酶活性浓度的测定技术PPT幻灯片

3．荧光法和放射性核素法 对于一些酶浓度 很低的标本，用普通的分光光度法往往测 不出来，此时可考虑改用灵敏度较高的荧 光法或放射性核素法。
▪ 荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率，此 速率与酶浓度成正比，并通过荧光光度计进行测 定，根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。例如， 还原型的NAD(P)H有强烈的荧光，故所有以 NAD(P)＋为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进 行测定。
▪ 大多数酶促反应进程曲线表明，在酶促反 应一开始的阶段，底物 [S] 浓度不断下降， 随之有相应产物 [P] 产生。但由于各种因素 的影响，反应速率比较慢，这段时间称为 延滞期（1ag phase），可以是几秒至几分 钟。尤其是双底物反应或需要辅酶参与者， 通常为1～3min。
▪ 随后在过量的底物存在下，反应速率加快 并达到一个反应速率稳定的阶段，即酶促 反应以恒定的速率进行，不受底物浓度的 影响，这段反应称为线性反应期（1inear phase）或零级反应期（zero order）。产物 [P] 和底物 [S] 与时间t成线性关系。
第四节 酶活性浓度的测定技术
▪ 体液中酶的测定是临床生物化学检验的一项重要 内容。二十世纪50年代人们用分光光度法建立了 连续监测酶活性浓度方法，到60年代特别是80年 代以后，由于各种工具酶和酶分析试剂盒的生产 与普及，自动和半自动生物化学分析仪的引进和 应用，使得各种体液酶的测定在方法学与临床应 用方面有了长足的进步与发展。
▪ 缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是 否都是零级反应。
▪ 图6-4显示定时法中酶促反应的三种可能过 程。虽然从t1到t2三种反应所生成的产物量 相同，但实际反应过程有很大差别。曲线1 说明酶促反应速率接近终点时已经减慢， 曲线2说明在反应早期存在延滞期。只有曲 线3时，用定时法可以准确测定代表酶活性 浓度的反应速率。
一、概 述
▪ 正常人血中大部分酶一般在pg（10-12克）到ng （10-9克）水平，要直接测定这种微量酶蛋白是十 分困难的。
▪ 常用的酶学测定方法则利用酶有加速化学反应 （催化）的特性，通过测定被加速化学反应的反 应速率，根据酶促反应中底物的减少量或产物的 生成量来计算酶活性浓度的高低。这种 浓度的确切名称是“酶的催化活性浓度” 或简称为“酶活性浓度”。
▪ 这类方法有多种命名，如“取样法”、 “终点法”或“两点法”。用此类方法测 定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选 定的温度下作用时间要很精确，否则会引 起较大误差。
▪ 这种方法的优点是比较简单，因测定时酶 促反应已被终止，故比色计或分光光度计 无需保温设备，显色剂的选择也可不考虑 对酶活性的影响。
▪ 核素法因有污染且操作烦杂，目前应用较ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
4．其他方法 当酶促反应涉及酸碱变化时， 可用pH仪或电位滴定仪测定酸碱度变化来 计算酶浓度。这类方法需要一定仪器，操 作麻烦。此外，各种电极法、旋光法、极 谱法、高效液相色谱法或生物发光法等也 可用于测定特定的酶或进行酶学研究。
Note
▪ 极谱法（polarography） 通过测定电解过程中所得到的极化电极
▪ 因此，用定时法准确测定酶活性浓度，必 须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时 期，确定线性时间，然后在这段时间进行 测定，避开延滞期和一级反应。
2．连续监测法 连续测定酶反应过程中某一 反应产物或底物的浓度随时间变化的多点 数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活 性浓度的方法称为连续监测法。与定时法 不同的是，这类方法勿需停止酶促反应， 不需添加其他呈色试剂，就可测定反应物 的变化，很容易观察到反应的整个过程。 在以往的一段时期里，常把这类 方法称为“动力学法”或“速率法”。
的电流-电位（或电位-时间）曲线来确定溶 液中被测物质浓度的一类电化学分析方法。
二、酶活性浓度测定方法
▪ 测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最 为常用的方法，具有迅速、灵敏、成本低 等特点。
▪ 可根据酶促反应进程曲线，采用合理的方 法进行酶活性浓度的测定。
（一）酶促反应进程
▪ 如将酶促反应过程中测得的产物 [P] 或底物 [S] 变化量对时间作图，可得酶促反应时间 进程曲线（图6-2）。图中产物 [P] 或底物 [S] 变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。
▪ 为了计算酶活性浓度，必须根据线性反应 期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度， 否则将导致误差。在延滞期、非线性反应 期所测得的结果不准确，一般结果偏低。
（二）酶活性浓度测定方法
▪ 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速 度（v）达到最大速度Vmax，即在过量底物 存在下的零级反应期的速度，此时反应速 度与酶浓度 [E] 之间有线性关系。
▪ 如按反应时间将酶活性浓度测定方法进行 分类，可分为定时法（fixed time assay）和 连续监测法（continuous monitoring assay） 两大类。
1．定时法 这是早期测定酶活性浓度的方法。
▪ 大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、 强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定 这段时间内底物的减少量或产物的生成量， 计算酶促反应平均速度。
▪ 随着时间的延长，由于种种因素，如底物 因酶反应消耗而浓度下降，产物浓度上升 出现逆反应，反应产物可能有抑制酶反应 作用或酶的热失活等，使酶促反应变慢， 即反应速率下降，偏离线性，这段时间称 为一级反应期（first order）。
▪ 反应速率与底物 [S] 成正比，产物[P] 与时 间t不成线性关系。如果反应速率受两种或 两种以上物质浓度的影响，则反应可为一 级、二级或多级反应，一般将这段反应时 间统称为非线性反应期。图6-3显示单试剂 速率法酶促反应进程曲线。
2．分光光度法 从50年代起采用分光光度法取代比 色法，其最大优点在于扩大了测定范围，波长范 围更宽。酶促反应的底物与产物结构不同，光吸 收谱也有差异，不仅能在可见光范围测定有色溶 液的浓度，还能在紫外光波长范围测定特异的带 有双键或环状结构的无色物质。
▪ 结合各种工具酶的偶联反应，如应用NAD(P)H和 NAD(P)＋吸收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活 性浓度的方法，使分光光度法得到了进一步发展， 几乎可应用于各种血清酶活性的测定。随着各种 自动生物化学仪和配套用试剂盒的普及应用，这 一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。