ）烧瓶中，加无水 乙醇1-2ml（根据情况可以加10ml或20ml ）， 置于65-70℃水浴中，搅拌使溶解，于旋转蒸发 仪上旋转，使磷脂的乙醇液在壁上成膜，减压 除乙醇，制备磷脂膜。 • （ 3 ） 另 取 PBS 30ml 于 小 烧 杯 中 ， 同 置 于 6570℃水浴中，保温，待用。
• 其他方法：冷冻干燥法 、熔融法 等。
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在制备含药脂质体时，根据药物装载的机 理不同，可分为“主动载药” 与“被动载药” 两大类。所谓“主动载药”，即通过脂质体内 外水相的不同离子或化合物梯度进行载药，主 要有K+-Na+梯度和H+梯度(即pH梯度)等。传统上， 人们采用最多的方法是“被动载药”法。所谓 “被动载药”，即首先将药物溶于水相或有机 相(脂溶性药物)中，然后按所选择的脂质体制 备方法制备含药脂质体，其共同特点是：在装 载过程中脂质体的内外水相或双分子层膜上的 药物浓度基本一致，决定其包封率的因素为药 物与磷脂膜的作用力、膜材的组成、脂质体的 内水相体积、脂质体数目及药脂比(药物与磷脂 膜材比)等。
• 对于脂溶性的、与磷脂膜亲和力高的药物， “被动载药”法较为适用。而对于两亲性药物， 其油水分配系数受介质的pH值和离子强度的影 响较大，包封条件的较小变化，就有可能使包 封率有较大的变化，首选“主动载药” 方法。
• 下图为“主动载药”中pH梯度法载药原理示
意图
oudside neutral pH
inside acid pH
DH+ H+
DH+ H+
D
D
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评价脂质体质量的指标有粒径、粒径分布 和包封率等。其中脂质体的包封率是衡量脂质 体内在质量的一个重要指标。常见的包封率测 定方法有分子筛法、超速离心法、超滤法等。 本文采用阳离子交换树脂法测定包封率。“阳 离子交换树脂法”是利用离子交换作用，将荷 正电的未包入脂质体中的药物(即游离药物)， 如本实验中的游离小檗碱，通过阳离子交换树 脂吸附除去，包封于脂质体中的药物(如小檗 碱)，由于脂质体荷负电荷，不能被阳离子交 换树脂吸附，从而达到分离目的，用以测定包 封率。示意图见下图。
• ②对照品溶液的制备：取①中制得的混合液 0.1ml置10ml量瓶中，加入95％乙醇6ml，振摇使 之溶解，再加PBS至刻度，摇匀，过滤，弃去初 滤液，取续滤液4.0ml于10ml量瓶中，加PBS至刻 度，摇匀，即得。 • ③样品溶液的制备：取①中制得的混合液0.1m1 至分离柱顶部，待柱顶部的液体消失后，放置 5min，仔细加入PBS(注意不能将柱顶部离子交换 树脂冲散)，进行洗脱(约需2-3ml PBS)，同时收 集洗脱液于10m1量瓶中，加入95％乙醇6ml，振 摇使之溶解，再加PBS至刻度，摇匀，过滤，弃 取初滤液，取续滤液为样品溶液。 • ④ 空 白 溶 剂 的 配 制 ： 取 乙 醇 (95 ％ ) 30ml ， 置 50m1量瓶中，加PBS至刻度，摇匀，即得。
• 【附注】 • （1）柠檬酸缓冲液 称取柠檬酸10.5g 和柠檬酸钠7g置于1000ml量瓶中，加水 溶解并稀释至1000ml，混匀，即得。 • （2）NaHCO3溶液 称取NaHCO3 50g，置 于 1000ml 量 瓶 中 ， 加 水 溶 解 并 稀 释 至 1000m1，混匀，即得。
• 4．盐酸小檗碱脂质体包封率的测定 • （1）阳离子交换树脂分离柱的制备 取 已处理好的阳离子交换树脂适量，装于底 部已垫有少量玻璃棉（或多孔垫片）的 5ml注射器筒中（总量约4ml刻度处），加 入PBS水化过的阳离子交换树脂，自然滴 尽PBS，即得。 • （2）柱分离度的考察 • ①盐酸小檗碱与空白脂质体混合液的制备： 精密量取3mg／m1盐酸小檗碱溶液0.1ml， 置小试管中，加入0.2ml空白脂质体，混 匀，即得。
脂质体的制备及包封率的测定
ຫໍສະໝຸດ Baidu
沈 阳 药 科 大 学 药 学 院
邓意辉
一、
实验目的
1、掌握薄膜分散法制备脂质体的工艺。
2、掌握用阳离子交换树脂测定脂质体包封 率的方法。 3、熟悉脂质体形成原理，作用特点。 4、了解“主动载药” 与“被动载药” 的 概念。
二、 实验原理 脂质体是由磷脂与(或不与)附加剂为骨 架膜材制成的，具有双分子层结构的封闭囊 状体。
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3．盐酸小檗碱脂质体的制备（主动载药法）
【空白脂质体处方】 注射用豆磷脂 0.9 g 胆固醇 0.3 g 无水乙醇 2-20 m1 柠檬酸缓冲液 30 ml 制成约30ml脂质体
• 【制备】主动载药法 • （1）空白脂质体制备 称取磷脂0.9g和胆固 醇0.3g，加入无水乙醇，置于65-70℃水浴中， 搅拌使溶解，于旋转蒸发仪上旋转，使磷脂 的乙醇液在壁上成膜，减压除乙醇。加入同 温的柠檬酸缓冲液30ml，65～70℃水浴中水 化10-20min ，取出脂质体于烧杯中，余下操 作同“1．空白脂质体的制备” 。
• （2）主动载药 准确量取空白脂质体2.0ml、药 液(3mg／m1) 1.0m1、NaHCO3 溶液0.5m1，在振摇 下依次加入10ml西林瓶中，混匀，盖上塞，70℃ 水浴中保温20min（定时摇动），随后立即用冷 水降温，即得。 • 【注意事项】 • (1) “主动载药”过程中，加药顺序一定不能颠倒， 加三种液体时，随加随摇，确保混合均匀，保证 体系中各部位的梯度一致。 • (2)水浴保温时，应注意随时轻摇，只需保证体 系均匀即可，无需剧烈振摇。 • (3)用冷水冷却过程中，应轻摇。 • 【质量检查】观察粒子形态，最大粒径与最多粒 径，药物的包封率。
常见的磷脂分子结构中有两条较长的疏 水烃链和一个亲水基团。将适量的磷脂加至 水或缓冲溶液中，磷脂分子定向排列，其亲 水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此相 对缔和为双分子层，构成脂质体。
用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如大 豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂等；合成磷脂，如二棕 榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱等。常 用的附加剂为胆固醇。胆固醇也是两亲性物质， 与磷脂混合使用，可制得稳定的脂质体，其作 用是调节双分子层的流动性，降低脂质体膜的 通透性。其他附加剂有十八胺、磷脂酸等，这 些附加剂能改变脂质体表面的电荷性质，从而 改变脂质体的包封率、体内外稳定性、体内分 布等其他相关参数。
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2．盐酸小檗碱脂质体的制备（被动载药法）
【处方】 注射用豆磷脂 0.6 g 胆固醇 0.2 g 无水乙醇 2-20m1 盐酸小檗碱溶液(1mg／m1) 30ml 制成30ml脂质体
• 【制备】被动载药法 • (1)盐酸小檗碱溶液的配制 称取适量的盐酸小 檗碱溶液，用磷酸盐缓冲液配成 lmg／ml和3mg ／m1两种浓度的溶液。 • (2)盐酸小檗碱脂质体的制备 按处方量称取豆 磷脂、胆固醇置于100ml烧瓶中，加无水乙醇， 余下操作除将PBS换成盐酸小檗碱溶液外，同 “空白脂质体制备”，即得“被动载药法 ”制 备的小檗碱脂质体。 • 【质量检查】观察粒子形态，最大粒径与最多粒 径，药物的包封率。 • 【注意事项】同前。
• （3）包封率的测定 精密量取盐酸小檗 碱脂质体0.lml两份，一份置10ml量瓶中， 按柱分离度考察项下②进行操作，另一份 置于分离柱顶部，按 “柱分离度考察” 项下③进行操作，所得溶液于345nm波长 处测定吸收度，按下式计算包封率。
• 包封率(％)=（ Al /At ）×100％
• 式中，Al—通过分离柱后收集脂质体中盐 酸小檗碱的吸收度；At—盐酸小檗碱脂质 体中总的药物吸收度， At = A 样 ×2.5 ， 2.5为稀释倍数。
• ⑤吸收度的测定：以空白溶剂为对照，在 345nm波长处分别测定样品溶液与对照品 溶液的吸收度，计算柱分离度。分离度要 求大于0.95。 • 柱分离度 = 1－[A样/（A对×2.5） ] • 式中，A 样 —样品溶液的吸收度；A 对 —对 照品溶液的吸收度；2.5—对照品溶液的 稀释倍数。
• 注意：在进行柱分离度实验前，需要用 空白脂质体对分离小柱进行饱和，具体 操作如下：量取0.2ml空白脂质体，置于 分离小柱顶部，待柱顶部的液体消失后， 仔细用5mlPBS进行洗脱，待液体滴尽即 可。
Na+
Ber + Ber +
SO-3
Na+
SO-3
Na+
－ － － － － Ber + Ber － － － Ber +－ － － －
SO-3
Na+
SO-3
• 三、 实验内容 • （一） 实验材料与设备 • 1.实验材料：盐酸小檗碱、注射用大豆卵磷脂、 胆固醇、无水乙醇、95％乙醇、磷酸氢二钠、 磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、NaHCO3 、阳 离子交换树脂。 • 2.实验设备与仪器：旋转蒸发仪、烧瓶、恒温 水浴锅、磁力搅拌器、吸耳球、光学显微镜、 玻璃棉、5ml注射器筒、0．8 m微孔滤、紫外 分光光度仪、溶量瓶等。
脂质体检测结果
脂质体 类别
空白脂质体 被动法载药 脂质体 主动法载药 脂质体
形态
最大粒径 最多粒径 (m) (m)
备注
• 五、思考题 • 1. 以脂质体作为药物载体的特点。请讨 论影响脂质体形成的因素。 • 2. 从显微镜下的形态上看，“脂质体”、 “乳剂”及“微囊”有何差别？ • 3. 如何提高脂质体对药物的包封率？ • 4. 请问如何选择包封率的测定方法？本 文所用的方法与“分子筛法”、“超速离 心法”相比，有何优缺点？ • 5. 请试着设计一个有关脂质体的实验方 案？本实验方案还有哪些方面有待改进？