(新)残留除草剂的检测

出仪器量程而使测定范围变窄。 故本实验膜片面积选择4mm2。
检测范围
所检测的除草剂有阿特拉津、莠灭净、草净津、西玛 三嗪、扑草净、敌草隆和百草枯等，检测浓度范围分别为 0.25～1.75，0.04～0.70，0.10～1.10，0.10～0.80，0.20～ 1.80，0.01～0.12和0.006～0.02mg/L。
实验部分
叶绿体的提取和固定
将新鲜菠菜叶片破碎，分离出叶绿体，测定其中叶绿素 的含量。再利用PVA-SbQ 光聚合技术将叶绿体固定。
实验仪器
氧分析仪及氧电极 组织捣碎机 高速冷冻离心机 BH2型相差显微镜 超级恒温槽 H-600型透射电子显微镜 CliniBio-128oC酶标仪 UTL1386-3V型低温冰箱
实验部分
实验试剂和实验材料
PVA-SbQ规格如下：SbQ浓度为1.34×10－2mol/L， 固态物含量10.04％（质量分数w％），聚合度3500，皂 化度 88％；2 ，6－二氯酚靛蓝（DPIP ），使用前用水 配制成3×10－4mol/L；除草剂由原料用 2 ％乙醇溶液配 制，并用该乙醇溶液逐级稀释成工作液。其浓度分别为 百草枯、敌草隆各1 mg/L；阿特拉津、扑草净和莠灭津 各5mg/L 等。实验中所用试剂均为分析纯或生化试剂， 实验用水为蒸馏水；菠菜种子为香港的“超级菠菜”， 土壤培养8星期，株均重25 g，晴朗天气上午 9时取叶。
影响因素
叶绿体膜的活性
根据测得的PVA-SbQ固定化叶绿体膜催化降解过氧 化氢产生氧气的速率来计算膜的活性。本实验采用敌草 隆作为样品（以下实验除指明外，均采用敌草隆），结 果如图2。由图2可见，保存在-20oC冰箱中的PVA-SbQ 固定膜1个月内活性基本没有改变；5个月后，膜活性保 留仍超过50％，满足实际测定要求。
研究了 PVA-SbQ 光聚合物固定化叶绿体膜的性质， 结果证明该法固定的叶绿体束缚酶具有活性高、寿命长 和使用方便等特点。
聚乙烯醇—苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的
制备并用于残留除草剂检测
检测痕量除草剂的电流分析法
将叶绿体处理后用聚乙烯醇-苯乙烯吡啶 ( PVA -SbQ)聚 合膜进行固定 ，得到固定化的叶绿体膜，该膜中叶绿体束 缚酶能催化H2O2的分解产生氧 ，而除草剂对该指示反应有 抑制作用。利用氧电极 ，建立了新的用于检测痕量除草剂 的电流分析法。
实验方法
氧电极的内充液为0.5mol/L KCl溶液。首先用空气饱和Na2CO3 的蒸馏水和饱和溶液对氧测定仪进行满刻度调节和调零，然后取一 片 4mm2 叶绿体固定化膜（或相同叶绿素浓度的叶绿体悬浮液）放 入内体积为2mL的反应池中，加入pH＝7.4的Tris-HCl 5×10-3mol/L MgCl2缓冲溶液1.5mL，0.08mol/L H2O2100μL，加水至2mL。插入 氧电极，反应池外层通28oC恒温循环水，搅拌反应液3min，从记录 仪上读取放氧量P0。更换反应池中的溶液和固定化膜，用微量进样 器加入一定量的除草剂，测量P，计算 ∆ P= P0- P。每次测量都使用 新的叶绿体固定膜。测定装臵如图1。
过氧百度文库氢加入量的确定
利用叶绿体束缚酶在无光照的 条件下对 H2 O2 分解产生氧的 反应作为测定除草剂的指示反 应 ，因此 ，H2 O2 的加入量对 膜片面积对测定的影响 测定有较大影响 。当 H2O2 的 H2O2降解酶的量由PVA-SbQ固 -4 量小于 2.4×10 mol/L 时，反 定膜中叶绿体的数量决定 ，对 应的放氧量小，而使∆P很小， 于厚度固定的叶绿体膜 ，则由 测定的灵敏度较低 ；当 H2O2 膜面积的大小决定 。膜的面积 -4 的量大于6.0 × 10 mol/L 时， 增加，叶绿体浓度增大 ，产生 反应杯中的氧气产生量太大而 的氧浓度大 ，除草剂抑制酶反 使空白值增大，结果导致测定 应引起的 ∆P也增大，但膜片面 的检测范围很窄。综合考虑各 积达到6mm2 时，∆P反而减小。 种因素 ，确定 H2 O2 的浓度为 另外，体系的空白值过大时 ， -4 4.0×10 mol/L。 由于产生的氧浓度太大 ，易超
机理讨论
与除草剂对叶绿体光合作用 Hill 反应的抑制作用的机理 不同，实验中除草剂对叶绿体抗胁迫的抑制作用主要涉及到 如下的酶反应：
在抗坏血酸过氧化酶（AA-POD）的催化作用下，H2O2被抗 坏血酸（A A）氧化生成单脱氢抗坏血酸（MDA）。 MDA 可通过歧化作用生成AA和脱氢抗坏血酸（DHA）。而DHA 在脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的催化作用下，与还原性 谷胱甘肽（GSH）反应生成 AA，GSH 被氧化为氧化型谷胱 苷肽（GSSG）。GSSG则在 GR 的作用下利用叶绿体中大量 存在的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NADPH ）作为电子供 体重新生成GSH。除草剂在避光条件下的抑制作用主要是通 过与AA-POD和GR等相关酶结合来抑制这些酶的活性。
残留除草剂的检测
报告人：苏晓卉
聚乙烯醇—苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的
制备并用于残留除草剂检测
实验原理
在非光照条件下 ，叶绿体具有降解双氧水的抗胁迫能 力，即叶绿体束缚酶能催化双氧水分解产生O2，而绝大多 数除草剂对该反应有较强的抵抗作用。
反应方程式 2H2O2
叶绿体束缚酶
2H2O ＋ O2
特点
影响因素
叶绿体膜的活性
溶液pH值的影响
叶绿体中酶抗胁迫 能力在中性和弱碱 性溶液中表现最强 磷酸盐缓冲液 硼酸盐缓冲液 Tris-HCl缓冲液 碳酸氢盐缓冲液
溶液pH为7.4时，除草剂的抑制作 用最明显，放氧量差值达最大 本实验选择pH为7.4 确定采用 Tris- HCl缓冲液
温度的影响
温度对叶绿体束缚酶对H2O2的抗胁迫作用和 除草剂对该指示反应的抑制作用都有影响，故对 测定结果也有影响。实验表明：在5 ～ 27oC，随 温度升高空白溶液和含除草剂体系溶液的放氧量 都增大，且∆P也随着增大。但温度高于27oC时， 由于空白溶液的放氧量增加过快，∆P反而逐渐减 小。故选择测定温度为27oC。