基因工程制胰岛素(生工版)资料
利用生物工程法制备重组胰岛素
串联BKRA基因的构建
• 为进行，合成了彼此互补的两个片段：
• 然F后7：将CTG磷GA酸G A化AC的TAFC 7TG与T A等AC摩CG尔T C的GC F正8向退链 火，中间 F8：AAT TGC GAC GGT TAC AGT AGT TCT CCA G 反向链
5’ -CTG GAG AAC TAC TGT AAC CGT CGC-
GTC ACA
TGC终A止CC TCC ATC TGC TCC CTT TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGT
人胰岛素原类似物BKRA基因的克隆
• 分别以EcoRⅠ- HindⅢ双酶切pUC18 DNA和上述构
建的BKRA基因片段（182bp），将载体DNA与BKRA 片段（171bp）连接，获得重组质粒pUCⅠ。分别经 EcoRⅠ-HindⅢ双酶切和PvuⅡ不完全酶切鉴定，均产 生了与 其大小的DNA片段。
GGC TTC
小C肽
GAG CAT CTT CGA GAC ATG GAC CAA ACG CCA CTT GCA
CCG AAG
Lys Arg
PvuII F7F8接头
TTT TAC ACT CCG AAA ACT AAG CGC GGT ATC GTT GAA
CAG TGT
AAA ATG TGA GE*GC TTT TGA TTC GCG CCA TAG CAA CTT
串联BKRA基因的构建
• 为了正确连接两个BKRA基因，在此设计了一个
连接头接在前一个BKRA基因的末端，并构建了 一个能与下一个BKRA基因5’端EcoRI粘端互补 的序列。
• 然而由于接头是在PvuII平末端与前一个BKRA
基因连接的，因此会切掉部分胰岛素A链基因， 所以接头要补上相应的部分。
基因工程获取胰岛素的主要步骤
基因工程获取胰岛素的主要步骤胰岛素是一种由胰岛β细胞分泌的蛋白质激素，对调节血糖水平起着重要作用。
胰岛素的分子结构由两个多肽链组成，分别为A链和B链，通过二硫键连接在一起。
A链含有21个氨基酸残基，B链含有30个氨基酸残基。
胰岛素的结构决定了它的生物活性和稳定性。
基因工程是一种利用DNA技术对目标基因进行修饰和重组的方法，可以大规模生产胰岛素。
以下是基因工程获取胰岛素的主要步骤：1. 基因克隆：首先需要从人体或其他来源中获得胰岛素基因的DNA 序列，然后使用PCR技术扩增所需基因片段。
扩增后的基因片段将被插入到一个载体中，如质粒或病毒。
质粒是一种环状DNA分子，可以在细菌中进行复制和表达。
2. 转化宿主细胞：将质粒或病毒载体导入宿主细胞中，使其拥有胰岛素基因。
最常用的宿主细胞是大肠杆菌，因为大肠杆菌具有较高的转化效率和易于培养的特点。
3. 表达胰岛素基因：在宿主细胞中，胰岛素基因将被转录成mRNA，随后翻译成胰岛素蛋白。
为了提高胰岛素的表达水平，可以使用启动子和增强子等调控元件来增强基因的表达。
4. 纯化与结构修饰：经过表达后，胰岛素蛋白可以通过离心、层析和过滤等手段进行纯化。
纯化后的胰岛素蛋白需要进行结构修饰，如对A链和B链进行二硫键的形成，以及其他可能的糖基化修饰。
5. 活性检测与质量控制：获取的胰岛素蛋白需要进行活性检测，以确保其具有正常的生物活性。
同时，还需要进行质量控制，如测定蛋白的纯度、含量和杂质的检测。
6. 大规模生产与制剂开发：经过活性检测和质量控制后，胰岛素蛋白可以进行大规模生产。
生产过程中需要考虑生产工艺、设备的选择和合理的工艺优化。
同时，还需要开发适合临床使用的胰岛素制剂，如注射剂、胰岛素泵等。
通过基因工程获取胰岛素的方法使得胰岛素的大规模生产成为可能，不仅能够满足临床需求，还能够提高胰岛素的纯度和质量稳定性。
基因工程技术的不断发展也使得胰岛素的生产成本逐渐降低，更加便于患者的使用。
胰岛素制备原理
胰岛素制备原理
胰岛素的制备原理主要基于生物合成技术和基因工程技术。
传统的胰岛素制备方法是从动物（如猪或牛）的胰腺中提取胰岛素，但这种方法存在纯度较低、含有杂质等问题。
随着生物技术的发展，人们开始使用基因工程技术来生产胰岛素。
具体来说，将人胰岛素基因转移到细菌或酵母菌中，利用发酵工艺大规模生产胰岛素。
这种方法的优点是能够大规模生产高纯度的胰岛素，是目前最主要的胰岛素制备方法。
此外，第三代胰岛素类似物的制备原理是在第二代人胰岛素的基础上，通过改造氨基酸顺序来生产。
这些类似物在结构和功能上与天然胰岛素相似，具有更好的药代动力学特性和治疗效果。
总的来说，胰岛素的制备原理主要包括提取、基因工程和发酵工艺等技术手段，通过这些方法可以生产出高纯度、高效的人胰岛素及其类似物。
人胰岛素的制备生物技术制药
发酵液
胞内产物
细胞破碎 固液分离
细胞分离
溶菌酶／超声破碎细胞 高速离心
包含体 变性 复性
洗涤 变性剂&离子 型去污剂
细胞碎片分离
变性
变性剂（尿素）
复性 二次复性法
胞外产物
透析浓缩
再复性及酶转化
高度纯化 制剂
15
二次复性法：0．5g包涵体溶解于一定量的缓冲液B(50mmol／L Gly—NaOH，8 mol／L尿素，B_巯基乙醇，pH 9．5)中，使之充分混悬， 静置1小时以上。混悬液分步逐滴加入到缓冲液C(50mmol／LGly-NaOH， 半胱氨酸一胱氨酸，pH 9．5)中，4℃静置复性过夜。上样于已用50mmol／L Gly—NaOH(pH 9．5)平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用0．1mol／L 的氯化钠梯度洗脱，通过SDS-PAGE确定RRhPI位置，用DEAE-Sepharose FF做离子交 换层析，收集含RRhPI的洗脱峰2，层析图谱见（图6）。电泳检测显示(图11)峰2 主要为RRhPI，及少量高分子杂质，收集峰2做再复性。峰1为pH高于9．5及一些疏 水性蛋白质形成的穿透峰，绝大部分pH低于RRhPI的蛋白质和核酸类杂质则牢固 地结合在柱子上，在较高盐浓度及2mol／L NaCl的条件下被洗脱下来，形成其他 峰3和峰4。
4
（二）mRNA转录合成cDNA第一链
cDNA 第一链的合成 加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-
free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应 体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA酶抑 制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素利于检 验）， 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置 于冰上。电泳分析，同位素活性测定。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典]
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基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典] 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一，背景知识1，基因工程科技名词定义中文名称:基因工程英文名称:genetic engineering;gene engineering其他名称:重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) 定义1:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
定义2:将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。
扩充:基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有:(1)外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。
这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分;(2)适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。
基本操作步骤(上游技术)提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
胰岛素制备
生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。
胰岛素的制备
二 . 人胰岛素原及其类似物 在E.coli表达系统中的表达
为了使表达的胰岛素原稳定采取了下列方法： １．构建双Ｃ肽的人胰岛素基因 ２．构建融合蛋白基因（其他蛋白基因＋胰岛素 原基因） ３．构建胰岛素原基因串
（一）Met－Lys－双Ｃ肽人胰岛素原基因 的构建表达及分离纯化
在研究胰岛素的结构与生物功能的关系中，过 去人们一直认为C肽含有 使胰岛素二硫键正确 配对足够的结构信息。我国科学家在成功地解 决胰岛素 的A、B 链重组问题及随后对交联胰 岛素的研究后，人们对“C肽含有使 胰岛素二 硫键正确配对的足够的结构信息”这一论点产 生了质疑。
一、 人胰岛素原在Pichia pastoris （毕赤酵母）中的表达
毕赤酵母是一种甲醇营养酵母， 用酵母合成胰岛素的主要优点是可以进行体内加工形 成二硫键的正确配对，产物分泌到培养基中，下游纯 化比较简单。 甲醇诱导醇氧化酶(Alcohol Oxidase)，AOX的表达是 在转录水平上调控的，其启动子(PAoxl)属诱导型启动 子，能非常有效的控制外源基因的表达。不仅能克服 强启动子在宿主细胞内大剂量表达外源蛋白，会导致 宿主细胞受损，甚至死亡的缺点，而且能高水平表达。
2．2 表达质粒转化酵母SMDl168菌 制备酵母感受态细胞，再将带有外源基因的穿梭 质粒线性化，(可用BglⅡ酶切)。可用电激法，也可用 invitrogen公司提供的转化试剂盒进行转化。 然后在RDB选择培养基上筛选。——般酵母转化 菌需在28—30℃长2—4天。
2．3．1 酵母生长期 将转化菌在BMG培养基中生长至OD600=4—6时， 4℃离心3000g，5min，弃上清。 2．3．2 诱导表达期 弃上清，菌体重新培养于l／5原体积的BMM培养 基中进行诱导。每隔24小时，加0.5％体积的诱导剂— 甲醇，诱导时间在100h以上。 2．3．3 SDS-PAGE凝胶电泳分析 4℃离心7000g，5min，留上清，电泳分析。 2．3．4 超滤浓缩与分子筛分离纯化胰岛素原。
基因工程--胰岛素
胰岛素能降低人体血糖的含量。
糖尿病患者是由于胰腺的β细胞不能分泌胰岛素，使患者血糖过高，继而带来吃得多、喝得多、尿得多、体重减少(即三多一少)的一系列临床症状。
糖尿病的死亡率仅次于心脏病和癌症。
19世纪以前，糖尿病像妖魔一样肆意夺走人们的生命，那时糖尿病患者的平均生存时间仅4．9年，面对这旷日持久的大浩劫，人类一筹莫展。
1921年，加拿大医生班廷(Banding)取两条狗的胰脏，将之搅碎过滤，并收集少量液体注射到一只已经出现糖尿病昏迷的小狗身上，奇迹发生了，昏迷的小狗血糖开始下降，当液体注射完毕，世界上第一只从糖尿病昏迷状态下苏醒过来的小狗就站起来跑开了。
从狗胰脏收集的“神奇”液体，就是我们现在使用的胰岛素。
1922年1月班廷第一次使用从牛胰脏中提取的胰岛素，对一个患糖尿病2年，已被医生放弃的男孩进行治疗，结果“药到病除”。
全世界为这个划时代的医学成果而欢呼!班廷也由此荣获1923年诺贝尔生理学和医学奖。
胰岛素治疗糖尿病至今仍然是临床上最有效的方法。
过去，胰岛素主要靠从猪等大家畜胰腺中提取。
从一头猪的胰腺中只能提取出300单位胰岛素，而一个病人每天就需要40单位胰岛素，因此远远不能满足需要。
图7-1 胰岛素生成图大肠杆菌说：给我一个基因，我将源源不断给你药物”基因工程技术一问世，科学家就想到利用该技术来解决胰岛素药源不足的问题。
他们首先要找到胰岛素基因，在人的胰岛细胞里有一段特定结构的DNA分子指挥着胰岛素的合成，然后又找到在人的大肠里存在对人体无害的大肠杆菌。
把人的胰岛素基因转入到大肠杆菌的细胞中，随着大肠杆菌的繁殖，胰岛素基因也一代代的遗传下去。
大肠杆菌繁殖速度相当快，大约20分钟就能繁殖一代，把它放到大型的发酵罐里进行人工培养，就可以大量繁殖，并且生产出大量人的胰岛素(图7．1)。
实际上这种大肠杆菌是经过改造已经带上新的遗传性状的细菌，称为基因工程菌。
1978年美国的吉尔伯特研究组用此方法成功地生产了鼠胰岛素，随后依塔库拉研究组用相同方法生产出了人的胰岛素。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的
研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究是利用基因工程
技术将人类胰岛素基因导入大肠杆菌细胞中，并使其表达和分泌人类
胰岛素。
研究的具体步骤如下：
1. 克隆：将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌中的表达载体上，构建重
组胰岛素的基因工程菌株。
2. 表达：将重组胰岛素基因工程菌株进行培养和诱导表达，启动胰岛
素基因的转录和翻译，使其合成胰岛素多肽链。
3. 折叠：由于胰岛素中存在多肽链的结构，其需要正确折叠形成活性
结构。
通过培养条件的调控和辅助分泌蛋白的表达帮助胰岛素多肽链
正确折叠。
4. 分泌：经过折叠的胰岛素多肽链进入细胞分泌途径，通过胞外酶切，胰岛素分泌至外部培养液中。
5. 纯化：将培养液中的胰岛素进行纯化，去除其他杂质，得到纯度较
高的重组人胰岛素。
这种方法相比其他表达系统有以下优势：
1. 大肠杆菌生长快速且易于培养，并且具有可高效表达外源基因的能力。
2. 人类胰岛素的基因序列已经大量研究，其表达也相对成熟和稳定。
3. 大肠杆菌发酵工艺相对简单，易于工业化生产。
4. 经过纯化的重组胰岛素具有较高的活性和纯度，适用于临床应用。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典]
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典] 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一，背景知识1，基因工程科技名词定义中文名称:基因工程英文名称:genetic engineering;gene engineering其他名称:重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) 定义1:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
定义2:将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。
扩充:基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有:(1)外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。
这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分;(2)适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。
基本操作步骤(上游技术)提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究一、概述基因工程是一种革命性的生物技术，它允许科学家在分子水平上对生物体进行精确的操控和改造。
自从20世纪70年代基因工程技术诞生以来，它已广泛应用于医药、农业、工业等领域，为解决人类面临的诸多挑战提供了新的途径。
利用基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素是基因工程在医药领域的一个重要应用。
重组人胰岛素是一种通过基因工程技术生产的人胰岛素类似物，具有与天然人胰岛素相似的生物活性。
它主要用于治疗糖尿病等代谢性疾病，具有广阔的市场前景和重要的社会价值。
与传统的动物源胰岛素相比，重组人胰岛素具有纯度高、稳定性好、免疫原性低等优点，因此备受关注。
在大肠杆菌中发酵生产重组人胰岛素的过程涉及多个关键步骤，包括基因克隆、表达载体的构建、宿主细胞的选择、发酵条件的优化等。
通过这些步骤，可以实现重组人胰岛素的高效表达和分泌，从而生产出符合治疗要求的胰岛素产品。
本文旨在探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展、技术原理、工艺优化以及未来的发展趋势。
通过深入了解这一领域的研究现状，可以为重组人胰岛素的生产提供理论支持和实践指导，进一步推动基因工程技术在医药领域的应用和发展。
1. 重组人胰岛素的重要性和应用背景重组人胰岛素，作为一种生物技术产品，在医学领域具有极其重要的地位。
它是通过基因工程技术，将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌等微生物体内，使其能够生产与人体胰岛素功能相似的胰岛素。
这种胰岛素在治疗糖尿病方面发挥着至关重要的作用。
糖尿病是一种全球性的健康问题，影响着数以亿计的人口。
根据国际糖尿病联盟（IDF）的数据，全球约有62亿成年人患有糖尿病，预计到2045年这一数字将增至7亿。
糖尿病的治疗需要长期使用胰岛素，而重组人胰岛素因其与人体胰岛素的高度相似性，成为糖尿病治疗的首选药物。
重组人胰岛素的应用背景源于对胰岛素需求的不断增长。
在重组人胰岛素出现之前，糖尿病患者主要依赖从猪或牛体内提取的胰岛素进行治疗。
胰岛素制备
胰岛素制备 Prepared on 22 November 2020生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
基因工程制胰岛素生工版
2．提取RNA，分离RNA
2．1 总RNA的提取
2．2 mRNA的纯化
2．3 mRNA的保存
2021/6/4
11
一、获取外源目的基因片段
2．1 总RNA的提取
总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广 泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成， 可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的 RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯 酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活 性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、 β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。 TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂， 在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。 提 取 RNA 时 ， 首 先 用 液 氮 研 磨 材 料 ， 匀 浆 ， 加 入 TRIzol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加 入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有 RNA 的 水 相 ， 通 过 异 丙 醇 沉 淀 ， 可 获 得 比 较 纯 的 总 RNA，用于下一步mRNA的纯化。
配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。
方法三： 需体外折叠。
2021/6/4
7
基因工程获取胰岛素的步骤
一、获取外源目的基因片段 二、选择与获取表达载体 三、重组目的DNA片段与表达载体 四、选择与获取表达细胞 五、重组体导入表达细胞 六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定 七、工程菌产物鉴定和保存 八、发酵培养
③ 十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动， 若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
④ 寡聚（dT）纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依 次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。
基因工程制备胰岛素2
2、用基因工程 E．coli 发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成 hI。
E． coli 系统表达量高，但缺点是不利于表达 hI 这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白 形式将 hPI 连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活 性的 hi； 3 、通过基因工程酵母菌发酵生产 hPI ，经后加工形成 hI 。酵母系统下游后加工比细菌表 达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少 (1 ～ 50 mg ／ L) ，产量低。 因此，虽然 rhI 投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的 表达策略 I2 J ，尤其是对
中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基 因从原 DNA 中分离。主要有如下 4 种方法： （ 1 ）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。 至于如何筛选，用 DNA 分子杂交，即 DNA 探针 （ 2 ）人工合成法：根据转录蛋白或者 mRNA 推导出基因序列，然后人（ 4 ） PCR 扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作 …… 2 、提取质粒：使用细胞工程 , 培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为 环状。主要有如下 2 种方法： （ 1 ）碱裂解法：此方法适用于小量质粒 DNA 的提取，提取的质粒 DNA 可直接用于 酶切、
E ． CO 一尻表达系统的研究更是越来越深入，用 E ． coli 系统表达 hPI 的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂 的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。 本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量， 简化 下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程 E ． coli 发酵表 达 (His)6 一 Arg — Arg 一人胰岛素原 [(His)6 一 Arg — Arg — human proinsulin ， PPh — PI] ，后加工 成 hI 的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1 、提取目的基因：既从人的 DNA
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表达产物的后 期处理路线：
2017/8/29
6
基因工程制胰岛素三种方法
三、A链和B链同时表达法
2017/8/29
7
基因工程制胰岛素三种方法
三种方法比较：
方法一： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二 硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此成 本高。
方法二： 胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正 确配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。
2017/8/29 11
一、获取外源目的基因片段
2．提取RNA，分离RNA
2．1 总RNA的提取 2．2 mRNA的纯化
2．3 mRNA的保存
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一、获取外源目的基因片段
2．1 总RNA的提取
总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广 泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可 以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的 RNA释 放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯酚虽可有 效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 TRIzol 中还加入了 8 －羟基喹啉、异硫氰酸胍、β- 巯 基乙醇等来抑制内源和外源 RNase （ RNA 酶）。 TRIzol 是从细胞和组织中提取总 RNA的即用型试剂，在样品裂 解或匀浆过程中， TRIzol 能保持 RNA 完整性。提取 RNA 时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入 TRIzol 试剂， 进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提， 离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过 异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA 的纯化。
1．选择实验材料 2．提取RNA，分离RNA 3．逆转录mRNA,得cDNA第一链 4．得双链DNA 5．DNA序列纠错 6. 目的基因通过细胞克隆扩增 7. 目的基因回收及DNA测序，最终目的 基因获取
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一、获取外源目的基因片段
1．选择实验材料 胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛 素是胰岛B细胞（即胰岛β细胞）受内 源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核 糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分 泌的。胰岛素基因只有在胰岛B细胞中 才能转录出信使RNA，所以用基因工程 方法生产胰岛素时，选用胰岛B细胞为 获取目的基因的实验材料。
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一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程图
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一、获取外源目的基因片段
2．2 mRNA的纯化
该方法利用mRNA 3＇端含有PolyA（多聚腺苷 酸）的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时， 在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结 合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。 经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的 mRNA。
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一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA （1）试剂准备： ① 3M醋酸钠（pH5.2）； ② 0.1M NaOH； ③ 上样缓冲液：20mM Tris-HCl（pH7.6）,0.5M NaCl,1M EDTA (pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸钠)。配制时可先配制 Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压 消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至 65℃，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%； ④ 洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl（pH7.6），1mM EDTA （pH8.0），0.05%SDS； ⑤ 无水乙醇、70%乙醇； ⑥ DEPC（0.1%焦炭酸二乙酯）
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基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
化学合成 A链和B链
的编码序
列
2法
一、A链和B链分别表达法
表达产
物的后
期处理 路线：
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基因工程制胰岛素三种方法
二、人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
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基因工程制胰岛素三种方法
方法三： 需体外折叠。
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基因工程获取胰岛素的步骤
一、获取外源目的基因片段 二、选择与获取表达载体 三、重组目的DNA片段与表达载体 四、选择与获取表达细胞 五、重组体导入表达细胞 六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定 七、工程菌产物鉴定和保存 八、发酵培养
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一、获取外源目的基因片段
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一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程 （1）样品处理① 培养细胞：收获细胞1-5*10^7，移入 1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol，混匀，室温静臵5min。 ② 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组 织均可）臵1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol充分匀浆，室 温静臵5min。 （2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静臵2min。 （3）4℃离心，12000g*15min，取上清液。 （4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静臵 10min。 （5）4℃离心，12000g*10min，弃上清液。 （6）加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g*5min， 弃上清液。 （7）晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。
用基因工程方法 获得胰岛素
第四组
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胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性 物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、 胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白 质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖 的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质 合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治 疗。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因 子具有高度生物活性，分子量很大，立 体结构异常复杂，体外难以人工合成。 所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪 体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰 岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪 胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期 服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用 基因工程方法获得重组人胰岛素进行治 疗。