全长cDNA主要构建方法的比较

全长cDNA主要构建方法的比较

摘要全长cDNA文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径,克服了传统cDNA 文库的缺点,本文主要介绍了两种较为实用的方法，分别是SMART法和Cap trapper法。

关键词：全长cDNA构建SMART法Cap trapper法

随着测序技术和计算机科学的不断发展，大部分生物和人类的基因组全序列测定高速完成。cDNA作为基因克隆的一种重要工具，在帮助人们更好的发现新基因和研究基因功能上发挥了巨大的作用。但是，由于传统的cDNA由于反转录能力差，cDNA酶切位点保护不彻底和非cDNA片段插入导致克隆片段短、无效克隆多和全长率低等缺点,因而无法满足大规模、高通量、高效的功能基因组研究需要。而全长cDNA序列大多数拥有5’和3’端非编码区序列,因而弥补了传统cDNA文库构建方法的缺陷,成为目前基因克隆的一种重要方法。

目前主要有CAPture法，Oligo capping法，SMART法，Cap jumping法以及Cap trapper 法。本文主要介绍优点突出的两个方法，SMART法和Cap trapper法。

SMART 方法

SMART 方法是Chenchik 等1996 年提出的[3]，该方法利用PowerscriptTMRT 反转录酶的反转录、末端转移活性和内切酶sfiⅠ的特性，快速、简单地构建全长cDNA 文库。PowerscriptTMRT 反转录酶是M-MLVR点突变而来的，丧失了RnaseH 的活性，但保留着野生型聚合酶转移酶的活性，能够长距离的反转录，又可识别mR-NA5’帽子结构。原始一链合成中，转移酶的活性低，延伸效率低。用于反转录的5’端poly(A)引物和延伸模板分别含有sfiI（A）、sfiI（B）识别位点的寡聚核苷酸序列。而截短的一链cDNA，反转录酶没有识别到mRNA5’帽子结构，一链cDNA3/ 端不能被延伸、合成和扩增二链。两端含有sfiI 识别位点的全长cDNA，经两种类型（A、B）内切酶sfiI 酶切，使两端产生不同的粘性末端，而全长cDNA 内部由于sfiI 识别位点在基因组中很少见而得以保护，这样就实现了目的全长基因的高效定向克隆。与其他方法相比，此方法有其独特的优点（1）所需起始材料少，一般0.5~1μg mRNA（2）mRNA 在合成cDNA 前无需任何酶反应或化学反应处理，不会导致处理过程中mRNA 的降解和损耗。（3）实验过程快速、简单，整个过程没有对mRNA 和中间产物的复杂处理。（4）全长比例较高[13]。SMART 方法也有其自身明显的缺点（：1）PCR 扩增具有选择性，不利于长片段序列的扩增，使一些长片段的全长基因丢失，不易得到大于3kb 片段和低峰度

全长基因[13]2）dG 加尾效率低，导致文库中基因信息丢失，文库缺乏代表性。在实际应用中，该方法快速、简单的优点使之广受青睐[14~17]，尤其是在医学领域中应用较广[18~20]。

4 CAP- trapper 方法

CAP-Trapper 方法是由 Carninci 等提出的[4]，它是根据mRNA5’端及3’端存在一个共同二醇结构来建库。将这种二醇结构氧化后进行生物素修饰, 再经过沉淀、酒精洗涤、无RNase 的双蒸水重新悬浮等筛选步骤, 得到生物素化的 mRNA，经反转录酶催化合成 cD-NA 第一链，接着进行 RNaseI 处理, 未被 cDNA 保护的 mRNA 被降解。后经青链霉素磁珠吸附并使用弱碱降解 mRNA，得到单链全长 cDNA，在末端转移酶的催化下进行5’端Oligo(G)加尾，再进行第二链的合成，定向克

隆即可得到全长cDNA文库。

为了提高合成全长 cDNA 的能力和测序效果，该方法进行了改进。一是用海藻糖、山梨糖醇热启动反转录反应。mRNA 5’端二级结构阻碍反转录的进行，高温破坏二级结构但同时也抑制反转录酶活性。海藻糖的加入，尤其是再附加山梨糖醇可以保证反转录酶的活性在55~60℃的高温下正常发挥，有利于全长cDNA 的合成。二是用 Ssth 或 BsaI、BamHl\Xhol 双酶切替换 EcolI\Xhol 双酶切。EcolI 对甲基化不敏感，容易将全长 cDNA 近端的内部已甲基化的识别位点切割。用对甲基化敏感的限制性内切酶 Ssth 或 BsaI、BamHl 等替换EcolI，提高了文库全长比例。三是用SSLM 法加尾克服 Oligo(G)加尾对测序的干扰[25]，虽然加尾效率（ 44%）稍抵于 Oligo(G)加尾（ 52%），但该法加尾对片段无选择性，且加尾时无须使用 MnCl2 和CoCl2，不会造成全长 cDNA 降解，还利于全长 cDNA

的转录和表达克隆[26,27]。

与其他方法相比，CAP-Trapper 方法可以说是一种较好的构建高质量全长文库方法，它兼顾了文库代表性好，全长比例高，建库效率高的优点[13,28]。但也有些缺点（：1）mRNA 长期暴露在酶反应体系中，有降解风险（；2）各反应难于控制，所需实验技术高（；3）实验流程长，过程

复杂，耗时，费力。

由此可见，从这些文库中，研究者们不仅获得了大量有价值的全长序列，对其功能基因组进行深入研究，而且对基因组结构进行了预测。可见，构建高质量的全长cDNA文库会带来一劳永逸的效果。

参考文献：

董志敏等，全长cDNA文库的构建方法【J】.中国农学通报，2006,22（2）：51-55

毛兴国等，几种全长cDNA文库的构建方法【A】。遗传，2006,28（7）:865-873

朱利军等，全长cDNA文库构建方法及应用研究【A】。海南大学学报自然科学版，2009，27

（2）：185-190

Carninci P, Kvam C, Kitamura A, et al. High efficiency full length cD-NA cloning by biotinylated CAP trapper [J].Genomics, 1996, 37 (3): 327~336

Carninci P, Nishiyama Y, Westover A. Thermostabilization and ther-moactivation of thermolabile enzumes by thehalose and its application for the synthesis of full length cDNA[J]. Proceedings of the National A-cademy of Sciences, 1998, 95:520~524 Carninci P, Hayashizaki Y. High efficiency full-length cDNA cloning[J]. Methods Ezymol, 1999, 303:19~44