时间分辨荧光分析技术

1.1 时间分辨荧光分析技术

时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。

本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。

1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质

稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。

1020

152530355

E N E R G Y ,103c m -1

6

H 5/2

G 5/2

6

H 15/2

7

F 0

F 2D 0

5D

1

7F 6

F 5

4

5D

3

13/2

4

9/2

Sm 3+

Eu 3+

Tb 3+

Dy 3+

H 9/2

图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图

Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions

大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为例，其荧

光发光机理如图1.2所示[9]，包括三线态发光机理和单线态发光机理。当铕(III)配合物受光激发后，配体分子吸收激发光能量由基态S 0跃迁至第一单线激发态S 1，处于此激发态的分子不稳定，可以通过辐射跃迁的方式返回基态，发出配体荧光（S 1→S 0），也可以通过系间窜跃（非辐射跃迁方式）将能量传递至配体的第一三线激发态T 1。处于T 1能级的配体分子可以通过辐射跃迁的方式回到基态，发出配体磷光（T 1→S 0）；当T 1能级高于Eu 3+的共振能级时，能量就可以进一步传递给Eu 3+使之激发至共振能级，并在由共振能级跃迁回基态的过程中发出Eu 3+的特征荧光，此即三线态发光机理。而上述处于S 1激发态的配体分子如果不经过T 1激发态，直接将能量传递给Eu 3+使之激发至共振能级，然后由共振能级跃迁回基态发出Eu 3+的特征荧光，此即单线态发光机理。到目前为止，绝大多数的Eu 3+配合物的荧光发光都遵循三线态发光机理，只有极个别的遵循单线态发光机理。

Eu 3+

ligand

S

1

S

7F

F

2D 0

D

1

F 6

Eu 3+

ligand

S

S F 0

F 2D 0

D 1

F 6D 3

D 2

(a) (b)

图1.2 铕(III)配合物发光机理示意图：（a ）三线态发光机理；（b ）单线态发光机理 Fig. 1.2 Schematic diagrams of the radiative processes of the chelate leading to Eu 3+

fluorescence by (a) triplet excited state mechanism and (b) singlet excited

state mechanism

不同于有机荧光化合物，稀土配合物的荧光性质，一方面取决于有机配位体的三重态能级T 1的位置，另一方面取决于配位体与稀土离子处于激发态时的能量匹配程度。荧光发光的波长和强度，均随稀土离子的不同而不同。Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+、Dy 3+等稀土离子的配合物属于镧系元素荧光配合物中的强荧光物质。激发这些离子所需能量较低，同时由于这些离子的激发态和基态能量相差较大，非放射迁移较小，因此它们的荧光量子产率相对较高。

由于稀土荧光配合物特殊的发光机理，使其相对于常规有机荧光化合物，像荧光素和罗丹明等而言具有以下特点：

（1）荧光发射的特征峰波长主要与中心离子有关，而与配位体结构关联不大。稀土配合物发光是基于配合物由配位体到中心金属离子的能量转移所产生的，配位体吸收激发光能量后转移到中心稀土离子，然后再通过中心稀土离子的4f轨道能量跃迁而发出荧光，即接受激发光能量和发射荧光是由不同的部分所完成的，因此同一种稀土离子与不同配位体形成的配合物的荧光发射峰波长基本不变。

（2）荧光寿命非常长，通常在10 μs（Sm3+、Dy3+）或100 μs（Eu3+、Tb3+）以上。这是由于稀土配合物的发光是经过配位体的三重态的能量转移所致，所产生的荧光是延迟荧光，其寿命比配位体的磷光寿命还要长。从表1.1可以看出，Eu3+配合物的荧光寿命比普通荧光化合物的荧光寿命要长大约105倍。利用这种长荧光寿命，就可进行百微秒级的时间分辨荧光测定。

（3）稀土配合物所发荧光的Stokes位移 (最大发射峰与最大吸收峰之间的波长差) 非常大，大部分在200 nm以上，对克服因激发光而导致的散乱光对测定的干扰很有利。

（4）荧光激发谱带较宽，有利于增高激发能，而发射峰非常尖锐，半峰宽通常在10~15 nm，为类线性光谱，有利于降低本底，提高分辨率。

稀土荧光配合物与常规荧光化合物的性质比较[10-12]见表1.1。

表1.1 稀土荧光配合物与常规荧光化合物的性质

Tab. 1.1 Fluorescence properties of lanthanide complex and conventional

organic compounds

Compound Lifetime

(ns)

λex,max

(nm)

λem,max

(nm)

Stokes

shift

(nm)

Quantum

yields (Q)

ε

(mol-1Lcm-1)

FITC 4.5 492 518 26 0.85 7.0 x 104 RBITC 3 550 585 35 0.70 1.2 x 104 Cy5 ---- 650 667 17 0.27 2.5 x 105 Eu(--NTA)7 x 105340 613 273 0.209 3.6 x 104 FITC: Fluorescein isothiocyanate; RBITC: Rhodamine-B200-isothiocyanate; Cy5: Cyanine dye; --NTA: 2-naphthoyltrifluorobutanedione.

1.1.2 时间分辨荧光测定原理

时间分辨荧光测定技术是利用稀土配合物具有长寿命荧光这一特点，在样品被脉冲光激发后、荧光信号采集前，根据样品中所包含的荧光物质荧光寿命的不同引入一定的延迟时间 (delay time)，待短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的特异性荧光信号进行测定，原理如图1.3所示。采用时间分辨荧光测定