植物细胞培养-文档资料
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2018年细胞工程-第三节 植物细胞悬浮培养-医学文档
起始悬浮液的制备
转速30-150rpm 2-3cm冲程 防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
二 、培养方法
植物细胞悬浮培养通常深层培养可分为： 分批式．流加式．半连续式．连续 式．和灌注式五种。
1、分批培养/成批培养（Batch culture）
一、细胞悬浮培养原理
植物离体培养可产生愈伤组织, 将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基 中并在振荡条件下培养一段时间后，可 形成分散悬浮培养物。
细胞的悬浮培养示意图
（一）悬浮培养Suspension culture
特点 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
（2）流加工艺中的营养成分主 要分为三大类
① 葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和 主要的碳源物质。 ② 谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物 质和主要的氮源物质。 ③ 氨基酸．维生素及其他：主要包括营 养必需氨基酸．营养非必需氨基酸．一 些特殊的氨基酸如羟脯氨酸．羧基谷氨 酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养 成分如胆碱．生长刺激因子。
流加式培养是在批式培养的基础上，采 用机械搅拌式生物反应器系统，细胞初 始接种的培养基体积一般为终体积的 1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营 养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的 营养物或培养基，从而使细胞持续生长 至较高的密度。 整个培养过程没有流出或回收，通常在 细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回 收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，
（1）流加培养特点：
第二章植物组织培养的基本原理-精品文档
二、植株再生的方式： 1、器官发生（organogenesis）： ①一部分由外植体中已存在的器官原基发育而来。 ②多数则是由外植体经过脱分化后形成愈伤组织，在不断的 培养过程中形成的一些分生细胞团，这些分生细胞团在进 行分化后，重新形成不同类型的器官原基形成的。 特点：单极性结构、新发生的器官原基中的原形成层结构与 母体（愈伤组织或外植体）的维管组织相连接。
1934年, White用离体的番茄根建立了第一个活跃生长的无 性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成 功。提出B族维生素的重要性。 1944年，Skoog报道DNA的降解产物腺嘌呤, 可以促 进愈伤组织的生长，解除生长素对芽形成的抑 制作用，诱导芽的形成。 1958年, Steward和Reinert由培养的胡萝卜细胞诱导形成 了 胚状体。 1965年, 由Vasil和Hildebrandt用单个分离的细胞培养 获得整个植株, 植物细胞全能性的理论真正得到 了科学的证实。
4、愈伤组织形成过程：
(1)
诱导期（启动期）：细胞准备分裂的时期。 外植体细胞在适宜的诱导培养条件下，细胞中RNA含 量迅速增加，核糖体数量增加、淀粉消失、线粒体嵴膜 数量增多，细胞内合成代谢迅速加强。但此时外植体的 体积大小改变不大。
Hale Waihona Puke (2) 分裂期：细胞迅速分裂时期
外植体外层细胞开始迅速分裂，中央细胞常不分裂，由于 分裂不均匀，形成了中间静止的芯。 细胞分裂快，结构松散、颜色浅、透明。
通过器官发生形成再生植物通常有三种方式：
先生根，再长芽。
先产生芽，再生根。
愈伤组织不同部位形成根、芽，通过维管组织将根、 芽连结在一起。
2、体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）： 特点：双极性结构，由单个体细胞形成胚状体，最后发育 生长为一个植株。
植物细胞培养技术共33页文档
植物细胞培养技术
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
33
ห้องสมุดไป่ตู้
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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ห้องสมุดไป่ตู้
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26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
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27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
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四、悬浮细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的 分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化， 所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一 培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生 理学状态，工作中常用的处理方法： 1、物理方法 1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处 于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的 细胞继代培养于同一培养体系中。
2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细 胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可 获得处于同一细胞周期的细胞。 常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿 嘧啶、羟基尿等。 3）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度 一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜。
3、悬浮培养细胞数目的增殖变化
细胞生长各个时期的特点：
滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种 量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长 速率保持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显 的时期 缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代 谢物质增多，氧气减少。 静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极 少,甚至开始死亡。
机械搅拌式培养系统
气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作 用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往 往是容易使培养物污染的部位，因此， 发展出空气提升式生物反应器，但其缺 点是搅拌不均匀
旋转式培养系统： 一般用于产品中 试或某些必需裂 解细胞才能获得 目的产物的培养， 其优点是控制精 确，处理灵活， 缺点是培养体积 较小。
第二部分 细胞培养 定义 ：植物细胞培养（plant cell
《植物细胞教案》word版
《植物细胞教案》word版一、教学目标1. 知识与技能：（1）了解植物细胞的基本结构及其功能；（2）掌握植物细胞的观察和制作方法；（3）能够运用植物细胞的知识解释生活中的现象。
2. 过程与方法：（1）通过观察植物细胞模型，认识植物细胞的基本结构；（2）利用显微镜观察植物细胞切片，加深对植物细胞结构的理解；（3）动手制作植物细胞模型，提高动手能力及观察能力。
3. 情感态度价值观：培养学生对生物学感兴趣，增强学生关爱生命、保护生态环境的意识。
二、教学重点与难点1. 教学重点：（1）植物细胞的基本结构及其功能；（2）植物细胞的观察和制作方法。
2. 教学难点：（1）植物细胞结构的理解和运用；（2）制作植物细胞模型的技巧。
三、教学准备1. 教具：植物细胞模型、显微镜、植物细胞切片、制作植物细胞模型的材料等。
2. 教学场地：教室、实验室。
四、教学过程1. 导入：（1）引导学生观察周围的植物，思考植物细胞的结构和功能；（2）邀请学生分享他们对植物细胞的了解。
2. 讲解：（1）介绍植物细胞的基本结构，包括细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、叶绿体、液泡等；（2）讲解植物细胞各结构的功能及相互关系。
3. 观察：（1）引导学生使用显微镜观察植物细胞切片，认识各结构；（2）讨论植物细胞切片中的现象，如细胞壁、细胞膜、细胞核等。
4. 动手制作：（1）分组让学生动手制作植物细胞模型；（2）指导学生正确制作细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核等结构；（3）检查学生制作的植物细胞模型，给予评价和建议。
五、教学反思本节课结束后，教师应反思教学效果，包括学生对植物细胞知识的掌握程度、动手能力的提升情况以及学生对生物学的学习兴趣等。
针对反思结果，调整教学方法，为后续教学做好准备。
六、教学评价1. 课堂表现评价：观察学生在课堂上的参与程度、提问回答情况，了解学生的学习兴趣和积极性。
2. 作业评价：检查学生完成的植物细胞模型，评价学生的动手能力和对植物细胞结构的理解程度。
植物细胞培养ppt课件
如：纤维素酶，效率高
• 来源于愈伤组织
精选ppt
33
4.4.4.2 单细胞培养
• 平板培养 • 看护培养 • 微室培养 • 双层滤纸培养 • 悬浮培养
适宜于得到的细胞 数目少，细胞比较 珍贵的情况下使用
精选ppt
34
1) 细胞平板培养
• 平板培养（plating culture)是指将一定密
度的悬浮细胞接种到或混合到一薄层固体培 养基中培养的技术,类似于微生物细胞的平板
• 继代培养保存法 • 低温保存法：5-10度 • 冰冻保存法：-20度或液氮中
精选ppt
51
4.5 原生质体培养
• 原生质体的相关的概念和研究意义 • 原生质体的分离 • 原生质体培养
精选ppt
52
4.5.1 关于原生质体的几个重要概念
• 植物细胞培养：植物细胞在体外条件下的存
活或生长，不再形成组织，以生产次生代谢 产物为目的。
意义：能够有效地保持优良品种的特性；生
产无病毒种苗，快速繁殖新品种 ；生成药物
成分如紫杉醇等
精选ppt
2
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
4.3.1 植物组织培养的定义：
在无菌条件下，将离体的 植物器官，组织，细胞，胚 胎，原生质体等在人工培养 的条件下，诱发产生愈伤组 织，潜在芽或者长成新的完 整植物的一门实验技术，又 称为“试管植物”。
精选ppt
6
4.3.2 几个重要概念
• 全能性细胞：是能够表达生物体基因组的任何一种
基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞， 进而发育为一个完全相同的生物体。
• 来源于愈伤组织
精选ppt
33
4.4.4.2 单细胞培养
• 平板培养 • 看护培养 • 微室培养 • 双层滤纸培养 • 悬浮培养
适宜于得到的细胞 数目少，细胞比较 珍贵的情况下使用
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34
1) 细胞平板培养
• 平板培养（plating culture)是指将一定密
度的悬浮细胞接种到或混合到一薄层固体培 养基中培养的技术,类似于微生物细胞的平板
• 继代培养保存法 • 低温保存法：5-10度 • 冰冻保存法：-20度或液氮中
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4.5 原生质体培养
• 原生质体的相关的概念和研究意义 • 原生质体的分离 • 原生质体培养
精选ppt
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4.5.1 关于原生质体的几个重要概念
• 植物细胞培养：植物细胞在体外条件下的存
活或生长，不再形成组织，以生产次生代谢 产物为目的。
意义：能够有效地保持优良品种的特性；生
产无病毒种苗，快速繁殖新品种 ；生成药物
成分如紫杉醇等
精选ppt
2
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
4.3.1 植物组织培养的定义：
在无菌条件下，将离体的 植物器官，组织，细胞，胚 胎，原生质体等在人工培养 的条件下，诱发产生愈伤组 织，潜在芽或者长成新的完 整植物的一门实验技术，又 称为“试管植物”。
精选ppt
6
4.3.2 几个重要概念
• 全能性细胞：是能够表达生物体基因组的任何一种
基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞， 进而发育为一个完全相同的生物体。
植物细胞培养
• 提高植物繁殖的效率，缩短育种时间 • 生产有价值的生物活性物质，如抗生素、生物碱等 • 保护珍稀植物，防止物种灭绝
植物细胞培养的方法与分类
植物细胞培养的方法
• 固体培养：细胞在固体培养基上进行培养 • 液体培养：细胞在液体培养基中进行培养 • 悬浮培养：细胞在无细胞壁的液体培养基中进行培养
植物细胞培养的分类
04
植物细胞培养实例分析与实践
植物细胞培养在园艺植物中的应用实例
花卉生产
• 通过细胞培养生产花卉，如玫瑰、菊花等 • 提高花卉产量和品质
观赏植物
• 通过细胞培养生产观赏植物，如多肉植物、盆景植物等 • 保护珍稀观赏植物，防止物种灭绝
植物细胞培养在农作物中的应用实例
粮食作物
• 通过细胞培养生产粮食作物，如水稻、小麦等 • 提高粮食产量和品质
• 有性细胞培养：培养生殖细胞，如花粉、胚珠等 • 无性细胞培养：培养体细胞，如叶片、茎段等
植物细胞培养的条件与优化
植物细胞培养的条件
• 无菌：防止微生物污染 • 营养：提供必需的营养物质，如氮素、磷素等 • 恒温：维持适宜的温度，如25℃ • 恒湿：维持适宜的湿度，如80%
植物细胞培养的优化
• 选择合适的培养基：根据细胞类型和培养目的选择合适的培养基 • 调节光照：提供合适的光照强度和光周期 • 添加植物生长调节剂：如生长素、细胞分裂素等
DOCS
谢谢观看
THANK YOU FOR WATCHING
解决方案
• 采用无菌技术，防止微生物污染 • 优化培养条件，提高细胞生长和产物合成的效率
植物细胞培养技术的发展趋势与展望
技术创新
• 研究和应用新型培养技术，如基因编辑、细胞信号调控等 • 推动植物细胞培养技术的创新发展
植物细胞培养的方法与分类
植物细胞培养的方法
• 固体培养：细胞在固体培养基上进行培养 • 液体培养：细胞在液体培养基中进行培养 • 悬浮培养：细胞在无细胞壁的液体培养基中进行培养
植物细胞培养的分类
04
植物细胞培养实例分析与实践
植物细胞培养在园艺植物中的应用实例
花卉生产
• 通过细胞培养生产花卉，如玫瑰、菊花等 • 提高花卉产量和品质
观赏植物
• 通过细胞培养生产观赏植物，如多肉植物、盆景植物等 • 保护珍稀观赏植物，防止物种灭绝
植物细胞培养在农作物中的应用实例
粮食作物
• 通过细胞培养生产粮食作物，如水稻、小麦等 • 提高粮食产量和品质
• 有性细胞培养：培养生殖细胞，如花粉、胚珠等 • 无性细胞培养：培养体细胞，如叶片、茎段等
植物细胞培养的条件与优化
植物细胞培养的条件
• 无菌：防止微生物污染 • 营养：提供必需的营养物质，如氮素、磷素等 • 恒温：维持适宜的温度，如25℃ • 恒湿：维持适宜的湿度，如80%
植物细胞培养的优化
• 选择合适的培养基：根据细胞类型和培养目的选择合适的培养基 • 调节光照：提供合适的光照强度和光周期 • 添加植物生长调节剂：如生长素、细胞分裂素等
DOCS
谢谢观看
THANK YOU FOR WATCHING
解决方案
• 采用无菌技术，防止微生物污染 • 优化培养条件，提高细胞生长和产物合成的效率
植物细胞培养技术的发展趋势与展望
技术创新
• 研究和应用新型培养技术，如基因编辑、细胞信号调控等 • 推动植物细胞培养技术的创新发展
大学植物学 植物细胞-文档资料
成分：纤维素（相对多）,木质素、 基质多糖（相对少）。
结构：电镜下（根据纤维素微纤丝 排列的方向）分位三层。
特点：细胞壁厚度增加，刚性增强， 但没有延展性。
23
电镜下，次生壁可分为外、中、内 三层
纤维和石细胞等典型具次生壁的细 胞，细胞壁有5层结构：胞间层、 初生壁和三层次生壁
大部分具次生壁的细胞，在成熟时 原生质体死亡，残留的细胞壁有支 持保护的功能
• 化学成分：多糖（纤维素、半纤维素、果胶 质）、蛋白质（结构蛋白、酶、凝集素）。
• 结构模型：经纬结构—纤维素构成经，伸展 蛋白构成纬，交织而成网状结构。
• 特点：壁薄，具有弹性和可塑性。 • 功能：随细胞生长而生长。
21
威尔逊-福莱模型（1986）
22
c. 次生壁
来源：细胞分化时，物质积累在 初生壁局部或全部表面，构 成次生壁。
5
显微镜的发明打开了微观世界的大门
光学显微镜
透射电子显微镜
扫描电子显微镜
6
第一架电子显微镜（德国 Semens 公司，1933） 内质网（Porter等 ，1945） 叶绿体（Porter等 ，1947）
高尔基体（Daltond）、 核膜（Callon 等，1950）
溶酶体（De Dave）、 线粒体（Palade，Porter等 1952），
10
第一节 植物细胞的形态与结构
一、 植物细胞的形状与大小
• 植物体由细胞构成（单细胞或多细胞）
• 细胞的大小通常在20-50 m之间
• 细胞的形态多样，球形、多面体、立方体、长 形等
11
二、植物细胞的基本结构
细胞壁 (cell wall)
细胞
质膜(plasma membrane)
结构：电镜下（根据纤维素微纤丝 排列的方向）分位三层。
特点：细胞壁厚度增加，刚性增强， 但没有延展性。
23
电镜下，次生壁可分为外、中、内 三层
纤维和石细胞等典型具次生壁的细 胞，细胞壁有5层结构：胞间层、 初生壁和三层次生壁
大部分具次生壁的细胞，在成熟时 原生质体死亡，残留的细胞壁有支 持保护的功能
• 化学成分：多糖（纤维素、半纤维素、果胶 质）、蛋白质（结构蛋白、酶、凝集素）。
• 结构模型：经纬结构—纤维素构成经，伸展 蛋白构成纬，交织而成网状结构。
• 特点：壁薄，具有弹性和可塑性。 • 功能：随细胞生长而生长。
21
威尔逊-福莱模型（1986）
22
c. 次生壁
来源：细胞分化时，物质积累在 初生壁局部或全部表面，构 成次生壁。
5
显微镜的发明打开了微观世界的大门
光学显微镜
透射电子显微镜
扫描电子显微镜
6
第一架电子显微镜（德国 Semens 公司，1933） 内质网（Porter等 ，1945） 叶绿体（Porter等 ，1947）
高尔基体（Daltond）、 核膜（Callon 等，1950）
溶酶体（De Dave）、 线粒体（Palade，Porter等 1952），
10
第一节 植物细胞的形态与结构
一、 植物细胞的形状与大小
• 植物体由细胞构成（单细胞或多细胞）
• 细胞的大小通常在20-50 m之间
• 细胞的形态多样，球形、多面体、立方体、长 形等
11
二、植物细胞的基本结构
细胞壁 (cell wall)
细胞
质膜(plasma membrane)
植物细胞培养
苯丙素类
O O
HO H
O
H
HO
CH3O
OCH3 OCH3
鬼臼毒素（抗肿瘤）
苯丙素类
OH
O OCH3
HO O CH2OH
OH OH O
水飞蓟素 ：治疗急、慢性肝炎、肝硬化、 中毒性肝损伤等）的良药。
紫草
HO O
HO
O
醌类
紫草素
CHCH2CH C HO
紫草根
CH3
天然色素，绛红色。抗 CH3 菌、抗炎、抗病毒、止
紫杉醇的发现
50年代末-60年代初：癌症病人大量增加
60年代中期：美国食品与药物管理局（FDA） 制定计划，广泛寻找、筛选治疗癌症的药物（ 动物、植物、微生物）
1969: 美国农业部（USDA）采样员在Oregon 洲采取到太平洋紫杉（pacific yew，短叶红豆 杉）树皮，后经筛选试验发现有强烈的抑制肿 瘤的作用
连续培养(continuous culture)：在一个容器 （或者系统）中连续不断的培养植物细 胞。
连续培养
成批培养
悬浮细胞培养的特点
1）细胞生长速度较快； 2）可以长期、连续、大规模培养细胞； 3）不能跟踪单细胞的分裂和生长过程。
三、 细胞培养的应用
1. 进行细胞生物学研究：
通过适当的培养技术，人们可以连续观 察和记录（摄像）单个细胞的生长、分裂和 分化的全过程。因此，细胞培养技术是研究 细胞生长、分裂和分化的良好实验体系。
第五讲 植物细胞培养 Plant Cell Culture
第一节 植物细胞培养简介
一、概念：
在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、增殖 或分化。
二、类型：
1、固体培养(solid culture)：在固体培养基中培养 细胞=静止培养。
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讨论:
A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培 养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。 B、加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的 培养基。 C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养 的细胞一直保持对数生长期。 D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间 太长，则会引起细胞的大量死亡和解体
早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉 细胞
加果胶酶
过滤、离心
2、由培养组织分离单细胞
茎段
步骤：
(1) 诱导产生愈伤组织； (2) 愈伤组织反复继代， 使组织不断增殖，提 高
继代
悬浮
摇床用于振荡 (3)将愈伤组织 在液体培养基 中培养，建立 悬浮培养物
E、有丝分裂指数 在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细 胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数， 指数越高，分裂进行的速度越快。 一般用孚尔根染色法，先将组织用 1molHCl在60℃水解后染色，常规镜检， 统计500个细胞，计算。
一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在 30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全 由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬 浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透 亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚 至更短时间便可增加一倍。
第二部分 细胞培养 定义 ：植物细胞培养（plant cell
culture） 是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团 进行培养使其增殖的技术 根据培养规模:小规模培养和大批量培养； 根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等； 根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生 产物的细胞培养。
§1.单细胞分离 §2.悬浮培养 §3.单细胞培养技术 §4.植物细胞大规模培养与次生产物生产
2、培养细胞的起始密度及细胞记数
（1）最低有效密度的概念 在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细 胞能够增殖的最少接种量称为最低有效 密度或者临界的起始密度。 最低有效密度由于培养材料、原种 培养条件，原种保存时间长短、培养基 的成分不同而有差异，一般为104~105细 胞/ml
2）细胞记数 要保证细胞培养的最低有效密度，在细 胞游离后要对分离的单细胞进行记数， 可用血球记数板
Culture
1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细 胞群体，适于大规模培养； 2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研 究细胞的生长、分化创造方法和条件。
细胞悬浮培养的应 用
植物 细胞悬浮 人工种子
原生质体分离
突变筛选
Secondary products
三.细胞悬浮培养的方法
1、培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的 培养基以原愈伤组织继代时的培养基除 去琼脂为好。为了提高细胞的分散度， 对于生长素和细胞分裂素的比例需要进 行一些调节。
3、悬浮培养细胞数目的增殖变化
细胞生长各个时期的特点：
滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种 量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长 速率保持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显 的时期 缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代 谢物质增多，氧气减少。 静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极 少,甚至开始死亡。
B、细胞大小的测定技术（用显微测微计） C、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放 入15ml刻度离心管中于2000g离心5min。以每 毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示。 D、细胞的干重和鲜重。 将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布 上，用水冲洗并抽滤除去细胞粘着的多余水滴， 然后称重，两者差就是细胞的鲜重。干重一般 是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片 上，然后在60℃烘12h，在干燥器中冷却后称 重。细胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养 物的重量表示。
§1.单细胞分离
完整的植物器官分离单细胞
由培养组织中分离单细胞
1-1、 机械法 第一种方法：用刀片刮叶片
撕去下表皮
露出叶肉细胞
用解剖刀刮下细胞
第二种方法：叶片研碎、离心
加研磨介质
研碎成粉
过滤、离心
注意 ： 只有薄壁组织排列松散，细胞间结触 点很少时用机械法分离叶肉细胞才能 取得成功。
1-2、 酶解法： Takebe等（1968）最
6、影响悬浮细胞生长的因素： 起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再 生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。 接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往 使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在 0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则 会使细胞生长延迟。 培养条件：方式、温度、继代周期
操作注意事项： 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径 要小，只能通过单细胞或小细胞团（24细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞 团沉降，再吸上层悬浮液。 依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培 养物。
4、细胞生长的测定
对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态 的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其 他研究提供依据。 A、细胞记数 注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因 此 通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。 可用5%~8%铬酸或0.25%的果胶酶对细胞团进行处理 生长速率p P=（lnx-lnX0）/t X为t时间的细胞密度，X0为起始细胞密度
§2.细胞悬浮培养(cell suspension culture)
一、细胞悬浮培养的概念和意义 悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养 基中进行培养增殖的技术。
Bioreactor for continuous cell suspensions Shaker for suspension culture
120rpm culture transfer 1time/3d 100-130目网过滤 3 weeks Centrifuge(离心） isolation
注意：
选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是 最常使用的外植体。 选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度， 特别是生长素，必要的附加物质，例如水解酪 蛋白、Pro、Gln。 继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组 织。