水蛭素对人增生性瘢痕成纤维细胞作用的实验研究

广西医学 2011 年 3 月第 33 卷第 3 期
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水蛭素对人增生性瘢痕成纤维细胞作用的实验研究▲
张 奇 刘达恩 王家瑞 农庆文 李开通 梁坤兰
（ 广西医科大学第一附属医院烧伤整形科，南宁市 530021）
【摘要】 目的 探讨水蛭素对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞（ HSFb） 凋亡的作用。方法 分离培养 HSFb 取 4 ～ 7 代细胞实验。分别采用免疫细胞化法及 Western blot 法检测不同浓度水蛭（ 0 ml、0． 25 ml、1． 00 ml） 对 HSFb、Bax、Bcl-2 基因表达的影响。结果 水蛭素对 HSFb 的增殖有抑制作用； 免疫组化实验及 Western blot 法 检测均表明： 水蛭素能增加 Bax 表达，抑制 Bcl-2 表达，和对照组比较差别有统计学意义（ P ＜ 0． 05） 。结论 实验 浓度水蛭素对 HSFb 有显著的抑制作用。
1 材料与方法
1． 1 实验材料器械 水蛭素（ 广西医科大学实验中 心） ，20% DMEM 培养基（ 美国 Gibco 公司） ，胎牛血 清（ 杭州四季青生物材料研究所） ，四甲基偶氮唑盐、 EDTA（ 美国 Amersco 公司） ，小鼠抗人 Bcl-2、Bax 单 克隆抗体（ 美国 Santa Cruz 公司） ，Western blot 检测 试剂盒（ 武汉博士德公司） ，Bax、Bcl-2 抗体、S-P 超敏 试剂盒、DAB 显色液（ 福建迈新生物技术开发有限公 司） 。倒置光学显微镜（ 日本 Olympus 公司） ，电子天 平（ 美国 PTAST 公司） ，96 孔培养板（ 加拿大 Biofil 公 司） ，电泳槽、凝胶成像系统（ 美国 Bio-Rad 公司） 。 1． 2 实验方法 1． 2． 1 标本收集： 2009 年 6 ～ 12 月在广西医科大学进
【Key words】 Hypertrophic scar； Hirudin； Fibroblast； Bax； Bcl-2
增生性瘢痕（ hypertrophicscar，HS） 是创伤后，尤其 是深度烧伤后最常见的一种病理性愈合现象，其本质 是成纤维细胞（ fibroblast，FB） 的异常增殖和细胞外基 质的过度沉积。目前尽管对增生性瘢痕的发病机制和 治疗手段进行了大量研究，但仍没有理想的结果。因 此寻求有效防治增生性瘢痕的方法是创伤修复领域的 重要课题。经研究表明水蛭素具有抑制器官纤维化、 抗炎等作用［1］。本实验在体外培养增生性瘢痕成纤维 细胞（ hypertrophic scar fibroblast，HSFb） 后加入不同浓 度的水蛭素，通过观察细胞形态、免疫细胞化学染色 及 Western blot 法检测 HSFb 中 Bax 和 Bcl-2 的表达， 探讨水蛭素对体外培养的 HSFb 凋亡的作用，为临床 治疗 HS 提供理论依据。
【关键词】 增生性瘢痕； 水蛭素； 成纤维细胞； Bax； Bcl-2 【中图分类号】 R 282． 74 【文献标识码】 A 【文章编号】 0253-4304（ 2011） 03-0261-04
Effect of Hirudin on Human Hypertrophic Scar Fibroblast
图 2 水蛭素对 Bcl-2 蛋白 Western blot 图
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3讨论
水蛭素是 1884 年 Haycraft［2］首先在水蛭的提取 物中发 现 的 一 种 含 有 抗 凝 血 作 用 的 物 质，它 是 由 65 ～ 66个氨基酸组成的小分子蛋白质。水蛭素肽链 中部有一个由 Pro-Lys-Pro 组成的特殊序列，不被一 般蛋白酶降解。水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成， 并能阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应 等瘀血现象，能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖 和凝血酶 对 内 皮 细 胞 的 刺 激。 与 肝 素 相 比，它 用 量 少，不会引起出血，也不依赖内源性辅助因子； 而肝素 则有引起出血的危险，在弥散性血管内凝血的发病过 程中抗凝血 酶 Ⅲ 往 往 减 少，这 将 限 制 肝 素 的 应 用 范 围。因此，水蛭素是一种很有前途的抗凝化瘀药物， 可用于治疗各种血栓性疾病，尤其是静脉血栓和弥漫 性血管凝血，还可用于预防手术后及溶解血栓后或血 管再造后血栓的形成，改善体外血液循环和血液透析 的过程。
【Abstract】 Objective To explore the effect of hirudin on the apoptosis of the human hypertrophic scar fibroblast （ HSFb） cultivated in vitro． Methods Experiment of isolate cultivating HSFb and cells after 4 － 7 generations were used in subsequent experiments． The expression of Bax and Bcl-2 in HSFb were analyzed by Western blot． Results Hirudin had an inhibitive effect on the proliferation of HSFb； Immunohistochemistry and Western blot results showed that hirudin increased the expression of Bax，but inhibited the expression of Bcl-2，compared with the control group，the difference was statistically significant （ P ＜ 0． 05） ． Conclusion Hirudin of experimental concentration has significant inhibitory effects on HSFb．
集、呈平行极性排列，细胞晕清晰，形态规则，有扁平
而长的突 起。 用 药 组 随 药 物 浓 度 加 大，细 胞 间 隙 增
宽，细胞缩小，突起缩短，细胞变圆，胞浆减少，胞核模
糊。 2． 2 免疫组化染色法检测成纤维细胞中 Bax、Bcl-2
基因所产生的蛋白 水蛭素浓度为 0 ml、0． 25 ml、 1 ml时，随着水蛭素浓度的升高，Bax 基因蛋白表达 逐渐增加，Bcl-2 基因蛋白表达逐渐降低，组间比较差 异有统计学意义（ P ＜ 0． 05） ，见表 1。
▲基金项目： 广西科学基金（ 桂科自 0728110） 通信作者： 刘达恩（ 1962 ～ ） ，男，硕士研究生，主任医师，教授。研究方向： 大面积烧伤抢救与治疗，难愈性创面修复，疤痕的预防 和治疗。E-mail： liudaen@ 126． com
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Guangxi Medical Journal，Mar． 2011，Vol． 33，No． 3
行手术切除的 12 例烧伤后增生性瘢痕组织标本（ 12 块） ，其中男 5 例，女 7 例； 年龄 1． 5 ～ 24（ 8． 8 ± 7． 6） 岁； 上肢 5 例，下肢 3 例，躯干 3 例，颜面部 1 例。患者均 无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，无 心、肺、肝等 慢 性 疾 病，近 期 未 使 用 类 固 醇 激 素 类 药 物、抗肿瘤药物。临床表现为瘢痕处为增生活跃期， 外观发红充血、质硬、高于皮面，瘢痕增生局限于皮损 区内，局部伴瘙痒或疼痛等不适。 1． 2． 2 人增生性瘢痕成纤维细胞的培养及分组： 按 常规培养人增生性瘢痕成纤维细胞并反复传代，选取 4 ～ 7 代成纤维细胞，用 0． 25% 胰酶 + EDTA 消化细 胞后用不含胎牛血清的 DMEM 培 养 液 配 成 密 度 为 5 × 104 的 单 细 胞 悬 液。水 蛭 素 用 不 含 胎 牛 血 清 的 DMEM 培养基稀释其浓度为 1 ml、0． 25 ml、0 ml。从 每个单细胞悬液中取 15 个样品，分为 5 组，每组加上 述 3 个不同浓度的水蛭素。其中一组用于细胞形态 学检查，两组用于免疫组化染色法检测成纤维细胞中 Bax、Bcl-2 基因所产生的蛋白，两组用于 Western blot 法检测水蛭素对 Bax、Bcl-2 基因表达的影响。 1． 2． 3 细胞形态学检查一组加药 48 h 后在显微镜 下观察 HSFb 细胞形态学变化。 1． 2． 4 免 疫 组 化 染 色 法 检 测 成 纤 维 细 胞 中 Bax、 Bcl-2基因产生的蛋白： 两组分别加入已稀释的小鼠 抗人 Bax、Bcl-2 单克隆抗体，加入相应的二抗。利用 HPLAS1000 高清晰度彩色病理图像分析系统，显微 镜下随机选取 3 个视野，以细胞质内出现棕黄色颗粒 者判定为阳性，对成纤维细胞胞浆内 Bax、Bcl-2 的特 异性染色进行图像分析，并使用 Imagepro-Plus 软件 对免疫组化图片进行灰度分析，从而判断水蛭素对成 纤维细胞的影响。 1． 2． 5 Western blot 法检测水蛭素对 Bax、Bcl-2 基因 表达的影响： 两组培养 2 ～ 3 d 后蛋白裂解液裂解、离 心，上层液垂直电泳后转移到 PVDF 膜上，加入相应的 一抗、二抗，在暗房内用显色剂显影、定影、分析。使用 Bio-Rad 扫描仪对 X 光胶片上的条带进行灰度扫描，以 Bax 基因以及 Bcl-2 基因的 0 ml、0． 25 ml、1 ml与内参 样品灰度值相比，灰度值使用 Quantity One 4． 5 软件 系统进行分析。 1． 3 统计学分析 采用 SPSS 16． 0 统计软件进行数 据分析，计量资料均采用x ± s 表示，组间计量资料比 较采用成组设计的方差分析，以 P ＜ 0． 05 为差异有 统计学意义。
表 1 水蛭素对瘢痕成纤维细胞
Bax、Bcl-2 表达的影响（ x ± s，n = 5）
浓度（ ml） 0