LAMP

LAMP（环介导等温扩增）技术
2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩增分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网
PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。

然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。

2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。

通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。

LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。

可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。

目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。

详见：/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=1
1. 优缺点介绍：
LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是D
NA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。

LAMP方法缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重，因此我们强烈推荐在进行试剂盒的研发过程中采用实时浑浊仪，不要把反应后的PCR管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合LAMP方法。

2. 对比目前国内实验室同类检测设配使用情况
目前国内基因诊断常采用PCR方法，涉及到PCR仪，该仪器价格国产和进口价格不一，便宜的2～3万也能买到，贵的20多万。

条件比较好的实验室和国家机构也有尝试荧光定量PCR方法的，该方法技术含量高，必须使用荧光定量PCR仪，价格在20～70万不等。

LAMP产品在临床诊断中是不需要特殊仪器的，但临床使用的成品试剂盒有赖于和国内拥有毒株的老师合作开发针对中国国情的疾病LAMP引物，在研发过程中由于涉及引物的选择，引物浓度的调整，及反应温度和时间的优化，需要用一种量化的方式去帮助研究者分析选择数据，因此我们推荐用荣研公司的专利产品LA-320C实时基因扩增仪。

3. 操作的便捷性
LAMP方法较其他基因诊断方法，其最大的优势就在于操作的简便性及对仪器设备和人员要求低。

L AMP操作步骤少，只需按照说明书要求将反应液、酶、引物和模板按照规定的量加入PCR管中，置于水浴锅或恒温箱反应30～60min，通过肉眼观察反应管是否变为白色浑浊就能判断结果。

详情请查看下列pdf文件：“LAMP资料”
们做了一个多重PCR分子鉴别诊断，同时检测十多个呼吸道细菌和病毒病原体（包括非典病毒），而和我们合作在国内做临床报批的单位，因为手头有较多的病人标本，也在给日本的那家公司做LAMP非典诊断的临床。

这几年，LAMP技术在国内推广得很好。

我走到那里都有人跟我讲LAMP的应用。

的确，LAMP技术有许多明显的优点：
（1）恒温扩增，扩增阶段对仪器的要求低。

（2）视觉直观检测，不需要检测仪。

（3）反应速度快，敏感性高。

（4）用多个引物，特异性好。

（5）价格便宜。

这么多优点，就是该技术能“热”起来的根本原因。

不过，仔细分析这个技术，你就会发现它的一些问题：
首先，一个最突出的问题就是它没有办法做多重扩增，两三个靶点可以，再多难度就非常大了。

其次，它在敏感性上，定量能力上,封闭系统等方面不如实时PCR。

还有，说是恒温扩增不需要仪器，可是大多数人做LAMP都用PCR仪器保温。

对那些不需要多重检测的应用，LAMP不失为一种可行的方法。

但是，避免污染造成的假阳性是一个问题。

如何设立反应体系的内外对照，也是问题。

如果LAMP技术出现早10年，出现在九十年代初，而不是00年代初，那它的市场前景一定很好。

毕竟，它是对传统PCR专利的一个挑战。

可是现在，常规PCR的专利已经过期，LAMP技术既要和常规PCR竞争，又要和实时PCR竞争。

仅靠“恒温”来竞争就显得比较单薄了。

价格便宜也是相对的，因为现在常规PCR试剂已经很便宜了，常规PCR仪器也便宜到不能再便宜了。

还有，便宜，对用户是好消息，可是对厂家就是悲歌了。

没有相应的利润率，如何把前期的研发费用赚回来？如何给厂家和投资人换得应有的回报？如何成为一个可持续发展的公司？
对那些在LAMP“平台”上开发产品的公司来说，和当初PCR技术一样，一个主要的问题就是如何建立竞争壁垒？太容易做的东西，你能做，他人也能做，你如何胜出？尤其对那些跟大流后期参与进来的公司和开发者来说就更难：能开发的人家都已经开发完了。

又晚了一步。

核酸扩增技术有许多种（如Rolling circle, branched DNA, NASBA等），许多方法都是研究人员想出来去绕开原始的PCR专利的。

所以我们在选择技术平台以前，一定要问问自己：“这个平台比现有的标准PCR技术到底好在那里？我是否值得在这个技术上投入我的精力？这个技术是否是我的机会？如果我在这个技术平台上做研发，结果是一个论文？还是一个产品？一系列产品？这些产品能赚钱吗？有多大的市场？能支撑一个公司吗？”
选择技术平台有点象寻找有潜力的股票，选好了大有益处，选不好可能满盘全输。

科研人员这一辈子能“赌”几回？所以我们在全身心投入进去以前，最好是多问几个为什么。

环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，是由Notomi T等在2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法，它是一种高灵敏的链置换技术,一种新型的PCR替代技术。

LAMP特点是针对靶基因的6个区域设计了4个特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶——Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒温(65℃)的
条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。

不需要长时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。

LAMP技术因其具有高特异性、高效性和快速反应的优越特点，故从2003年逐步被用于医学的临床检测，目前主要是用于食源性病原微生物的检测和传染性疾病的诊断。

在日本已经将该技术开发成诊断试剂成功推向市场。

广州华峰生物科技基于LAMP技术已经成功开发出全国首创的LAMP检测试剂盒。

依靠华南理工的强大技术背景，该技术产品达到国际先进水平，是国内最新、最快、最简单方便的基因扩增检测试剂盒，其灵敏度高，特异性强，准确率高，检测时间短，不需昂贵的仪器费用，可为中小型医院或研究机构节约成本。

已开发6个食源微生物检测试剂盒：
大肠杆菌0157、单核增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌
已开发18个病原微生物检测试剂盒原型：
甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、甲型流感病毒H5N1、单纯疱疹病毒I、单纯疱疹病毒II、梅毒螺旋体、结核分枝杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌、阴沟肠球菌、嗜肺军团菌、霍乱弧菌、粪肠球菌、志贺氏菌、表皮葡萄球菌。

其中包括食源性病原微生物以及部分传染性疾病病原微生物检测试剂盒在广东省传染病医院、广东省CDC、河北省CDC、广东省出入境检验检疫局、深圳第二人民医院、广州市动物检疫所等权威单位进行评估,准确率均为100%,获得普遍认可。

其外我们还获得6项国家发明专利申请受理，申请了试剂盒产品标准。

LAMP简单的说就是一种分子诊断技术,与PCR相似,在引物、模板、dNTP及酶等作用下是模板DNA大量扩增,从而达到检测的目的。

但是LAMP方法涉及三对儿引物,针对目的片段的六个位点进行扩增,因此,其特异性要高于普通PCR,又不需要特殊的昂贵设备,实施起来更为方便。

LAMP技术的这些优点,高特异性和高灵敏度恰恰造成了该技术有很重要的技术瓶颈,它需要4条引物对应6个区域,这无疑大大提高了引物设计的难度,特别是变异性很大的微生物和病毒来讲,设计合适的引物显得尤
其难,它的恒温扩增具有很高的扩增效率,理论上讲要高于PCR,就是说灵敏度高于PCR,这同时就增加了污染的几率,长期操作反应后,常常出现假阳性,这是该技术致命的缺陷,不解决这种污染问题,LAMP很难推广,这种技术就是针对较低端的客户群,对仪器的要求低,这样一旦出现污染,工作就不得不停止。

名字都不同，是不同的东西，都是恒温扩增。

LAMP针对靶序列上6个区段，设计四条特异性引物，利用具有链置换活性的聚合酶,在65℃左右对核酸进行扩增。

短时间（0.5～1h）扩增效率可达到10e9个拷贝。

LAMP反应中，产生副产物焦磷酸镁乳白色沉淀，利用浊度仪可定量检测，或结合荧光染料实现或定量或肉眼判读结果。

不需要PCR仪和检测仪器，仅水浴锅即能完成反应。

滚环DNA 扩增(RCA) 是一种等温信号扩增方法,既可进行靶核酸扩增，也可进行信号放大扩增。

RCA有线性与指数两种形式。

线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线状单链。

线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为10e5。

指数RCA原理与线性RCA相同，采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。

指数RCA可用于非环状DNA的扩增，设计一引物，其两端可结合到一段连续的序列上，并形成缺口，在连接酶作用下，引物被连接成环状。

此环状引物可作为RCA的模板，进行指数扩增。

指数扩增倍数能达10e7。

RCA 是一种适合在芯片上进行信号扩增的技术,它既能提供研究分析的敏感性和特异性,又能保持立体分析的多元性。

RCA 亦是一种痕量的分子检测方法,可用于极其微量的生物大分子和生物标志的检测与研究，也可用于突变与SNP的检测。

解链酶扩增技术（HDA）则是解旋酶解开双链DNA，单链DNA结合蛋白与单链结合,使使模板处于单链状态并保护其完整性，引物与模板结合,然后在DNA 聚合酶作用下扩增。

生成的dsDNA作为底物进入下一轮扩增。

恒温扩增温度取决于所用的酶，可以60～65℃，也可以是37℃。