植物细胞培养-文档资料

操作注意事项： 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径 要小，只能通过单细胞或小细胞团（24细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞 团沉降，再吸上层悬浮液。 依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培 养物。
4、细胞生长的测定
对于任何一个ຫໍສະໝຸດ Baidu立的细胞悬浮系都应该进行动态 的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其 他研究提供依据。 A、细胞记数 注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因 此 通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。 可用5%~8%铬酸或0.25%的果胶酶对细胞团进行处理 生长速率p P=（lnx-lnX0）/t X为t时间的细胞密度，X0为起始细胞密度
6、影响悬浮细胞生长的因素： 起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再 生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。 接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往 使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在 0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则 会使细胞生长延迟。 培养条件：方式、温度、继代周期
讨论:
A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培 养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。 B、加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的 培养基。 C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养 的细胞一直保持对数生长期。 D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间 太长，则会引起细胞的大量死亡和解体
E、有丝分裂指数 在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细 胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数， 指数越高，分裂进行的速度越快。 一般用孚尔根染色法，先将组织用 1molHCl在60℃水解后染色，常规镜检， 统计500个细胞，计算。
一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在 30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全 由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬 浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透 亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚 至更短时间便可增加一倍。
120rpm culture transfer 1time/3d 100-130目网过滤 3 weeks Centrifuge(离心） isolation
注意：
选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是 最常使用的外植体。 选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度， 特别是生长素，必要的附加物质，例如水解酪 蛋白、Pro、Gln。 继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组 织。
第二部分 细胞培养 定义 ：植物细胞培养（plant cell
culture） 是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团 进行培养使其增殖的技术 根据培养规模:小规模培养和大批量培养； 根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等； 根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生 产物的细胞培养。
§1.单细胞分离 §2.悬浮培养 §3.单细胞培养技术 §4.植物细胞大规模培养与次生产物生产
§2.细胞悬浮培养(cell suspension culture)
一、细胞悬浮培养的概念和意义 悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养 基中进行培养增殖的技术。
Bioreactor for continuous cell suspensions Shaker for suspension culture
Culture
1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细 胞群体，适于大规模培养； 2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研 究细胞的生长、分化创造方法和条件。
细胞悬浮培养的应 用
植物 细胞悬浮 人工种子
原生质体分离
突变筛选
Secondary products
三.细胞悬浮培养的方法
1、培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的 培养基以原愈伤组织继代时的培养基除 去琼脂为好。为了提高细胞的分散度， 对于生长素和细胞分裂素的比例需要进 行一些调节。
3、悬浮培养细胞数目的增殖变化
细胞生长各个时期的特点：
滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种 量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长 速率保持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显 的时期 缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代 谢物质增多，氧气减少。 静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极 少,甚至开始死亡。
早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉 细胞
加果胶酶
过滤、离心
2、由培养组织分离单细胞
茎段
步骤：
(1) 诱导产生愈伤组织； (2) 愈伤组织反复继代， 使组织不断增殖，提 高愈伤组织的松散性；
15ml medium/1g
No Image
继代
悬浮
摇床用于振荡 (3)将愈伤组织 在液体培养基 中培养，建立 悬浮培养物
B、细胞大小的测定技术（用显微测微计） C、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放 入15ml刻度离心管中于2000g离心5min。以每 毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示。 D、细胞的干重和鲜重。 将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布 上，用水冲洗并抽滤除去细胞粘着的多余水滴， 然后称重，两者差就是细胞的鲜重。干重一般 是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片 上，然后在60℃烘12h，在干燥器中冷却后称 重。细胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养 物的重量表示。
§1.单细胞分离
完整的植物器官分离单细胞
由培养组织中分离单细胞
1-1、 机械法 第一种方法：用刀片刮叶片
撕去下表皮
露出叶肉细胞
用解剖刀刮下细胞
第二种方法：叶片研碎、离心
加研磨介质
研碎成粉
过滤、离心
注意 ： 只有薄壁组织排列松散，细胞间结触 点很少时用机械法分离叶肉细胞才能 取得成功。
1-2、 酶解法： Takebe等（1968）最
2、培养细胞的起始密度及细胞记数
（1）最低有效密度的概念 在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细 胞能够增殖的最少接种量称为最低有效 密度或者临界的起始密度。 最低有效密度由于培养材料、原种 培养条件，原种保存时间长短、培养基 的成分不同而有差异，一般为104~105细 胞/ml
2）细胞记数 要保证细胞培养的最低有效密度，在细 胞游离后要对分离的单细胞进行记数， 可用血球记数板