水稻籼粳杂种育性位点S5的作用机理

水稻籼粳杂种育性位点S5的作用机理
摘要：普通栽培稻可分为籼、粳两个亚种，籼、粳亚种间存在生殖隔离，导致籼粳杂种通常不育。

研究发现，水稻第6号染色体S5位点被译码成3个紧密连锁的基因（ORF3 to ORF5）与水稻籼粳杂种的育性有关。

在雌性孢子生殖的过程中，ORF5+（杀手）和ORF4+（协作者）的作用是导致细胞内质网胁迫。

ORF3+(保护者)能阻止细胞内质网胁迫和产生正常的配子,但是ORF3_不能阻止细胞内质网胁迫，导致细胞早熟性程序性死亡和胚囊败育。

ORF3+配子的优先传递导致后代的偏分离。

这些研究结果增加了我们对籼粳亚种区别的认识，并有助于水稻遗传改良。

关键词：籼粳杂种育性 S5 ORF5+ ORF4+ ORF3+ ORF3_
背景介绍
亚洲栽培稻分为籼稻和粳稻两个亚种，籼粳亚种间的杂种优势要远大于籼粳亚种内的优势。

但由于自然界普遍存在的亚种之间生殖隔离法则，籼粳稻亚种间杂种育性下降，结实率很低。

受此制约，长期以来，杂交水稻的育种工作基本限制在亚种内进行，亚种之间更加强大的杂种优势难以得到利用。

国际水稻科研工作者在上世纪80年代就发现，S5可能是控制水稻籼粳杂种不育性状，导致广亲和现象的主效基因位点。

从1990年开始，张启发课题组经过18年努力，并与多家研究单位合作，于2008年成功克隆了S5位点的5号基因。

但他们仍困惑的是，仅5号基因作用无法解释该位点引起杂种不育机理。

2012年9月，张启发院士在SCIENCE杂志上发表《A Killer-Protector System Regulates Both Hybrid Sterility and Segregation Distortion in Rice》。

此次发表最新成果表明，两个与之紧密连锁的基因(3号和4号基因)与5号基因协同作用控制杂种不育及广亲和现象。

研究人员聚焦于水稻染色体上的一个特殊区域：S5，此前他们曾发现这一区域与杂种不育有关。

结果研究人员发现了三个紧密连锁的基因：ORF3，ORF4，ORF5调控着籼-粳稻杂种的不育性，他们表示，其中ORF5基因扮演着“杀手”的角色，ORF4辅助它，而ORF3则功能相反，作为保护者存在。

在籼稻-粳稻杂种中，杀手基因和它的助手合作，杀死了雌性配子，或称卵子，而保护基因则积极地挽救雌配子。

研究人员具体解释道，ORF5基因能编码一种分子，传递信号给ORF4，从而导致细胞内质网上的胁迫增加，并最终激活了ORF3，而ORF3的作用正是稳定和保护内质网。

研究人员发现这种杀手-保护者系统是这两种水稻间杂交不育的基础，他们提出，ORF4 和ORF5这种非致命性的组合允许籼稻-粳稻杂种将其基因传递给后代，从而克服这一杂种不育现象，为培育更为理想的水稻品种奠定基础。

这项研究得到了国家自然科学基金会、863项目及111项目的资助。

国际稻子研究所的D.S. Brar提供了稻种。

生殖隔离既是物种形成的指标又是维持物种本身特性的机制。

DobzhanskyMuller模型（1）暗示杂交不亲和性源自存在生态差异的种群独立地发展轨迹产生有害的相互影响。

在植物中，杂种不育是生殖隔离的一种主要表现形式，一些基因被识别证明了DobzhanskyMuller模型可以用来研究和分析生殖隔离（2—5）。

水稻籼粳亚种间杂种不育是生殖隔离的一个典型例子（6—8）。

籼粳杂种基因的分析鉴定了很多对杂种不育起条件作用的场所。

近年来籼粳杂种不育和亚种内普通栽培稻、展颖野生稻(14)杂种不育的一些基因被克隆，有助于我们对水稻杂种不育的生物学过程的理解。

S5位点的主要组成及对后代的影响
许多关于大范围的种质研究鉴定了S5是水稻中杂种不育的一个主要位点，它影响胚囊的育性(9,12—16)。

S5位点有三个等位基因，一个籼稻等位基因S5-i，一个粳稻等位基因S5-j,一个中和的基因S5-n(15).基因型为S5-i/S5-j的杂种大部分不育，然而基因型为S5-n/S5-i或S5-n/S5-j的杂种大部分可育（12—14）。

S5区域被定位成覆盖了5个开放阅读框（ORF1 to ORF5）。

ORF3 to ORF5（9）从一个籼稻品种到一个粳稻品种的转化研究表明减少了育性，由于胚囊败育，因为转化捕获了籼稻的ORF5，然而ORF3 to和ORF4的转化育性未受到影响。

籼稻和粳稻的等位基因ORF5被翻译成一种蛋白酶，被两个核苷酸区分开来，鉴于广亲和等位基因在预测蛋白的N末端有一段大的缺失，导致亚细胞内生成无限的蛋白（9）。

因为在籼粳杂种的后代中观察到偏分离现象（8,16,17），我们分析了195株BL(BL/NJ)的BC6F1幼苗的S5基因型，含有S5-i籼稻品种Nanjing11作非轮回亲本与作为轮回亲本的粳稻品种Balilla成功地回交。

后代的基因型分离比被期望为1:2:1（Table1）。

序列S5-j传递给雌配子的最大可能性概率估计为0.1，和期望的概率为0.5相比。

在其它的籼粳杂种中也发现到相似的偏分离现象（Table1）。

因为单独地用ORF5解释杂种不育和偏分离比较困难，我们决定还研究Nanjing11（籼），Balilla（粳），Dular和02428（最新培育出的两个与籼稻或粳稻杂交后代高度育性广亲和品种）的ORF1 to ORF4序列。

通过可预测的基因型表达的蛋白功能改变，我们发现ORF3 to ORF4的序列存在多态性，但ORF1 to ORF2没有（fig.S1）. ORF4 和ORF5的起始密码子相距0.8Kb,但基因的转录沿相反的方向。

Balilla和02428的ORF4序列被预测翻译成一个带有跨膜运输区域（fig.S2）且与任何已知蛋白无同源性的蛋白.相对于Balilla和02428而言，Nanjing11和Dular的ORF4序列一个长度为11bp的缺失片段预计导致预测的蛋白早熟性终止和一般认定的跨膜运输区域缺失（fig.S2）。

ORF3序列被定位与ORF4序列相距11.7 Kb 且表现出与热动蛋白Hsp基因具有同源性。

Balilla和Dular的 ORF3序列相对于其它两种基因型缺失一段长度为13bp的序列（fig.S1），造成蛋白质羧基段的移码突变（fig.S3）。

在这些ORFS序列的不同点基础上，我们标明ORF3等位基因，Nanjing11和02428为ORF3+，另一个为ORF3-；ORF4等位基因，Balilla和02428为ORF4+，另一个为ORF4-；ORF5等位基因，Nanjing11为ORF5+，Balilla为ORF5-，那些来自Dular和02428的为ORF5n.
ORF3的作用机理及其与ORF5+的关系
我们测试了ORF3对杂种不育的效应，通过杂交成转基因Balilla ORF3+植株[将Nanjing11的ORF3+转移到Balilla中表现出正常的育性(Table2)]通过BL(NJ/NJ),一个S5位点的近等基因系包含ORF3 to ORF5 Nanjing11（ORF3+，ORF4-，ORF5+）基因渗入进Balilla 背景（ORF3-，ORF4+，ORF5-）。

Balilla和BL(NJ/NJ)杂交典型地产生育性减少的杂种（Table1）。

然而BL/ NJ ORF3+F1植株表现71.5%的小穗可育，BL/ NJ植株50.3%的小穗可育（Table2）。

这种挽救在异型接合的植株BL/ NJ ORF3+的后代中进一步被证实了，BL/ NJ ORF3+植株的育性（75.1%）明显高于BL/ NJ植株（46.8%）。

因此，我们可以推断出ORF3+挽救了籼粳杂种的育性，大概是通过阻止ORF5+的杀手效应来保护配子。

正常的和ORF3+挽救的植株比较[BL/ BL或NJ/NJ对BL/ NJ ORF3(Table2)]表明ORF3+只有部分的育性保护效应。

因为我们期望只接近一半的配子继承了ORF3+转移基因，我们怀疑单独地发布信息转变异型接合的ORF3+与主效S5位点有关来解释这些观察。

为了支持我们的假设，我们将Balilla ORF3+携带了转入的ORF3+和Balilla ORF5+携带了转入的ORF5+进行杂交（Table2）。

后代植株中缺乏任何一个转入的基因表现完全可育，单独携带有ORF3+的植株一样完全可育。

转基因ORF5+植株不育，反而增加了转基因ORF3+挽救了植株的育性。

Fig. 1. Schematic representation of the killer-protector system in an indica-japonica hybrid regulated by the S5 locus. (A) A genetic
model depicting the process of megaspore formation and effects of the three genes, where 3+, 3–,4+, 4–, 5+, and 5– represent ORF3+, ORF3–, ORF4+, ORF4–, ORF5+, andORF5–, respectively, and colored blocks and circles represent the proteins. In the megaspore mother cell and daughter cells immediately after meiotic divi-sion, killing would not occur because of the presence of ORF3+. Killing would occur in the daughter cell carrying ORF3– and ORF4+ at a later stage of megaspore development. (B) Hypothetical molecular processes involving ER-stress and PCD.bZIP50-S, spliced bZIP50; ER, endoplasmic reticulum; PM, plasma membrane.
ORF4+的作用机理及其与ORF5+的关系
转入ORF4+的BL(NJ/NJ)形成的BL(NJ/NJ) ORF4+转基因植株育性没有降低（Table3），由于保护者ORF3+基因片段的渗入。

同样，BL(BL/DL)*BL(BL/NJ)杂交成的Dular片段（ORF3-，ORF4-和ORF5n）的育性正常，不管等位基因片段是籼稻还是粳稻（Table3）。

然而，在BL(NJ/NJ) ORF4+* BL(DL/DL)杂交F1代中，BL(DL/NJ) ORF4+展示出减少小穗育性（39.3%），和转基因效率低的植株BL(DL/NJ)或亲本BL(NJ/NJ) ORF4+相比。

更进一步的，BL(DL/NJ) ORF4+植株的F2代个体的S5位点发生了偏分离（Table3），NJ片段（大约占0.654），DL片段（大约占0.346）。

因此，DL/DL序列的异型接合体不足期望的1:2:1比例。

因此，进一步增强了ORF4+造成这种含有Dular片段的杂种配子的死亡。

为了检验ORF4+和ORF5+的关系，我们将BL(BL/DL)与Balilla ORF5+杂交（Table3）。

在F1中，转移了两个ORF5+（BL/BL ORF5+和BL/DL ORF5+）的基因型大部分不育，但很少转如该基因的对照植株可育。

在这种杂交的F2分离群体中观察到同样的现象。

而且,由于Dular基因型增加了一个ORF5+，DL/DL ORF5+是异型接合的，表现正常的育性，BL(BL/NJ)的育性未受到传递的ORF5+的影响。

假设Balilla和Dular均含有ORF3-和非杀手ORF5，BL/DL ORF5+和DL/DL ORF5+之间的育性不同可以归因于Balilla和Dular之间的ORF4不同（figs.S1 和S2）。

因为杀死配子，ORF5+和ORF4+都是不可缺少的。

ORF4很明显是ORF5杀死配子的助手。

上述S5位点引起杂种不育的基因的分析的结果被概括地呈现为图解Fig.1A。

在孢子生殖过程中，籼粳杂种的雌配子被ORF5+（杀手）和ORF4+（助手）共同作用杀死，但被ORF3+保护。

ORF3 to ORF5作用的分子机理
一份表达数据库（18）指出ORF4和 ORF5表现低表达—几乎遍布整个生命的背景水平（fig.S4）. ORF3副本被较多的抛弃，特别是在正在发育的圆锥花序中。

水稻原生质体短暂的表达的定量分析揭示了ORF3+和ORF3-蛋白位于细胞内质网（ER）(fig.S5,A to H). ORF4+位于细胞膜上和高尔基体上（fig.S5,Q to T）,但ORF4-位于细胞内质网上(fig.S5,I to P). ORF5蛋白位于跨膜区（9）。

在功能大孢子阶段，对植物的子房进行微阵列分析发现ORF3表达在Balilla ORF5+高效转基因植株中比在低效转基因植株中高（tableS1）。

我们探测到在-256bp（fig.S1）处ORF3的启动子区域有一细胞内质网胁迫应答UPRE-像顺式作用元件（TGACGAGG）(19)。

细胞内质网胁迫应答基因的表达量也在Balilla ORF5+植株中较高（表1和fig.S6A）。

这种形式的感应与观察到的水稻内质网胁迫的研究高度相似（20-22）。

作为对胁迫的反应(22)，细胞内质网胁迫传感器IRE1通过OsbZIP50mRNA特异的粘接处来转换信号，导致一个移码突变在OsbZIP50-S翻译的蛋白质中产生一个核心位点信号，这与许多细胞内质网胁迫应答基因的表达有关，包括ORF3.我们证实了粘接的OsbZIP50-SmRNA出现在Balilla ORF5+植株中（fig.S7）。

总的来说，这些结果表明Balilla导入的ORF5+引起了子房的细胞内质网胁迫。

Bax inhibitor-1(BI1)是真核细胞中的一种保守的抑制内质网所在细胞死亡的物质且在拟南芥和水稻中调制细胞内质网胁迫调停程序化的细胞死亡（PCD）途径中发挥重要作用（23,24）。

我们的分析（fig.S6B）表明OSBI1在Balilla ORF5+植株中起正调节作用。

OSKOD1[一种致死之物（KOD）的直系基因,在拟南芥中作为PCD的引发者]（25）和Hsr203j(通用的细胞死亡标记)（21,26）也被ORF5+正调节。

OsCP1的表达作为水稻形成反光色素层的PCD过程的执行者（27，28），在Balilla ORF5+植株的子房中大约发生了12次折叠。

Balilla ORF5+高效转基因和低效转基因植株有许多不同类地表达的基因揭示了微阵列涉及到PCD，如细胞色素P450，LTPL,和GDSL基因系（28）。

这些结果表明ORF5+引发细胞内质网胁迫可能在胚囊发育中激发了异常的PCD。

我们对dUTP末端进行了标记（TUNEL）通过探测雌孢子生殖过程中的DNA序列来检验PCD。

在减数分裂前没有发现细胞异常或TUNEL信号（fig.S8，A 和B）。

Balilla ORF5+的次孢子母细胞经历减数分裂和之后，观察到细胞异常（fig.S8，C to G）. TUNEL信号在Balilla ORF5+中出现的比在Balilla中更早更强烈（fig.S8，C to G）。

因此，在Balilla ORF5+的雌孢子生殖过程中发生早熟型PCD，导致胚囊败育。

相反，通过Balilla ORF5+和Balilla ORF3+杂交产生转入ORF3+的Balilla ORF5+杂种植株恢复了细胞内质网胁迫应答和涉及PCD 的基因正常的表达水平（fig.S9）。

这暗示了ORF3+是ORF5+引发细胞内质网胁迫和后来的PCD的抑制物。

在这些结果的基础上，我们假设（Fig.1B）,细胞外的ORF5+产生了一种被位于细胞膜上的ORF4+感应和作为细胞内质网胁迫的最后扳机分子。

细胞内质网胁迫随后地驱动IRE1介导的OsbZIP50mRNA的粘接处，生成OsbZIP50-S，作为开启细胞内质网胁迫应答基因表达的一个引子，包括ORF3。

细胞内质网胁迫被ORF3+的呈现所消解，因此产生正常的雌性配子。

然而缺少ORF3+，没有被消解的细胞内质网胁迫引入了涉及PCD的基因，形成异常的PCD，导致胚囊败育，尽管有OsBI1的呈现。

因此，被ORF3、ORF4、ORF5翻译的蛋白质是涉及不同阶段的细胞内质网胁迫引发与杂种育性相关的PCD途径的基础。

我们获得了覆盖不同的地里区域的来自16个国家的普通栽培稻，普通野生稻和泥瓦拉野生稻的82份材料的ORF3、ORF4、ORF5序列（tableS3）。

19份单倍体材料被容纳的SNPS 和ORF3编码序列的插入缺失标记鉴别（fig.S10）。

其中的4份单倍体材料被归入ORF3—等位基因群，另外的15份材料被归入ORF3+等位基因群。

用来探测ORF4的18份单倍体材料中的5份被归入ORF4—群中，13份归入ORF4+群中。

ORF5(ORF5+, ORF5—和ORF5n)（29）被鉴别含有三种等位基因群。

这三种基因共有12种可能的组合。

我们观察到12种组合中的9种（tableS4）。

ORF3+,ORF4+和ORF5+是最常见的组合，特别在普通野生稻和泥瓦拉野生稻中。

根据我们的基因的模型，这种组合代表着杀死和保护配子之间的平衡。

外集团展颖野生稻的序列表明ORF3+,ORF4+和ORF5+是祖先的组合类型。

ORF3—,ORF4+和ORF5+这种致死的组合，不能在自然界中存活，在我们的样品中也未观察到，虽然它最容易被新种或合并种的种群所替代。

另外的两种组合（ORF3—,ORF4—和ORF5+；ORF3—,ORF4—和ORF5—）也没有被检测到，由于它们的稀少。

这些结果和提出的杀手保护系统基因的模型是一致的。

像典型的籼稻（ORF3+,ORF4—和ORF5+）和粳稻（ORF3—,ORF4+和ORF5—）类型的野生稻中也被发现，表明籼稻和粳稻的祖先很可能起源于被驯化成栽培稻以前。

因为籼稻和粳稻（像籼稻和粳稻的野生稻）分布在世界的不同区域，地理隔离在维持水稻种群的特异性中发挥重要作用，杀手保护者系统也是。

杀手保护者系统可能对揭示水稻的进化和多样性具有深远意义。

杀手（ORF4+，ORF5+）融合了籼稻和粳稻的不同的基因，促使籼粳杂种不育，这是水稻基因库中的基因的多样性的主要资源，然而ORF3+（保护者）和非杀手组合ORF4和ORF5会允许异交和基因的交流，因此，在物种水平上提供了一个条理分明的思路。

本文基本上是自己根据张启发课题组发表在SCIENCE杂志上的论文《A Killer-Protector System Regulates Both Hybrid Sterility and Segregation Distortion in Rice》翻译而成的，旨在阐述水稻籼粳杂种育性位点S5各组成基因的作用及其分子机理。

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