原代细胞培养：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题

Case：新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋

白与基因

实验设计

一、细胞：分离大鼠原代心房肌细胞

二、细胞培养分组：

a)对照组：正常大鼠原代心房肌细胞72h培养

b)高糖72h培养

c)高糖+氧化应激抑制因子72h培养

d)正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24h

e)高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24h

f)正常培养48h+（氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子）共同培养24h

三、蛋白检测：WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。

四、荧光定量检测：荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。

实验报告

一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、新生SD大鼠心房肌细胞的α-actin免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗（嘉美生物公司）， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。

200×

400×

三、Real-time PCR检测SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A基因、B基因、FKBP12.6 mRNA表达水平

1、总RNA的提取：

（1）将细胞培养液吸出后，用PBS洗细胞2次，加入1 mL Trizol室温裂解细胞5min，用移液器均匀吹下细胞并置于EP管中，上下轻柔颠倒10次，室温静置5min；

（2）加0.2 mL氯仿，颠倒混匀10次，室温静置5min，4℃，12000rpm，离心20min；

（3）转上层水相于另一新EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀10次，-20℃放置2h后，4℃，12000rpm，离心15min；

（4）用移液器小心吸弃上清，加冰预冷的75%乙醇，4℃，12000rpm，离心10min；

（5）弃上清，EP管倒扣，空气干燥10 min；

（6）将总RNA溶于适量DEPC处理水中，最后用分光光度计测量其浓度。

2、第一链cDNA合成（Genecopoeia试剂盒）

（1）反应体系（20μL）：

Total RNA 2μg

Oligo (dT)18 1μL

10mM dNTPs 1μL

5×RT Buffer 4μL

Ribonuclease Inhibitor 0.5μL

TransScript RT 1μL

ddH2O to final volume 20μL

（2）轻轻混匀后，进行：

a) 42℃孵育30min.

b) 85℃孵育5min.

c) -20℃，保存备用.

3、Real-time PCR（Genecopoeia SYBR Green I 荧光染料试剂盒）

（1）引物序列：

a、CaMK-ⅡδF：CTGGCACACCTGGGTATCTT

CaMK-ⅡδR：ATCCCAGAAGGGTGGGTATC

b、A Gene F：TAACCTACCAGGCCGTGGAT

A Gene R：GCTGCGATCTGGATAAGTTCAA

c、B Gene F：GCAGTTGACTGAGGCGTCTT

B Gene R：GGATTCGTGAGTGGCGATAC

d、FKBP12.6 F：CTGGAATTCATGGGCGTGGAGATCGAG

FKBP12.6 R：GACTCGAGTCACTCTAAGTTGAGCAGCTC

e、β-actin F：GACGGTCAGGTCATCACTATCG

β-actin R：ACGGATGTCAACGTCACACTTC

（2）反应体系（25μL）：

F引物 0.5μL

R引物 0.5μL

SuperMix 12.5μL

Passive Reference Dye 0.5μL

cDNA 2μL

ddH2O 9μL

（3）程序设置如下（Eppendorf PCR仪）：

95℃ 3min

95℃ 20s

55℃ 20s 40循环

72℃ 20s

95℃ 15s

60℃ 15s

60℃-95℃ 20min

95℃ 15s

（4）Realplex软件导出数据并分析