发色底物法
STA发色底物法肝素测定
STA®-ROTACHROM ®HEPARIN(货号00612,00661)普通肝素(UFH)模式STA Compact®测试原理血浆中凝血因子Xa 的生理功能是将天然底物凝血酶原裂解为可形成纤维蛋白的凝血酶。
在肝素存在时凝血因子Xa 的这种机制与肝素-抗凝血酶复合物的抑制作形成竞争反应。
该抑制作用主要由肝素的杭凝血作用所体现。
本方法是基于和上述原理相似的一步反应：将凝血因子Xa 加入血浆底物混合液中，两个反应同时发生即：--凝血因子Xa 使底物水解--肝素-抗凝血酶复合物*抑制凝血因子Xa。
经过一定的反应时间，竞争反应达到平衡，反应生成的对硝基苯胺含量与检测标本中肝素的浓度呈负相关。
*肝素抗凝血酶复合物由患者特有的肝素和抗凝血酶(AT ) 合成。
标本采集和处理标本采集必需符合出凝血检测推荐的方法。
· 血液标本(9份) 采集后和 0.109M ( 即3.2% ) 的枸橼酸钠抗凝剂( 1 份) 混合。
非吸附试管(塑料或硅化玻璃) 或最好使用BectonDickinson 公司CTAD试管。
CTAD试管是一种专用于防止肝素失活的标本采集管(在美国遵从CLSI指南H3-A5 和H21- A5 ) 。
· 离心温度18 ℃3000 g 15分钟。
用常规枸橼酸钠抗凝剂的血液标本，采集1小时内离心。
CTAD试管采集的血液标本采集4 小时内离心建议用常规枸橼酸钠抗凝剂的血液标本离心两次· 血浆保存 20 土5 ℃保存2小时(枸橼酸盐)20 土5 ℃保存4 小时(CTAD 管)除本试剂盒以外还需要的试剂和设备STA® OwrenKoller (货号00360)· 定标: STA®-Hepanorm® H (货号00684 ) .· 质控: STA®-Heparin Control (货号00683 ) .· STA®-mini Reducer (货号00797 ) 用于(STA®- Rotachrom® Heparin○4 ) 或STA®-maxiReducer (货号00801 ) 用于(STA®Rotachrom®Heparin ○8) .· 常规临床实验室设备吸材料(离心机、蒸馏水…) 。
抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒(发色底物法)产品技术要求meichuang
抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒（发色底物法）适用范围：本产品用于体外定量测定人血浆中抗凝血酶III的活性。
1.1产品型号：产品为冻干型和液体型，试剂规格如下：2.性能指标2.1外观.产品外包装应完整，无破损，标识、标签清晰；.冻干型：凝血酶试剂、发色底物为白色冻干品，复溶后为清晰无色液体，缓冲液为无色透明液体。
.液体型：凝血酶试剂、发色底物为无色液体，缓冲液为无色透明液体。
2.2装量(液体)液体试剂的装量应不低于产品标示量。
2.3残留水分（冻干型）凝血酶试剂、发色底物的含水量应≤3％。
2.4准确性用试剂盒测试定值血浆，测量结果与定值血浆标示值相对偏差应≤±10%。
2.5 重复性用正常值血浆重复测定的结果变异系数（CV%）均应≤6%。
用异常值血浆重复测定的结果变异系数（CV%）均应≤8%。
2.6批间差用3个不同批号的试剂测试正常值血浆，所得结果的批间差应≤10％。
2.7瓶间差（冻干型）用正常值血浆测试的瓶间变异系数（CV）应≤8%。
2.8 线性线性范围为30％～150％，相关系数r≥0.982.9稳定性a）冻干型制剂复溶稳定性：复溶后样品在2-8℃条件下，保存24小时，取该样品检测外观、准确性、重复性应符合2.1、2.4、2.5的要求。
b）液体制剂效期稳定性：在2-8℃条件有效期为12个月。
取到效期后的样品检测外观、准确性、重复性，线性应符合2.1、2.4、2.5、2.8的要求。
c）冻干型制剂效期稳定性：在2-8℃条件有效期为12个月。
取到效期后的样品检测外观、残留水分、准确性、重复性，瓶间差、线性应符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.7、2.8的要求。
抗凝血酶检测方法
抗凝血酶检测方法
抗凝血酶检测其实挺重要的呢。
一种常见的检测方法就是发色底物法。
这个方法就像是一场小小的化学魔术。
检测的时候，会加入特殊的底物，这个底物就像一个小信号源。
抗凝血酶要是存在并且正常工作，就会和底物发生反应，然后就会产生颜色变化。
就像变魔术一样，从一种颜色变成另一种颜色。
通过仪器测量这个颜色变化的程度，就能知道抗凝血酶的活性啦。
还有凝固法呢。
这个方法有点像观察一场凝固的小表演。
在检测体系里，抗凝血酶会对抗凝血的过程产生影响。
如果抗凝血酶正常，那血液凝固的时间就会和正常情况不一样。
通过精确测量这个凝固时间的变化，就能推断出抗凝血酶的情况。
就像是看一场特殊的表演，根据表演的节奏来判断背后的“演员”——抗凝血酶的状态。
免疫比浊法也很有趣哦。
这就像是一场小小的免疫派对。
抗凝血酶会和特定的抗体结合，一旦结合呢，就会产生一些小颗粒，这些小颗粒会让液体变得浑浊。
然后通过仪器检测这个浑浊的程度，就像看派对的热闹程度一样，就能知道抗凝血酶的含量啦。
不同的检测方法都有自己的优缺点呢。
发色底物法比较准确，就像一个靠谱的小助手，能精确地测量抗凝血酶的活性。
凝固法相对来说比较简单，就像一个直爽的小伙伴，能快速给个大概的结果。
免疫比浊法对于检测抗凝血酶的含量很拿手，就像一个专业的小侦探，能把含量查得明明白白。
检验科15189体系文件 (11)
广东省中医院检验科 作业指导书文件编号：LJ-SOP-006351第三节凝血试验标准操作程序文件编号：LJ-SOP-006 文件版本： 5.0生效日期： 2014-09-01352操作程序广东省中医院检验科第三节 作业指导书6.3.3 D-二聚体测定可作为溶栓治疗有效的观察指标，但陈旧性血栓患者D-二聚体并 不升高。
凡有血块形成的出血，都会出现结果增高，因此本试验特异性较低。
6. 3.4 D-二聚体在急性肺栓塞诊断中的应用价值D-二聚体对急性肺栓塞诊断的敏感性髙达92%〜100%，而特异性仅为40%〜 43%。
所以，在临床应用过程中，D-二聚体对急性肺栓塞有较大的排除诊断价值，若 其含量低于500M g/L,可基本排除急性肺栓塞。
在任何情况下D-二聚体测定值大于 500M g/L 都不能作为急性肺栓塞的确诊依据。
由于D-二聚体特异性较差，所以肿瘤、 感染、心肌梗死等患者及80岁以上人群D-二聚体升高对急性肺栓塞的诊断并无意义。
6.4影响因素 6. 4.1混浊血浆可能导致测出的D-二聚体水平偏低。
6. 4.2 FDP 浓度大于lS^g/ml 会导致D-二聚体水平偏高。
6. 4.3类风湿因子高于50IU/ml 时可能会导致D-二聚体水平值偏高。
6. 4.4抗牛白蛋白血清极度缺乏和（或）抗鼠抗体存在时会引起测出的D-二聚体水平 偏高。
6. 4.5此试剂盒对以下物质不敏感：血红蛋白达5g/L ，胆红素达200mg/L ，高分子 肝素达2IU/ml ，抗Xa 的低分子肝素达2 IU/ml 。
7纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物（FDP ）7.1检验原理全自动血凝仪利用散射免疫比浊法进行FDP 的定量测定。
标本中的FDP 与试剂中 的鼠抗人FDP 单克隆抗体胶乳颗粒产生抗原抗体凝聚反应，在575nm 波长下，聚集所 产生的浊度上升与FDP 浓度成线性关系，根据吸光度变化的检测，求出FDP 的浓度。
7.2 '上机检测操作7. 2.1 FDP 试剂装载：点击试剂画面，点击Open 打开试剂仓抽屉。
肝素抗Xa检测简介
肝素抗Xa 检测简介用途肝素是一种发色底物法测定血浆中肝素活性的方法，用于肝素治疗的监测。
概述和解释肝素通过与抗凝血酶III 的结合，能够加速凝血因子Xa 和凝血酶的灭活。
未组分和低分子量肝素制剂广泛应用于抗凝治疗。
各类病人之间肝素治疗的剂量存在很多影响因素。
采用肝素检测试剂能够同时监测低分子量和普通肝素制剂的疗效。
方法学原理在试验孵育期间，A TIII 能灭活因子Xa 。
肝素起催化反应的作用。
硫酸葡萄糖（DS ）释放连接于干扰因子的肝素，使之参与反应。
在孵育后，FXa 残余量通过动力学方法采用发色底物在405nm 测定吸光度增加而得出。
游离结合结合＋肝素＋肝素DS DS →[]残留肝素剩余＋＋标本FXa ATIII -FXa ATIII FXa ⎯⎯⎯→⎯ 三肽＋染料发色底物残留⎯⎯⎯→⎯FXa警告和注意事项1. 适用于体外诊断。
2. 含有叠氮钠的试剂应小心处理：勿吞服或接触皮肤或粘膜！叠氮钠接触重金属，如铜或铅时会发生爆炸。
3. 因子Xa 试剂或A TIII 试剂中每位供血者必须检测HBsAg 、抗HCV 、抗HIV1和抗HIV2。
仅阴性结果才能用于制造。
在产品制造过程中，人源性材料加热到60℃10小时，以灭活病毒。
但是，由于无法证明所有的感染源都不存在，所以源自人血液的物质应认真处理，按照生物危害物质处理。
标本为了分离血浆，小心混合1份枸橼酸钠溶液（0.109mol/L ，如3.2％）和9份静脉全血，避免产生泡沫。
立即离心，1500×g ，至少10分钟标本稳定性：-20℃ 1月15～25℃ 8小时贮存在-20℃血浆必须在37℃10分钟内溶解，在8小时内完成检测。
操作手工法：测试杯：1cm 厚度波长：405nm因子Xa试剂，底物试剂和塑料测试杯/试管应预温到37℃，A TIII试剂放置室温（15～25℃）。
手工2步法（半微量试验）评价试验结果从参考曲线上获得，在试验前必须建立参考曲线，采用治疗用素制剂和同一分析方法。
发色底物测定大曲中的-葡萄糖苷酶活力
思考题
在实验中为什么要做空白测定？并分析实 验误差？
淀粉酶的组分有哪些，其性质是什么？
（3）0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）：16.4g 乙酸钠加 12ml 乙酸，定容至1000ml；
（4）1mol/L碳酸钠溶液。
实验步骤
1. 制作对硝基苯酚标准曲线 按下表分别取不同体积的对硝基苯酚
（4mol/L），用50mmol/L乙酸缓冲液 （pH5.6）稀释成一系列浓度。然后在分 光光度仪上测定410nm处的光密度，以浓 度为横坐标，光密度为纵坐标作曲线。
仪器、原料和试剂
1．仪器：722型分光光度计、恒温水浴锅、移液管2ml一 个、试管、试管架等。
2．原料：大曲浸提液 3. 试剂：
（1）1.25mol/L对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（pNPG）溶 液：75.2mg pNPG溶于200ml 0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）中；
（2）4mmol/L对硝基苯酚（pNP）溶液：111.3mg pNP 溶于200mL 0.05mol/L乙酸缓冲液（pH5.6）中。
发色底物测定大曲中的 α-葡萄糖苷酶活力
实验目的
掌握利用发色底物测定α-葡萄糖苷外切酶 活力的方法。
进一步理解酶活力的定义和计算方法。
实验原理
淀粉酶是水解酶类的一大亚类，是能够分解淀粉 糖苷键的一类酶的总称。其酶活力的计算多采用 测定产物还原糖含量的方法。但由于淀粉酶包括 的四种酶（α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-1，4-葡萄糖苷 酶、异淀粉酶）水解产物都是还原糖，所以还原 法无法准确测定单一酶活力。而发色底物法可以 解决这一难题，因为它是在糖苷配基上联接了一 个生 色基团。α-葡萄糖苷酶（俗称糖化酶）活力 的测定如果以无色的对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷 （pNPG）作反应底物，经α-葡萄糖苷酶水解α-1， 4-葡萄糖苷键后释放 出对硝基苯酚（pNP），在 碱性条件下后者是黄色的，最后通过监测405或 410 nm下的pNP 产生量作为α-1，4-葡萄糖苷酶活 性大小的判定标准。
底物法和干化学法
底物法和干化学法
底物法：发色底物法主要是利用测定产色物质的吸光度变化来推算所测定物质的含量。
干化学法是指将液体检测样品直接加到为不同项目特定生产的
商业化的干燥试剂条上，以被测样品的水分作为溶剂引起特定的化学反应，从而进行化学分析的方法，是以酶法为基础的一类分析方法，又有干试剂化学或固相化学之称。
主要具备以下特点：
1、准确度高、速度快，一般在3-4min内即可做出检验结果；
2、操作简便，不需要日常校正；
3、无须贮备任何其它试剂或配制任何溶液；
4、标本无须预处理，多层膜具有选择性过滤的功能，从而减少测定过程中干扰物质的影响；
5、标本用量少，反应时的水分由标本中的液体成分供应，提高测定灵敏度；
6、基于差示电极法原理的多层膜片系一次性使用，故有常规电极法的优点而无其缺点；
7、有些情况可替代湿化学法用于急诊标本，还可用于对常规检测结果进行方法学评价等。
血栓与止血检验-平时作业试题及答案
血栓与止血检验-平时作业试题及答案一、名词解释1.APTT：活化部分凝血活酶时间，测定是临床上最常用的反映内源性凝血系统凝血活性的敏感筛选试验，对于内源性凝血因子缺陷及相关抑制物的检测和活化蛋白C抵抗现象的筛检、肝素治疗的监测、弥散性血管内凝血（DIC）的早期诊断、术前检查等方面有着广泛的用途。
2.组织因子：是氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白，是人体不可缺少的。
3.内源性凝血途径：是指参与凝血的因子全部来自血液，通常因血液与带负电荷的异物表面(如玻璃、白陶土、硫酸酯、胶原等)接触而启动。
4.外源性凝血途径：是指参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。
这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到因子Ⅹ被激活的过程。
5.纤溶系统：血液凝固过程中形成的纤维蛋白被分解液化的过程，叫纤维蛋白溶解[现象]fibrinolysis（简称纤溶）。
纤溶活性异常增强，即纤溶亢进。
纤溶亢进又分为原发性纤溶亢进和继发性纤溶亢进，可致出血。
血纤维蛋白溶酶作用于纤维蛋白原或纤维蛋白，能将其多肽链的赖氨酸结合部位切断使之溶解的现象。
由此产生的分解产物为FDP。
纤溶过程也称血液凝固的第四相。
二、简答题1.简述D-二聚体测定的临床意义？答：D-二聚体来源于纤溶酶溶解的交联纤维蛋白凝块，主要反映纤维蛋白溶解功能。
.D-二聚体的临床检测主要应用在静脉血栓栓塞（VTE）、深静脉血栓形成（DVT）和肺栓塞（PE）的诊断。
.增高：见于继发性纤维蛋白溶解功能亢进，如高凝状态、弥散性血管内凝血、肾脏疾病、器官移植排斥反应、溶栓治疗等。
.心肌梗死、脑梗死、肺栓塞、静脉血栓形成、手术、肿瘤、弥漫性血管内凝血、感染及组织坏死等也可导致D-二聚体升高。
2.简述发色底物法测定血浆抗凝血酶活性的原理？答：发色底物法：受检血浆中加入过量凝血酶，使AT-Ⅲ与凝血酶形成1:1复合物，剩余的凝血酶作用于发色底物S-2238，释出显色基因对硝基苯胺（PNA），显色的深浅与剩余凝血酶呈正相关，而与AT-Ⅲ呈负相关。
医院检验中心纤溶酶原激活剂抑制物活性测定发色底物法操作规程
医院检验中心纤溶酶原激活剂抑制物（PAI）活性测定(发色底物法)操作规程
（1）原理：
定量t-PA加到待测血浆中，与血浆中的PAI作用，形成无活性的复合物，剩余的t-PA 作用于纤溶酶
原（Plg）,激活为纤溶酶（Plm），后者水解发色底物
S2251，释放出对硝基苯胺（PNA），它在405nm有强吸收
峰。
由测出剩余t-PA量，间接测出PAI活性。
PAI活性单位定义为：在25℃、20分钟内抑制1.0国际单位t-PA的PAI酶量为1.0 AU。
（2）标本处理：
静脉采血2ml置于含200ul抗凝剂（0.109mol/L枸橼酸钠）的塑料管或硅化管中,3000 rpm离心10分
钟,收集上清液置于2～8℃,可保存12小时,-20℃可保
存一个月。
（3）方法：
1）准：第一步，用1.1ml稀缓冲液溶解标准品；
第二步，再稀释100倍（取50ul，加稀缓冲液4950ul）；
第三步，用稀缓冲液等量稀释第二步。
2）释血浆制备：待测血浆50ul+稀缓冲液950ul( 稀20倍)—取200ul+等量第二步稀释标准液——混匀(又稀2倍)，25℃放置20分钟。
3）测定：
以1号孔调零点，在酶标仪上测定各孔A405值（4）数据处理：
A405
PAI相对活性
从标准曲线上查出PAI相对活性×40×1.1 [正常值] 0.35～0.8AU/ml。
医院检验中心组织型纤溶酶原激活剂活性测定发色底物法
医院检验中心组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）活性测定（发色底物法）
（1）原理：
纤溶酶原———————→纤溶酶
t-PA ↓水解
释放
发色底物（S2251）→硝基苯胺（PNA）—405nm
（2）标本处理：
2ml血置于含200ul抗凝剂（0.109 mol/L枸橼酸钠）的硅化管或塑料管中，3000ｒpm离心×10分钟—立即取200ul血浆+等量酸化剂—混匀—置2-8℃（保存12小
时）；或置-20℃保存一个月
（3）方法：
标准品的制备：t-PA标准品用2.2ml稀释缓冲液溶解，然后再稀释100倍(取50ul，加稀缓冲液4950ul)此
时t-PA标准品活性为2.5×10-2IU/ml。
按下表加入到平底酶标板上。
（浓缓冲液，用24ml蒸馏水稀释）。
稀释血浆的制备：用缓冲液将经酸化的待测血浆再稀释15倍。
（50ul酸化血浆，加700ul稀缓冲液）。
发色底物的制备：用2ml稀缓冲液将发色底物、共价物、纤溶酶原混合溶解在一起。
以1号孔调零点,在酶标仪上测定各孔A405值
（4）数据处理：
以A405对t-PA标准品活性作标准曲线，待测样品t-PA活性可从标准曲线上查出乘以15，再乘以2，再乘以1.1。
t-PA活性(×10-2IU/ml) [正常值]
0.3～0.6IU/ml。
凝血特殊项目临床意义
凝血特殊项目临床意义：
一．AT-Ⅲ抗凝血酶Ⅲ测定( 发色底物法)
正常参考值: 260～320mg/L 108.5±5.3%
AT-Ⅲ抗凝血酶Ⅲ测定( 凝固法)
正常参考值: 男性0.92±0.36u/ml;女性1.06±0.39u/ml
减少:1．先天性AT-Ⅲ缺陷,按AT-Ⅲ:Ag 和AT-Ⅲ:A 测定结果分为
CRM-型（AT-Ⅲ:Ag 和AT-Ⅲ:A 均减低）和CRM+型( AT-Ⅲ:Ag 正常而AT-Ⅲ:A减低) 2．获得性AT-Ⅲ缺陷：见于严重肝脏疾病、DIC、外科手术后、血栓前期和血栓性疾病( 心绞痛、心肌梗死、脑血管疾病、肾小球疾病、DVT、肺梗塞、妊高症等；
增高:见于血友病、口服抗凝剂和应用黄体酮等药物, 再生障碍性贫血,心瓣膜病, 尿毒症, 肾移植等。
二．FDP 纤维蛋白(原)降解产物测定(酶联免疫吸附试验)
正常参考值: 尿28±17ug/L
增高:在原发性纤溶亢进时FDP 可明显升高。
因高凝状态、DIC、肾
脏疾病、器官移植的排异反应、
溶栓治疗等所致之继发性纤溶亢进时FDP 含量亦升高。
三．D-dimer D-二聚体测定( 胶乳凝聚法：正常参考值: 0.25mg/L) （免疫渗滤法：正常参考值: 0.366±0.133mg/L ）
•减少:D-二聚体测定对于筛查深静脉血栓有重要作用,血浆D-二聚体
•若为阴性,可以有效地排除深
•静脉血栓的可能性。
•增高:DIC、肺栓塞、妇女先兆子痫、冠心病、肝脏疾病、ITP、慢性
•肾炎等均有不同程度的升高,
•对于这些疾病的诊断、治疗及疗效观察有一定的作用,但在陈旧性血栓形成患者•不升高。
发色底物法检测原理
发色底物法检测原理首先人工合成可以被待测凝血活酶催化裂解的化合物，且化合物连接上产色物质，在检测过程中产色物质可被解离下来，使被检样品中出现颜色变化，根据颜色变化可推算出被检凝血活酶的活性。
产色物质一般选用连接对硝基苯胺（PNA）。
游离的PNA呈黄色，其测定波长选用405nm。
在这一波长下，其它物质对光的吸收小于PNA对光吸收的1％。
具体检测方法即可采用动态法、也可采用终点法。
动态法即是连续记录样品的吸光度变化，算出单位时间吸光度的变化量，并以每分钟吸光度的变化来报告结果。
终点法即是指在活性酶同产色物质作用一段时间后，加入乙酸终止反应，检测此段时间内吸光度的变化，进而推算出待检酶的活性。
凝血仪上多数采用动态法，因为它比终点法简单、结果更为准确。
其优点主要表现在：用酶学方法直接定量、测定结果准确、重复性好、便于自动化和标准化、所需样品量小。
凝血仪使用产色物质在检测血栓／止血指标时大致可分成三种模式。
①对酶的检测：即在含酶的样品中直接加入产色物质，因为酶可裂解产色物质释放PNA，监测由于PNA释放而导致被检样品在405nm处光吸收的变化，就可推算样品中酶的活性。
如对凝血酶、纤溶酶等的检测。
②对酶原的检测：要对某种酶原进行测定，必须先用激活剂将其激活，使其活化位点暴露，才可将产色物质上的PNA裂解下来。
加入的激活剂必须过量，因为只有这样才能使酶原被全部激活，酶原的量才会同样品中酶的活性成一定的数量关系。
样品中酶的活性可通过PNA释放，即样品吸光度的变化反应出来，由此则可推算出样品中酶原的含量。
③对酶抑制物的检测：首先往待检样品中加入过量对应的酶中和该抑制物，剩余的酶可裂解产色物质释放PNA，监测由于PNA释放而导致光吸收的变化，就可测出酶的活性，进而可推算出样品中抑制物的含量。
如对抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）等。
法国HYPHEN BioMed公司生产的发色底物试剂,质量上乘,价格实惠!发色底物商品名注册名货号规格价格Thrombin /（Factor IIa）BIOPHEN CS-01(38) S-2238 229001 25mg ￥3000 BIOPHEN CS-01(81) - 229005 25mg ￥3000Factor Xa BIOPHEN CS-11(32) S-2732 229011 25mg ￥2000 BIOPHEN CS-11(65) S-2765 229014 25mg ￥2000 BIOPHEN CS-11(22) S-2222 229015 25mg ￥3000Activated Protein C (aPC) BIOPHEN CS-21(66) S-2366 229021 25mg ￥3000 Kallicrein BIOPHEN CS-31(02) S-2302 229031 25mg ￥2500 Plasmin / Plasminogen-SK BIOPHEN CS-41(03) S-2403 229041 25mg ￥2500 Factor IXa BIOPHEN CS-51(09) - 229051 25mg ￥2500 Urokinase BIOPHEN Cs-61(44) S-2444 229061 25mg ￥3000 tPA and broad spectrum BIOPHEN CS-05(88) S-2288 229091 25mg ￥2500microfluidic device。
一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒[发明专利]
![一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/37aeb0c8760bf78a6529647d27284b73f24236ef.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710521745.6(22)申请日 2017.06.30(71)申请人 上海贞元诊断用品科技有限公司地址 200000 上海市青浦区崧泽大道9959号三楼(72)发明人 赵铁铭 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569代理人 刘奇(51)Int.Cl.G01N 21/31(2006.01)(54)发明名称一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒(57)摘要本申请提供一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括蛇静脉酶、发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；蛇静脉酶的工作浓度为0.05～1U/ml；发色底物的工作浓度为0.05～3mmol/L。
本发明将蛇静脉酶加入样本血浆后会作用在凝血酶原上，产生一种具有活性的酶，这种酶裂解其发色底物产生吸光度信号。
所述试剂盒基于发色底物法实现监测血浆中达比加群含量变化。
由于所述试剂盒能够特异性反映达比加群对酶的抑制，从而实现快速准确检测达比加群含量，达比加群在0～500ng/ml范围内，R≥0.99，线性关系较好，所述试剂盒相对偏差小于1％，准确性高。
权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 107167439 A 2017.09.15C N 107167439A1.一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括蛇静脉酶、发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；蛇静脉酶的工作浓度为0.05～1U/ml；发色底物的工作浓度为0.05～3mmol/L。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛇静脉酶的工作浓度为0.1～0.5U/ml。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发色底物的工作浓度为0.5～2mmol/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的发色底物为H-D-CHG-Ala-Arg-pNA ·2AcOH、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA ·AcOH、H-D-CHG-But-Arg-pNA ·2AcOH、H-D-CHG-Pro-Arg-pNA ·2AcOH、H-D-CHA-Ala-Arg-pNA ·2AcOH、H-D-CHA-Gly-Arg-pNA ·2AcOH、CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA ·AcOH、H-β-Ala-Gly-Arg-pNA ·2AcOH、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA ·2HCl、pyroGlu-Pro-Arg-pNA ·HCl或H-D-Ala-Pro-Arg-pNA ·2HCl。
发色底物测定法检测血浆蛋白C活性的实验研究
发色底物测定法检测血浆蛋白C活性的实验研究
白中华;黄文瑶
【期刊名称】《昆明医学院学报》
【年(卷),期】1993(014)002
【摘要】本研究从七种发色底物中筛选出二种发色底物:PenfchromA和PenfchromB,并采用蛇毒激活物Protac建立起特异、快速的人血浆蛋白C活性的比色测定新方法,用于临床标本的测定,取得满意效果。
该方法试剂用量少,操作简便、迅速,结果稳定,适合于国内临床单位推广应用。
【总页数】5页(P54-58)
【作者】白中华;黄文瑶
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R446.112
【相关文献】
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发色底物法检测原理
首先人工合成可以被待测凝血活酶催化裂解的化合物，且化合物连接上产色物质，在检测过程中产色物质可被解离下来，使被检样品中出现颜色变化，根据颜色变化可推算出被检凝血活酶的活性。
产色物质一般选用连接对硝基苯胺（PNA）。
游离的PNA呈黄色，其测定波长选用405nm。
在这一波长下，其它物质对光的吸收小于PNA对光吸收的1％。
具体检测方法即可采用动态法、也可采用终点法。
动态法即是连续记录样品的吸光度变化，算出单位时间吸光度的变化量，并以每分钟吸光度的变化来报告结果。
终点法即是指在活性酶同产色物质作用一段时间后，加入乙酸终止反应，检测此段时间内吸光度的变化，进而推算出待检酶的活性。
凝血仪上多数采用动态法，因为它比终点法简单、结果更为准确。
其优点主要表现在：
用酶学方法直接定量、测定结果准确、重复性好、便于自动化和标准化、所需样品量小。
凝血仪使用产色物质在检测血栓／止血指标时大致可分成三种模式。
①对酶的检测：
即在含酶的样品中直接加入产色物质，因为酶可裂解产色物质释放PNA，监测由于PNA释放而导致被检样品在405nm处光吸收的变化，就可推算样品中酶的活性。
如对凝血酶、纤溶酶等的检测。
②对酶原的检测：
要对某种酶原进行测定，必须先用激活剂将其激活，使其活化位点暴露，才可将产色物质上的PNA裂解下来。
加入的激活剂必须过量，因为只有这样才能使酶原被全部激活，酶原的量才会同样品中酶的活性成一定的数量关系。
样品中酶的活性可通过PNA释放，即样品吸光度的变化反应出来，由此则可推算出样品中酶原的含量。
③对酶抑制物的检测：
首先往待检样品中加入过量对应的酶中和该抑制物，剩余的酶可裂解产色物质释放PNA，监测由于PNA释放而导致光吸收的变化，就可测出酶的活性，进而可推算出样品中抑制物的含量。
如对抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）等。