慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

一、包装细胞293T细胞得培养

一、293T细胞得冻存

1、随着传代得次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。

2、在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3、倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留得培养基。

4、加入0、25%得胰酶，消化10-20s后倒去。

5、镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6、细胞计数。

7、将细胞离心，1000rpm，2min。

8、根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

10、第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T细胞得传代

1、当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好得生长状态。

2、消化细胞，方法同上。

3、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。

4、分到10cm培养皿中，10ml/皿。

三、293T细胞得复苏

1、当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存得细胞进行复苏。

2、打开水浴锅，设置温度为40℃。

3、查瞧细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存得细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4、将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5、放回37℃、3%CO2与95%相对湿度得培养箱中培养。

6、第二天观察细胞存活率。倒掉旧得培养基，加入10ml新鲜培养基。

二、慢病毒得包装、浓缩与滴度测定

1、所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下

5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),

5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and

5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)

2、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat、no、4304437)

3、TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat、no、401970)

4、TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat、no、4316844)

用于包装得293T细胞得培养

用于包装得293T细胞(ATCC No、CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到100%。

慢病毒得包装

1、预先准备3个T150瓶得293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。

2、将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶得细胞密度就是8×106个。

3、第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。

4、转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml得Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。

5、取两支无菌得50ml离心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD 包装质粒与84 μg pLTR-G质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到18ml。另一支中加入500 μl Trans-EZ溶液与17、5 ml Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当得试剂盒所制备得质粒。

6、室温孵育20分钟，使DNA与Trans-EZ充分结合形成转染复合体。

7、取1支5ml得移液管，将得到得DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。

8、6小时后，移去细胞上清，更换为17ml得DMEM完全培养基。

9、转染后一天观察细胞，所有得细胞应当都就是健康得并且密度接近60-80%。如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以瞧到大于95%得细胞都就是带有荧光得。

10、将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数得细胞依然贴壁。

11、收集所有得上清，分装到50ml离心管中。

12、4℃，500g离心10分钟，除去脱落得细胞与大得细胞碎片。

13、总得上清约为204 ml，用250-ml 0、45 μm PVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新得滤器。

慢病毒得浓缩与纯化

方法一超速离心沉淀法

1、取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。

2、每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml得预先处理得病毒上清液。

3、取一支10ml得移液管，吸取12 ml 20%得蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管得底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。同样地，将剩下8 ml得蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净得移液管，对剩下3管进行同样处理。

4、用PBS调整各管得重量，使对应得离心管之间得重量相差不超过0、1g。

5、按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。

7、小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余得上清流干。吸掉剩余得液滴。在管底应当有可见得沉淀。

8、每管中加入100ml 不含钙与镁得PBS洗下沉淀。

9、将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

10、在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

11、4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

12、用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中得液体集中到一个SW28离心管中。

13、集中后得病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

方法二PEG-8000浓缩法

PEG（聚乙二醇）就是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间得距离，使病毒与病毒能够很容易得聚合在一起，病毒得相对浓度提高，达到沉淀浓缩得目得。

5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8、766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q 纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃。

1、使用0、45μm滤头过滤慢病毒上清液；

3、每20～30min混合一次，共进行3-5次；

4、4度放置过夜；

5、4度，4000 g，离心20min；

6、吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；

7、加入适量得慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；