微生物染色液配制及染色法

微生物染色液配制及染色法
2.1 美蓝染色法2.1.1 吕氏碱性美蓝染色液美蓝0.3g95%乙醇30mL0.01%氢氧化钾溶液100mL 将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。

2.1.2 染色法将涂片在火焰上固定，待冷。

滴加染液，染1～3min，水洗，待干，镜检。

2.1.3 结果菌体呈蓝色。

2.2 革兰氏染色法2.2.1 结晶紫染色液结晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

2.2.2 革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

2.2.3 沙黄复染液沙黄0.25g95%乙醇10mL蒸馏水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

2.2.4 染色法2.2.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。

2.2.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

2.2.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。

2.2.4.4 水洗，滴加复染液，复染1min。

水洗，待干，镜检。

2.2.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。

革兰氏阴性菌呈红色。

注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。

2.3 耐酸性染色法(萎－倪二氏法)2.
3.1 石炭酸品红染色液碱性品红0.3g95%乙醇10mL5%酚水溶液90mL将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。

2.3.2 3%盐酸－乙醇浓盐酸3mL95%乙醇97mL2.3.3 复染液吕氏碱性美蓝染色液。

2.3.4 染色法2.3.
4.1 将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。

染液如因蒸发减少时，应随时添加。

染5min，倾去染液，水洗。

2.3.4.2 滴加盐酸－乙醇脱色，直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定，一般为1～3min)，水洗。

2.3.4.3 滴加吕氏碱性美蓝染色液，复染30s～1min，水洗，待干，镜检。

2.3.5 结果：耐酸性细菌呈红色，
其他细菌、细胞等物质呈蓝色。

2.4 柯氏染色法2.4.1 染色液2.4.1.1 0.5%沙黄液。

2.4.1.2 0.5%孔雀绿液。

2.4.2 染色法2.4.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加0.5%沙黄液，并加热至出现气泡，约2～3min，水洗。

2.4.2.2 滴加0.5%孔雀绿液，复染40～50s。

水洗，待干，镜检。

2.4.3 结果布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色。

2.5 奥尔特氏荚膜染色法2.5.1 染色液沙黄3g蒸馏水100mL用乳钵研磨溶解。

2.5.2 染色法将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸气后，继续染3min。

水洗，待干，镜检。

2.5.3 结果炭疽
芽胞杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。

2.6 瑞氏染色法2.6.1 染色液瑞氏色素0.1g甲醇60mL用乳钵研磨溶解。

2.6.2 染色法2.6.2.1 涂片待自然干燥后，滴加染色液，固定1min。

2.6.2.2 加入等量蒸馏水(pH6.5)，染色3～5min。

2.6.2.3 用
蒸馏水冲洗，待干，镜检。

2.7 鞭毛染色法2.7.1 染色液的配制2.7.1.1 甲液：称丹宁酸5g、氯化高铁(FeCl3)1.5g，溶于100mL 蒸馏水中，待溶解后加入1%的氢氧化钠溶液1mL和15%的甲醛溶液2mL。

2.7.1.2 乙液：称2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。

在90mL乙液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止(此为关键性操作，应特别小心)。

滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，2～3d基本无效。

2.7.2 染色法在风干的载玻片上滴加甲液，4～6min后，用蒸馏水轻轻冲净。

再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约半分钟(加热时注意勿使出现干燥面)。

在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检，菌体及鞭毛为深褐色到黑色。

2.8 碱性复红染色法将0.5g碱性复红染料溶解于20mL95%乙醇中，然后用蒸馏水稀释至100mL。

如有不溶物时，可用滤纸过滤，或静置后取上清液备用。

注：本染色液系用于苏云金芽胞内蛋白质毒素结晶的染色，藉以与蜡样芽胞杆菌相区别
实验用染色液及试剂的配制
1．黑色素液水溶性黑素10g，蒸馏水100mL, 甲醛（福尔马林）0.5mL。

可用作荚膜的背景染色。

2．墨汁染色液国产绘图墨汁40mL，甘油2mL，液体石炭酸2mL。

先将墨汁用多层纱布过滤，加甘油混匀后，水浴加热，再加石炭酸搅匀，冷却后备用。

用作荚膜的背景染色。

3．吕氏(Loeffier)美蓝染色液
A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3g, 95%乙醇30mL;
B 液：0.0l% KOH l00mL。

混合A 液和B 液即成，用于细菌单染色，可长期保存。

根据需要可配制成稀释美蓝液，按1：10 或
1：100 稀释均可。

4．革兰氏染色液
(1)结晶紫(crystal violet)液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g 溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵
水溶液80mL 将两液混匀置24h 后过滤即成。

此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。

(2)卢戈(Lugol)氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。

先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至300mL 即成。

配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。

(3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。

(4)稀释石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和液(碱性复红1g, 95%乙醇l0mL, 5%石炭酸90mL 混合
溶解即成碱性复红乙醇饱和液)，取石炭酸复红饱和液l0mL 加蒸馏水90mL 即成。

(5)番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶
中，用时取20mL 与80mL 蒸馏水混匀即可。

以上染液配合使用，可区分出革兰氏染色阳性(G+)或阴性(G-)细菌，G-被染成蓝紫色，G+被染成淡
红色
5. 鞭毛染色液
A液：丹宁酸5.0g, FeCl3 1.5g，15%甲醛(福尔马林)2.0mL，l%NaOH 1.0mL，蒸馏水l00mL;
B 液：AgNO3 2.0g, 蒸馏水100mL。

待AgNO3 溶解后，取出l0mL 备用，向其余的90mLAgNO3 中滴加NH4OH，即可形成很厚的沉淀，继续滴加NH4OH 至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的AgNO3 慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入AgNO3，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止，如雾重，说明银盐沉淀出，不宜再用。

通常在配制当天便用，次日效果欠佳，第3 天则不能使用。

6. 0.5%沙黄(Safranine)液：2.5%沙黄乙醇液20mL，蒸馏水80mL。

将2.5%沙黄乙醇液作为母液保
存于不透气的棕色瓶中，使用时再稀释。

7. 5%孔雀绿水溶液：孔雀绿5.0g，蒸馏水100mL。

8. 0.05%碱性复红：碱性复红0.05g，95%乙醇100mL。

9．齐氏(Ziehl)石炭酸复红液：碱性复红0.3g 溶于95%乙醇l0mL 中为A 液：0.01%KOH溶液l00mL
为B 液。

混合A、B 液即成。

10．姬姆萨(Giemsa)染液
(1)贮存液：称取姬姆萨粉0.5g，甘油33mL，甲醇33mL。

先将姬姆萨粉研细，再逐滴加入甘油，继
续研磨，最后加入甲醇，在56℃放置1～24h 后即可使用。

(2)应用液(临用时配制)：取1mL 贮存液加19mL pH7.4 磷酸缓冲液即成。

亦可取贮存液：
甲醇=1：4 的比例配制成染色液。

11．乳酸石炭酸棉蓝染色液(用于真菌固定和染色) 石炭酸(结晶酚)20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉蓝0.05g，蒸馏水20mL。

将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入其他成分，微加热使其溶解，冷却后用。

滴少量染液于真菌涂片上，加上盖玻片即可观察。

霉菌菌丝和孢子均可染成蓝色。

染色后的标本可用树脂封固，
能长期保存。

12. 1%瑞氏(Wright’s)染色液：称取瑞氏染色粉6g，放研钵内磨细，不断滴加甲醇(共600mL)并继续
研磨使溶解。

经过滤后染液须贮存一年以上才可使用，保存时间愈入，则染色色泽愈佳。

13．阿氏(Albert) 异染粒染色液：
A 液：甲苯胺蓝(toluidine blue)0.15g，孔雀绿0.2g，冰醋酸lmL，95%乙醇2mL，蒸馏水100mL;
B 液：碘2g, 碘化钾3g，蒸馏水300ml。

先用A 液染色1min，倾去A 液后，用B 液冲去A 液，并染1min。

异染粒呈黑色，其他部分为暗
绿或浅绿。