原代细胞培养：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题
原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？
原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？导语对于⼤部分科研⼈员来说，研究中⼀般⽤到均是现成的细胞系/株，我们只需要：进⾏细胞传代和保种。
然⽽，这些细胞系常常由于体外长期培养，⽽丢失原有⽣物学特性，对药物处理的反应差距越来越⼤。
因此，原代细胞的地位⽇渐凸显，Paper中若有了原代细胞的数据都会添⾊不少。
然⽽，就⼩编亲⽣经历，原代细胞分离着实是个技术活，今天我们就结合⾃⾝经验，为⼤家介绍：肿瘤组织和正常组织的原代细胞的分离与培养⽅法。
第⼀部分：原代细胞的基本知识1. 什么是原代细胞培养?原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进⾏培养的细胞。
这⾥的组织主要指：组织器官、外周⾎及胚胎等。
原代细胞培养：由于原代细胞⽣长缓慢，繁殖⼀定的代数停⽌⽣长（⼀般10代以内）。
所以⼀般认为：培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。
2. 原代细胞与细胞系（cell lines）的区别原代细胞和细胞系的⽐较：Primary cells Cell lines增殖能⼒较弱强繁殖代数⼀般只能传10代以内⽆限增殖，50代左右遗传物质完整性遗传物质未改变遗传物质发⽣改变⽣物特性最接近临床样本偏离临床样本培养容易程度⽐较复杂简单，易操作原代细胞和细胞系的⽐较3. 原代细胞的应⽤由于原代细胞⽣物学特性未发⽣很⼤改变，最接近和反映体内⽣长特性，因此是：(1) 研究⽣物体细胞的⽣长、代谢、繁殖提供有⼒的⼯具；(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准⽤药的⽬的。
第⼆部分：原代细胞分离和培养技术原代培养的原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常⽤胰蛋⽩酶/胶原酶)、螯合剂(常⽤EDTA)或机械⽅法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以⽣存、⽣长和繁殖，这⼀过程称原代培养。
主要包括取材——分离——培养等3部分；在原代细胞应⽤较多的包括：组织器官（如实体瘤、⽪肤等）、悬浮细胞的取材等。
原代细胞分离与培养
1.原代细胞分离与培养1.1原代细胞分离人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。
第一，悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10 min。
经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
第二，实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。
其中，机械分散法的特点是简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。
而消化分离法是指把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
1.2原代细胞培养原代细胞的培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步。
第一，组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。
其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。
第二，消化培养法第三，悬浮细胞培养法。
对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。
第四，器官培养。
器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养。
器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。
原代细胞培养实验报告
原代细胞培养实验报告实验名称：原代细胞培养实验实验目的：1.掌握原代细胞培养的基本技术和方法；2.观察和记录原代细胞在体外培养过程中的生长和变化；3.学习和探究细胞培养对细胞形态、功能和特性的影响。
实验材料和方法：1.实验材料：原代细胞，培养基，培养皿，培养瓶，培养箱等；2.实验方法：a.准备工作：消毒实验区域，准备适宜的培养条件；b.培养器皿预处理：将培养皿和培养瓶加热至高温，使其表面杀菌；c.细胞移植：用适量的培养基将原代细胞移植至培养皿或培养瓶中；d.细胞培养：将细胞培养在恒温恒湿的培养箱中，定期观察和记录细胞的生长情况；e.细胞传代：当细胞达到一定密度时，用消化液将细胞从原培养皿中剥离，并转移到新的培养皿中，促进细胞的继续生长和繁殖。
实验结果与分析：在进行原代细胞培养实验的过程中，我们发现原代细胞在培养基中可以维持一定的形态和生物活性。
经过一段时间的培养，细胞开始出现贴壁生长，并形成单层密集的细胞群。
这时，细胞的数量明显增加，可见其细胞分裂和增殖的效果。
细胞形态也逐渐变得规整，细胞质较为丰满，细胞核染色质着色精细。
随着培养的时间推移，细胞的代谢活动逐渐增强，细胞数量持续增加。
细胞形态和功能逐渐分化，并出现特定的细胞类型，如心肌细胞、肝细胞等。
这表明原代细胞在体外培养的过程中，依然能够保持其特定的细胞类型和功能特性。
然而，我们也发现在长时间的培养过程中，细胞的生长速度逐渐放缓，甚至停滞。
细胞形态也开始出现变异和退化，如细胞形状异常、质量变差等。
这可能是由于细胞的老化和突变导致，同时也与培养条件和传代的次数有关。
结论：通过本次实验，我们成功地进行了原代细胞的培养，并观察到了细胞在体外培养过程中的生长和变化。
我们发现原代细胞能够在适宜的培养条件下，维持其形态和功能的稳定性，并且能够分化成特定的细胞类型。
然而，在长时间的培养过程中，细胞的生长速度逐渐放缓，而细胞的形态也逐渐出现变异和退化。
因此，在进行原代细胞培养时，需要合理控制培养条件和适时进行细胞传代，以保持细胞的生长和特性。
原代细胞鉴定实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过对原代细胞的分离、培养和鉴定，掌握原代细胞培养的基本操作流程，了解原代细胞的生物学特性，并对其进行准确的鉴定，为后续的细胞生物学研究奠定基础。
二、实验原理原代细胞是指直接从生物体内提取的组织细胞，经过分离、培养后形成的细胞群体。
原代细胞保留了其来源组织的遗传和生物学特征，能够反映生物体内细胞的真实状态。
本实验采用组织块培养法分离原代细胞，通过显微镜观察细胞形态、生长状态以及进行细胞表面标志物的检测，对原代细胞进行鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料- 新鲜的组织样本- 无菌培养皿、培养瓶- DMEM培养基- FBS（胎牛血清）- 0.25%胰蛋白酶- 10% FBS DMEM培养基- 抗体（CD45、CD34等）- 试剂：二抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体、DAB显色剂等2. 实验仪器- 超净工作台- 倒置显微镜- 恒温培养箱- 冰箱- 低温高速离心机- 分光光度计四、实验方法1. 组织块培养（1）将新鲜的组织样本置于无菌培养皿中，用无菌手术刀将其切成1mm×1mm×1mm的小块。
（2）将组织块置于培养皿中，加入适量DMEM培养基，用移液枪吹打使其分散。
（3）将分散后的组织块转移至无菌培养瓶中，加入适量DMEM培养基和FBS，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
2. 细胞传代（1）当细胞生长到约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞。
（2）消化后的细胞用10% FBS DMEM培养基终止消化，离心收集细胞。
（3）弃去上清液，加入适量DMEM培养基重悬细胞，按1:2的比例传代。
3. 细胞形态观察（1）取部分细胞悬液，滴于载玻片上，进行染色。
（2）用倒置显微镜观察细胞形态、生长状态等。
4. 细胞表面标志物检测（1）将细胞用PBS洗涤，离心收集细胞。
（2）加入抗体，4℃孵育1小时。
（3）加入二抗，室温孵育30分钟。
（4）加入DAB显色剂，室温孵育5-10分钟。
兽医微生物论述题
病毒病的微生物学检验程序。
(一)样品采集和递送及处理(二)镜检1、光学显微显镜检查包涵体2、电子显微镜检查：形态、大小、构造(三)病毒分离培养鉴定分离培养：动物接种——原动物/实验动物鸡胚接种——卵黄囊、尿囊腔、尿囊膜、羊膜腔等细胞培养——原代细胞二倍体细胞技术克隆/扩增传代细胞组织块培养——肠管、气管环等鉴定：生物学特性鉴定；血清学鉴定（对病毒）；病毒特性：如血凝性；(四)血清学检查：HA、HI、补反、放射元素\荧光\酶标记中和试验(五)分子生物学技术核酸探针PCR技术等送检一病(死)猪，临床诊断怀疑是仔猪黄痢，如何进行微生物学诊断？怀疑是仔猪黄痢，即怀疑其病原为致病性大肠杆菌，微生物学诊断如下:1.涂片镜检：G-，杆菌2.分离培养：麦康凯平板（红色菌落）血平板（β溶血，灰色圆形，特征性气味）3.生化鉴定：①I：+②M：+红③Vi：-不变色④C：-⑤三糖铁琼脂（上下都黄：发酵葡萄糖、乳糖）⑥触酶+⑦氧化酶+⑧尿素酶-⑨硫化氢-⑩麦芽糖、甘露糖产酸产气4.血清型鉴定：单因子抗O血清作血清型鉴定5.动物试验：用灭菌生理盐水洗下纯培养物，0.2-0.5ml注射易感动物（家兔或仔猪），死亡后剖检，分离培养鉴定以确诊送检一病(死)鸡，怀疑是禽霍乱，请你给出一份详细的微生物学诊断报告怀疑是禽霍乱，即怀疑其病原为禽多杀性巴氏杆菌,微生物学诊断如下:（1）涂片镜检：G-，瑞氏/美兰，两极着色杆菌（2）分离培养：①LB（不生长）②麦康凯（不生长）③血平板（不溶血，灰白色，表面光滑，边缘整齐的露滴状小菌落）（3）生化鉴定：生化培养基和单糖发酵管中，进行吲哚试验、MR试验、VP试验和单糖发酵试验等（4）动物试验：用灭菌生理盐水洗下纯培养物，取0.1-0.2ml注射小白鼠，死亡后剖检，镜检分离培养鉴定以确诊猪丹毒杆菌诊断。
1.涂片镜检：G+，纤细小杆菌2.分离培养：①麦康凯（不生长）②血平板（α溶血，灰白色透明露滴状菌落）③明胶穿刺（横向四周生长，试管刷状）3.动物试验：用灭菌生理盐水洗下纯培养物，注射小白鼠，死亡，镜检发现纤细的革兰氏阳性小杆菌即可确诊炭疽杆菌诊断与鉴定疑似炭疽杆菌的牛严谨解剖，取材注意消毒1.涂片镜检：G+，荚膜竹节状大杆菌2.分离培养：①LB（灰白不透明，大而扁平，干燥粗糙，边缘卷发状）②血平板（不溶血）③明胶穿刺（倒立的雪松）④串珠反应3.动物试验：用灭菌生理盐水洗下纯培养物，注射小白鼠，死亡，镜检有竹节状大杆菌，则可确诊请写出至少2种鸡白痢沙门氏菌与鸡致病性大肠杆菌的微生物学鉴别方法。
原代细胞培养：原代肝细胞
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《原代细胞培养实验》课件
案例二：胰岛细胞的原代培养
要点一
总结词
要点二
详细描述
胰岛细胞是胰腺内分泌部分的主要组成部分，其原代培养 需要模拟体内环境，以保持细胞的正常生理功能。
胰岛细胞的原代培养需要使用特殊的基质和生长因子，以 促进细胞的生长和分化。同时，需要控制培养液中的葡萄 糖、胰岛素等物质的浓度，以模拟体内环境。在培养过程 中，还需要注意防止细胞凋亡和自噬等问题。
细胞生长状态
通过观察细胞形态，评估 细胞的生长状态，如贴壁 、增殖、融合等情况。
细胞排列
观察细胞在培养容器中的 排列情况，判断细胞的生 长密度和分布情况。
细胞生长曲线的绘制
01
细胞计数
在原代细胞培养的不同时间点进 行细胞计数，记录细胞的增殖情 况。
02
绘制生长曲线
03
生长曲线的分析
将不同时间点的细胞计数数据绘 制成生长曲线，分析细胞的生长 速率和生长周期。
选择适合细胞类型的基础培养 液，如MEM、DMEM等。
添加物
根据细胞类型和生长需求，添 加适量的生长因子、血清、抗
生素等。
pH值
维持适宜的pH值范围，通常 为7.2-7.4。
渗透压
保持适宜的渗透压，以避免细 胞因渗透压过高或过低而受损
。
细胞的传代与冻存
传代时机
在细胞生长达到适宜密度时进 行传代，避免细胞过度生长或
原代细胞培养的应用
原代细胞培养在药物筛选、肿瘤研究、组织工程、再生医学等领域具有广泛的应 用价值。
通过原代细胞培养可以研究细胞的生理功能、药物作用机制和毒理反应，同时也 可以用于制备组织工程材料和进行基因治疗等研究。
02
原代细胞培养实验步骤
原代细胞培养 实验报告
细胞生物学实验报告原代细胞培养1.实验目的：了解原理代细胞培养的基本方法，初步掌握无菌操作的方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、微量移液管、培养皿、离心机、注射器、L型针头（2）实验药品：蒸馏水、75%酒精溶液、PBS溶液、细胞培养液（3）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）动物细胞培养：从动物体内取出体细胞，在体外模拟体内环境在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的方法。
原代细胞培养：直接从体内获取细胞组织或器官进行体外培养至第一次传代培养为止。
细胞培养至一定程度后，需再做培养。
及培养的细胞分散后，从一个容器以一定比例转移到另一容器扩大培养。
代数：传代培养累计次数（2）细胞培养的条件①气体条件：有一定的O）（小于空气中浓度）和CO2（5%）②无菌环境：培养用品应高温灭菌，培养液应无菌处理，操作应在超净工作台无菌操作。
③最适温度：36～37℃为最适温度，30～37℃细胞可进行代谢，4℃细胞可存活数天。
④渗透压：一般为260～320mmol/l （人血浆一般为290mmol/l）⑤营养条件：含细胞生长必须的有机物，氨基酸、维生素、无机盐、辅助物等。
培养基中不含生长因子，因此，必须在培养基中加入小牛血清。
⑥最适pH：7.0～7.4（中和细胞代谢废物与酸性气体环境）（3）贴壁生长与不贴壁生长①贴壁生长：来自于实体组织的细胞多贴壁生长。
贴壁生长的细胞进行传代培养更换培养皿时有以下步骤：首先，应轻晃培养皿并弃去上清液（去除死细胞），再用胰蛋白酶处理（细胞成片收缩，变圆），倾斜培养皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打细胞并离心，最后，加入新的培养液，按比例分入培养皿中。
②不贴壁生长：造血细胞、癌细胞等。
半量换液法：吸取1/2培养液到新的培养皿中，再离心，取下层细胞，分入多个培养皿中。
4.实验步骤：（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。
细胞的原代培养实验报告
实验十一细胞的原代培养一、实验目的1、了解细胞体外培养的原理、基本方法。
2、掌握无菌操作方法及注意事项。
3、学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。
二、实验原理模仿体内生长环境，使来自机体的细胞、组织、器官能够在人工培养条件下生存、生长、繁殖。
三、实验器材1、纯水设备：纯水仪2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器及0.22 ?m滤膜；3、超净工作台4、培养设备：普通培养箱、CO2培养箱；5、贮存设备：冰箱、液氮罐6、观察设备：倒置显微镜7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等培养主要用品1、培养瓶、皿：以玻璃器皿为主，应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品（1）培养瓶（2）培养皿2、血球计数板3、眼科剪、镊；实验材料7－14日龄鸡胚（肝素）抗凝血原代培养材料选择幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养分化程度低的组织比分化高的容易培养肿瘤组织比正常组织容易培养。
实验试剂1、D'Hanks液KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4?H2O 0.06g，加H2O至1000ml注：Hank's液可以高压灭菌。
4℃下保存。
2、o．25％胰蛋白酶（D'Hanks液配）3、M199 培养液小牛血清、4．5、青、链霉素6、5％NaHCO3、2％碘酒7、75％酒精8、洗液：由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成四、实验方法与步骤一）培养前的准备工作1、用品清洗与消毒2、溶液配制与消毒（1）培养液、酶、抗生素等生物活性成分需过滤消毒（2）平衡盐等高压蒸汽消毒3、预热溶液4、工作间及超净台消毒：紫外线、消毒液。
5、洗手和着装6、进入无菌室7、关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行)将消毒过的所用物品放入超净工作台中组织块培养法培养鸡心肌细胞步骤1、配M199完全培养液：M199基础培养液90％小牛血清10％青霉素100IU/ml链霉素100?g/ml过滤除菌。
动物细胞原代培养实验项目指导
附件-4综合设计性实验项目指导一、实验项目名称：动物细胞原代培养及活力检测二、实验目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法及细胞活力的测定方法，为细胞工程中的胚胎移植、细胞融合与单克隆抗体制备等技术奠定重要的技术基础。
三、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。
这种培养过程是把组织或器官从动物体取出，分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断的生长和繁殖。
原代培养是建立各种细胞系的第一步。
利用原代培养技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。
原代培养科分为组织培养法和消化法两种。
台盼蓝染色法检测细胞活力的原理:台盼蓝是检测死、活细胞最常用的生物染色试剂之一。
健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，由于膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。
四、实验材料：1.新生兔2.大剪子、弯头眼科剪、小镊子、平皿、细胞培养瓶、烧杯、酒精灯、移液枪、超净工作台、细胞计数板、0.22μm细菌过滤器、移液枪、枪尖、PE手套、一次性无菌橡胶手套、脱脂棉、无水乙醇、台盼蓝、15ml离心管3. DMEM培养基、血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶五、实验仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、显微镜六、实验步骤（方案）：（如需要学生设计，也要提交一参考方案供论证评审）（一）DMEM培养基的配制1. 将DMEM培养基干粉用800ml超纯水溶解，加入3.7gNaHCO3，搅拌溶解，加入双抗（100IU/ml），调整pH为7.0，定容至1L，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，分装，并用封口膜封口，4℃保存备用。
2. 取一定量的配制好的DMEM培养基，按10%-20%的比例添加新生牛血清。
（二）新生兔细胞原代培养1. 准备（1）取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
（2）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
原代滋养层细胞的分离培养及鉴定
一、概述原代细胞是从组织或器官中分离得到的未经过传代培养的细胞，通常被用于研究细胞的特性和生物学行为。
在细胞生物学研究中，原代细胞的分离、培养及鉴定是非常重要的步骤，它们可以为科学家提供更加真实的细胞生理功能和反应。
本文将讨论原代滋养层细胞的分离培养及鉴定方法。
二、原代滋养层细胞的分离1. 准备工作在进行原代滋养层细胞的分离前，先准备必要的材料和试剂，包括消毒器械、胰酶、培养基和培养皿等。
2. 组织样本的处理将所需的组织样本取出并进行消毒处理，然后用无菌工具将其切割成小块。
3. 酶解和分离将组织样本块放入含有适量胰酶的培养基中，进行酶解和振荡分离，以获得细胞悬浮液。
4. 细胞分离通过离心等方法，将细胞悬浮液离心沉淀，然后将上清液中的细胞转移到新的培养皿中。
三、原代滋养层细胞的培养1. 培养基的准备根据原代滋养层细胞的类型和特性，选择适当的培养基，并添加相应的生长因子和营养成分。
2. 细胞的培养条件将分离得到的原代滋养层细胞接种于含有培养基的培养皿中，放置在恒温培养箱内，保持适当的温度和湿度条件，定期更换培养基。
3. 细胞的观察和维护利用显微镜观察细胞的生长情况和形态特征，定期对细胞进行传代培养，确保细胞的健康和稳定生长。
四、原代滋养层细胞的鉴定1. 形态学鉴定采用显微镜观察细胞的形态特征，包括大小、形状、胞浆及核的结构等，与已知的细胞形态进行比对鉴定。
2. 免疫细胞化学鉴定利用免疫细胞化学染色技术，检测细胞内特定蛋白的表达情况，例如细胞信号分子或细胞骨架蛋白等，来确定细胞的类型和特性。
3. 分子生物学鉴定通过PCR、Western blot等分子生物学技术，检测细胞内特定基因的表达情况，以确定细胞的遗传特性和分子水平特征。
五、结论原代滋养层细胞的分离培养及鉴定是细胞生物学研究中的重要环节，操作规范和技术熟练对于获得高质量的原代细胞至关重要。
只有通过严格的分离和培养条件，并结合形态学、免疫细胞化学及分子生物学鉴定等手段，才能得到真实、可靠的实验结果，并为细胞生物学研究提供可靠的资料。
原代细胞培养和细胞实验设计陈加祥
• （3）弃上清液，加入全M199培养液（含20%胎牛血清、100 ng/ml VEGF）4 ml，吹打使细胞重新 悬浮，移入培养瓶中，静置培养。
• （4）24 h后换液，以后每隔3天换液一次，约7天左右细胞长满汇合，可以传代。 • （5） 使用前运用标记因子CD31或VIII因子对内皮细胞进行鉴定。
• 血液中各种细胞的比重不同： 淋巴细胞与单核细胞：1.070 粒细胞和红细胞：1.092 • 将血液加至分离液上，通过离心，可使一定比重的细胞按 相应密度梯度进行分布。
2. 淋巴细胞分离步骤：
1. 抽取静脉血2ml，注含有肝素的无菌试管中摇匀，加入 2ml Hanks溶液稀释。
2. 吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分 离液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为 1:1:1）。
一、原代细胞的取材
取材的基本要求： （1）注意新鲜和保鲜：取材时应尽量在4-6 h内能制作成细胞； （2）严格无菌； （3）用锋利的器械切碎组织，减少对细胞的机械损伤；
（4）去除材料上的血液、脂肪、坏死组织及结缔组织；
（5）尽量选用易培养的组织进行培养。胚胎组织易于成熟个体组织，分化低易于分化高的组织，肿瘤 组织易于正常组织。
• （5）漂洗：将含有血清、钙、镁的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，漂洗2-3次后，加入完全 培养基。
• （6）机械分散：采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
注意事项
• （1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑制作用。 • （2）胰酶浓度不宜过高，作用时间不能太长，以免过量损伤细胞。 • （3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，而且动作要轻柔。
原代细胞的分离与培养实验怎么做？
原代细胞的分离与培养实验怎么做？
原代细胞是出了名的难养，对培养环境和实验操作的要求更苛刻。
原代细胞在体外通常只能传代少数几次，某些原代细胞（如神经元细胞）甚至无法进行传代。
对于研究人员来说，如何才能经济高效地培养好原代细胞，并围绕这有限几次传代的细胞设计实验，是更大的一个挑战。
原代细胞是取材于切除的动物组织，通过酶处理，在适当的条件下培养直至达到足够的数量。
分离的原代细胞有两种类型：贴壁细胞（锚定依赖性生长）和悬浮细胞（锚定非依赖性），贴壁细胞多来自器官组织，而悬浮细胞多来自血液系统的细胞。
从组织制备原代细胞，即使捱过了极其严苛的解离步骤，不严谨的分离操作可能会导致细胞生长缓慢、表型不一致甚至细胞污染，特别是由于组织中可能含有细菌等微生物，污染问题对于原代细胞的分离和培养是一个很大的隐患。
而为了让研究人员不再为这些问题头疼，现在已经出现了一些细胞公司可供应现成的原代细胞，并对应配有充分优化的培养基和实验方案，这使得原代细胞的培养和研究比以往要轻松得多。
而对于具备自主从组织中获取原代细胞的实验室，也建议以商业化的原代细胞作为对照，采用均一性和稳定性更好的P2/P3代次进行实验，并用专门的原代细胞培养基进行培养，最大限度提高原代细胞的生长。
原代细胞培养及应用的研究
原代细胞培养及应用的研究细胞是构成生命体的基本单位之一，可以分为原代细胞和细胞系。
原代细胞是从生物体中分离出来的最原始和最基础的细胞，具有很高的分化和再生能力。
原代细胞是进行细胞学和分子生物学研究的关键材料之一，而原代细胞的培养和应用研究，也是现代医学和生物学领域中重要的研究方向之一。
原代细胞培养的基本原理原代细胞培养首先需要从生物体中分离出细胞，然后将细胞放入培养皿中，加入含有生长因子和营养物质的培养基中进行培养。
培养基的成分要根据不同细胞类型的生长需求而判断，例如含有血清的培养基适合大多数细胞类型的生长，但肝、骨髓和齿髓等器官的细胞则需要具有不同特性的培养基。
原代细胞培养的优点相对于细胞系，原代细胞除了具有更高的分化和再生能力外，还可以保留原生态环境下的细胞形态和生物学特性，因此更适合进行细胞学和分子生物学研究。
此外，原代细胞培养还可以用于创造人工组织和器官，为组织工程、再生医学和药物筛选等领域提供技术支持。
原代细胞应用的研究进展原代细胞研究的典型应用之一是肿瘤研究。
肿瘤组织细胞本身可能十分异质，其分离和培养需要对肿瘤类型、生长状态和细胞质多样性进行全面地分析。
随着生物技术的不断发展，研究人员们已经对肿瘤原始组织的分离和原代细胞培养进行了深入的研究，这也为末期癌症的治疗和肿瘤预防提供了很好的基础。
此外，原代细胞还可以用于药物筛选和生物物质研究。
药物筛选是针对疾病的药物研究的重要环节之一，而对于某些具有高筛选难度或脆弱性的细胞类型，原代细胞的应用极为必要。
通过构建人工组织或器官的研究，原代细胞的应用还可以在医学和生物技术领域内探索一些尚未被研究的现象，为人类的研究探索和医学发展提供可能。
结论原代细胞培养及应用的研究是现代医学和生物学领域中的重要研究方向之一，其成果可以为肿瘤治疗、药物筛选、生物学研究等领域提供科学依据和技术支持。
虽然细胞培养技术已经相对成熟，但是在实际的应用过程中还是存在一系列的技术瓶颈和难点，对于原代细胞培养及其应用研究，我们还需要进行更为深入的研究和探索。
2021年细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学试验汇报细胞原代培养姓名:学号:班级:专业:同组组员:细胞培养是生物学和医学研究中最常见手段之一, 可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官一部分进行培养。
因为培养细胞刚刚从活体组织分离出来, 故更靠近于生物体内生活状态。
这一方法可为硕士物体细胞生长、代谢、繁殖提供有力手段。
同时也为以后传代培养发明条件。
原代培养方法:1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽可能剪碎, 每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks液洗涤2—3次, 自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
2、酶消化法将1mm3大小组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml0.125%胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液, 离心800rpm 5—10分钟搜集细胞。
弃上清, 加入带有双抗培养基, 放入培养瓶培养。
取材注意事项:取材要注意新鲜和保鲜。
取材应严格无菌。
取材和原代细胞制作时, 要用锋利器械, 如手术刀或剃须刀片切碎组织, 尽可能降低对细胞机械损伤。
要仔细去除所取材料上血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织, 切碎组织时应避免组织干燥, 可在含少许培养液器皿中进行。
取材应注意组织类型、分化程度、年纪等, 通常来讲, 胚胎组织较成熟个体组织轻易培养, 分化低较分化高组织轻易生长, 肿瘤组织较正常组织轻易培养。
二、试验目1、了解细胞原代培养原理2、熟悉细胞原代培养方法与过程3、了解细胞原代培养应用4、独立进行细胞原代培养操作三、试验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、 75%酒精棉球、酒精灯。
动物: 9-12日龄鸡胚蛋1、购置9-12日龄鸡胚蛋。
放入孵化箱中孵养待用。
2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中, 用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后, 气室处擦拭两遍, 用镊子小心去除气室部分蛋壳。
3、取D-hanks液按1:100加入双抗。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项一、原代细胞培养原代细胞培养是指直接从生物体获取细胞进行培养的过程。
原代细胞更接近体内细胞的生理状态，因此在研究细胞的生理功能和疾病机制方面具有重要意义。
（一）取材1、选择合适的组织来源：根据研究目的选择健康的动物或人的组织，如肝脏、肾脏、心脏、皮肤等。
2、无菌操作：在取材过程中，要严格遵守无菌操作原则，使用无菌器械和试剂，避免微生物污染。
（二）组织处理1、清洗：将组织用无菌的生理盐水或 PBS 缓冲液反复冲洗，去除血液和杂质。
2、剪碎：将组织剪成小块，一般为 1-2mm³大小。
3、消化：根据组织的类型和特点，选择合适的消化酶，如胰蛋白酶、胶原酶等，在 37℃条件下进行消化，使细胞分散。
（三）细胞分离1、过滤：消化后的细胞悬液通过滤网过滤，去除未消化的组织块和细胞团。
2、离心：过滤后的细胞悬液离心，去除上清液，收集细胞沉淀。
（四）培养1、接种：将细胞沉淀用培养基重悬，接种到培养瓶或培养皿中。
2、培养条件：根据细胞的类型和特点，选择合适的培养基和培养条件，如温度、CO₂浓度、湿度等。
一般来说，细胞培养的温度为37℃，CO₂浓度为 5%。
（五）原代细胞培养的注意事项1、取材要迅速，尽量减少组织在体外的停留时间，以保证细胞的活性。
2、无菌操作至关重要，任何一个环节的污染都可能导致培养失败。
3、消化酶的浓度和作用时间要适当，过度消化会损伤细胞，消化不足则细胞难以分散。
4、培养初期要密切观察细胞的生长状态，及时更换培养基，去除死细胞和细胞碎片。
二、传代培养当原代细胞生长到一定密度后，需要进行传代培养，以扩大细胞数量，维持细胞的生长状态。
（一）细胞准备1、观察细胞：在传代前，要观察细胞的生长状态，确定细胞是否达到传代的密度。
2、消化：根据细胞的类型和特点，选择合适的消化酶进行消化，使细胞从培养表面脱落。
（二）细胞收集1、离心：消化后的细胞悬液离心，收集细胞沉淀。
原代细胞培养实验（药理）
原代细胞培养实验（药理）一.细胞培养的基本原理细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。
细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。
细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。
在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动(运动)或其它变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。
培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。
在细胞培养中，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。
细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，该方法能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。
通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。
如心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%;而经纯化分离的心肌细胞悬液中，心肌细胞可达95%以上，这样，心肌细胞原代培养实验基本不受其它细胞的干扰。
在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程;用定时显微摄影记录可发现一些肉眼观察不到的生命现象;还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法等来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。
此外，还能节约研究费用。
如在某些研究中，用100只动物做实验所获得结论与用100张盖玻片或几十个培养瓶而获得结论具有相同的统计学意义，而细胞培养较之大批量的动物饲养花费要小。
但细胞培养方法也存在不足之处：培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。
培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、酶、抗原等。
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Case：新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋白与基因实验设计一、细胞：分离大鼠原代心房肌细胞二、细胞培养分组：a)对照组：正常大鼠原代心房肌细胞72h培养b)高糖72h培养c)高糖+氧化应激抑制因子72h培养d)正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24he)高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24hf)正常培养48h+（氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子）共同培养24h三、蛋白检测：WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。
四、荧光定量检测：荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。
实验报告一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养：1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃，5％CO2 培养箱中培养；5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、新生SD大鼠心房肌细胞的α-actin免疫荧光鉴定：1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗（嘉美生物公司）， 37℃条件下放置1h；6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。
200×400×三、Real-time PCR检测SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A基因、B基因、FKBP12.6 mRNA表达水平1、总RNA的提取：（1）将细胞培养液吸出后，用PBS洗细胞2次，加入1 mL Trizol室温裂解细胞5min，用移液器均匀吹下细胞并置于EP管中，上下轻柔颠倒10次，室温静置5min；（2）加0.2 mL氯仿，颠倒混匀10次，室温静置5min，4℃，12000rpm，离心20min；（3）转上层水相于另一新EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀10次，-20℃放置2h后，4℃，12000rpm，离心15min；（4）用移液器小心吸弃上清，加冰预冷的75%乙醇，4℃，12000rpm，离心10min；（5）弃上清，EP管倒扣，空气干燥10 min；（6）将总RNA溶于适量DEPC处理水中，最后用分光光度计测量其浓度。
2、第一链cDNA合成（Genecopoeia试剂盒）（1）反应体系（20μL）：Total RNA 2μgOligo (dT)18 1μL10mM dNTPs 1μL5×RT Buffer 4μLRibonuclease Inhibitor 0.5μLTransScript RT 1μLddH2O to final volume 20μL（2）轻轻混匀后，进行：a) 42℃孵育30min.b) 85℃孵育5min.c) -20℃，保存备用.3、Real-time PCR（Genecopoeia SYBR Green I 荧光染料试剂盒）（1）引物序列：a、CaMK-ⅡδF：CTGGCACACCTGGGTATCTTCaMK-ⅡδR：ATCCCAGAAGGGTGGGTATCb、A Gene F：TAACCTACCAGGCCGTGGATA Gene R：GCTGCGATCTGGATAAGTTCAAc、B Gene F：GCAGTTGACTGAGGCGTCTTB Gene R：GGATTCGTGAGTGGCGATACd、FKBP12.6 F：CTGGAATTCATGGGCGTGGAGATCGAGFKBP12.6 R：GACTCGAGTCACTCTAAGTTGAGCAGCTCe、β-actin F：GACGGTCAGGTCATCACTATCGβ-actin R：ACGGATGTCAACGTCACACTTC（2）反应体系（25μL）：F引物 0.5μLR引物 0.5μLSuperMix 12.5μLPassive Reference Dye 0.5μLcDNA 2μLddH2O 9μL（3）程序设置如下（Eppendorf PCR仪）：95℃ 3min95℃ 20s55℃ 20s 40循环72℃ 20s95℃ 15s60℃ 15s60℃-95℃ 20min95℃ 15s（4）Realplex软件导出数据并分析CAMK-II基因A基因B基因FKBP 12.6基因四、WB检测新生SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A蛋白、B蛋白、FKBP12.6蛋白表达水平1、实验材料PBS、细胞裂解液、PMSF、BCA试剂盒（嘉美生物）、5×蛋白上样缓冲液、脱脂奶粉，CaMK-Ⅱδ一抗（Abbioscience）、B蛋白一抗（Abbioscience）、FKBP12.6一抗（Abbioscience）、β-actin一抗（Abbioscience）和B蛋白一抗 (Millipore)、山羊抗兔-HRP二抗(abcam)、ECL Reagent（嘉美生物）、显影剂、定影剂。
2、实验仪器细胞刮、1mL注射器、EP管、移液器、冷冻离心机、摇床、酶标仪、电泳器材、PVDF膜、电转器材、X光片、压片盒。
3、实验方法（1）细胞裂解液配制：基础裂解液中加入0.2mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂。
（2）蛋白样品制备：①弃去六孔板细胞中的培养基。
②每孔细胞中加入2mL 4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动2min洗涤细胞，然后弃去PBS洗液。
重复以上操作。
③每孔加入100μL细胞裂解液在冰上对细胞进行裂解，然后用细胞刮将细胞刮下，最后将裂解液移入干净的EP管中。
④将EP管中细胞冰上裂解30min，在此期间用1mL 注射器对裂解液进行反复抽吸20次。
⑤裂解完后，于4℃，12000rpm离心20min。
然后将上清移入新的1.5mL EP管中，即为所需蛋白样品。
⑥每样本取3μL 蛋白提取液转入另外的EP管保存备定量用。
向其余蛋白样品中加入其1/4体积的蛋白上样缓冲液，沸水煮5min，最后将其－80℃保存。
（3）蛋白浓度测定：根据嘉美生物BCA试剂盒说明书中步骤进行实验。
具体步骤如下：①将0.5μg/μL 蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16ul加到96孔板中，然后将各孔用细胞裂解液补足到20μL。
②每样品加2μL 到96孔板的样品孔中，然后将各孔补加18μL 的细胞裂解液。
③各孔加人200μL BCA工作液（BCA试剂A: BCA试剂B=50: 1），37℃条件下放置30min。
④用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度。
最后根据标准曲线计算蛋白浓度。
实验结果见后面结果部分内容。
（4）SDS-PAGE电泳：①配胶：CaMK-Ⅱδ（1.5mm 10%分离胶, 5%浓缩胶）、A蛋白、B蛋白（1.5mm 5%分离胶，4%浓缩胶）、FKBP12.6（1.5mm 15%分离胶，5%浓缩胶）②上样：取制备好的蛋白样品，使用前沸水煮5min，12000rpm离心2min。
各样本之间平衡后，每泳道上样45μL。
③电泳：浓缩胶60V，分离胶100V，溴酚蓝移动至玻璃板底端，提示电泳结束，关闭电源。
（5）转膜：①将PVDF膜放到甲醇中浸泡2min，然后把转膜海绵垫、滤纸、PVDF膜放置于电转液中平衡30min。
②将转膜夹打开，在代表负极的黑色面铺上一块湿润的海绵垫，再添加2层湿润的滤纸，将电泳好的SDS-PAGE分离胶小心地铺在滤纸上方，表面再覆盖大小合适的PVDF膜；然后再覆盖两层湿润滤纸，再垫上湿润的海绵垫，最后将转膜夹的红色面与黑色面闭合好，将其放入转膜槽中相应的位置。
③转膜CaMK-Ⅱδ（100V，60min）；A蛋白、B蛋白（100V，180min）；FKBP12.6（80V，30min），转膜全过程在冰上进行。
④丽春红染色：转膜完成后，将膜从转膜夹中取出，立即投入丽春红染液中染色，大约染色3min 后将膜从丽春红染液中取出，用DDH2O轻轻冲洗膜，注意观察膜上的红色条带，当条带足够清晰后停止水洗，根据蛋白Marker位置适当剪膜，留出目的蛋白所在的范围。
最后用DDH2O 彻底洗膜，尽可能洗去残留的丽春红染料。
（6）封闭：室温条件下，5%脱脂奶粉+TBST在摇床上封闭1h。
（7）一抗杂交：CaMK-Ⅱδ（1:500）、A蛋白（1:200）、B蛋白（1:50）、FKBP12.6（1:300）、β-actin （1:1000），4℃孵育过夜。
（8）洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
（9）二抗杂交：山羊抗兔-HRP二抗（1:2500），室温孵育1h。
（10）洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
（11）显影：首先，用滤纸吸去膜上的液体，将膜平放于保鲜膜上，将新鲜配置好的ECL Reagent 滴加到膜面上，反应3min后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的ECL Reagent，然后根据条带的亮度将膜放到压片夹中曝光适当的时间，最后，显影、定影、冲洗胶片及对胶片进行扫描分析。
BCA试剂盒蛋白定量实验结果：标准品OD值分别为：0.488、0.519、0.559、0.603、0.668、0.759、0.884LG组、NG组、HG组、HG+U组OD值分别为：0.646、0.677、0.671、0.698ONOO组、DC-ONOO组、ONOO+U组OD值分别为：0.816、0.703、0.79、0.612WB实验结果：嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。
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