Agilent 针对分析鸡肉中利巴韦林和金刚烷胺的整体解决方案

物利巴韦林和金刚烷胺;
采用PBA和PCX分别可以有效的对鸡肉样品中的利巴韦林和金刚烷胺实现净化处理 ,净化后的样品基质效应小,添加回收率可达到70%以上（无同位素内标校正）; 采用6460QQQ分析结果表明在0.1ppb浓度下,利巴韦林的信噪比(S/N)=89;金刚烷 胺的信噪比(S/N)=63; 在0.1ppb～10ppb浓度范围内,线性关系和稳定性优异,相关系数R>0.999,峰面积 RSD<5%.
平衡
保留
洗脱
苯硼酸萃取三步过程机理
Bond Elut PBA 能分析的化合物
苯硼酸可以保留包含二醇和其他基团的化合物例如： 1、邻-二醇，1,3-二醇， 1,3,5-三醇 对邻二醇的保留，要求化合物中的两个羟基共面或者是顺式结构。分子内部 的氢键键合使得1,3-二醇共面，因此该化合物可被保留。 2、糖类化合物 糖类化合物中的环表现出假回转，可以通过其他环而被保留。理论上将任何2 个或3个羟基隔开后可以充满三羟基化硼的四面体位点均有可能被保留。
准确称取鸡肉样品( 2g± 0. 02) g 于15mL具塞离心管中, 加入已知浓 度的标准品，5 mL 乙腈：1%三氯乙酸溶液（7:3）, 加盖后涡旋2m in, 5000r /m in离心10 m in, 吸取上清液于15mL离心管中； 于残渣中再加入5 mL乙腈：1%三氯乙酸溶液（7:3）, 同法操作, 合 并两次上清液； 涡旋混匀，用氨水调pH 值为(8. 5± 0. 1 ),再5000r /m in离心10 m in ，取一半（5mL）上清液过柱。
效的前处理方法和高灵敏度的检测技术;
安捷伦科技能为客户提供从前处理到仪器分析完整的解决方案
WW Seminar Series 2006 Page 6
样品前处理解决方案
吴翠玲 CSD应用工程师 安捷伦科技（中国）有限公司
利巴韦林化学结构
易溶于水 存在顺式羟基 所以选择Bond Elut PBA作为萃取净化柱
洗脱液涡旋均匀后过膜，直接LC-MS/MS检测
金刚烷胺化学结构
利用金刚烷胺氨基特征官能团选择Bond Elut Plexa PCX作为固相萃取吸附剂 Bond Elut Plexa PCX 为聚合物基质的混合型强阳离子 交换固相萃取产品
鸡肉中的金刚烷胺分析
2g鸡肉样品（精确至0.01g）至15mL离心管中，加入加入已知 浓度的标准品、 5mL甲醇-1%三氯乙酸（50+50，V+V），涡 旋30s，超声30min，5000r/min离心10min，上清液全部转移 至15mL离心管中; 再加入 5mL甲醇-1%三氯乙酸（50+50，V+V）重复提取一次 ，合并全部滤液;
利巴韦林SPE萃取净化过程
Bond Elut PBA 500mg 6mL（P/N 12102105）
活化 1.5mL70:30水：乙腈（含有1%甲酸） 2.8mLpH 8. 5 的乙酸铵缓冲液，
上样
淋洗 10mL含有10%乙腈的pH 8. 5 的乙酸铵缓冲液
洗脱 抽干小柱，用5mL0.1Mol/L的甲酸洗脱，直接测定
Bond Elut PBA萃取机理
苯硼酸首先用碱溶液平衡，使苯硼酸根反应生成RB(OH)3，然后将包含二醇基的化 合物上样，与苯硼酸结合，释放水分子。一旦目标分析物被保留，可以在保留碱性 环境的前提下选择合适溶剂洗脱污染物，最终通过酸化苯硼酸复合物使得目标化合 物被洗脱，释放出带有二醇基的目标化合物，同时使苯硼酸转化为(RB(OH)2。
December 25, 2012
线性范围 (Linear):0.1ppb～10ppb 稳定性(Stability)
利巴韦林
Conc. 0.1ppb Area RSD 2.39
0.5ppb 3.11
1ppb 0.87
2ppb 1.60
5ppb 1.58
10ppb 3.00
December 25, 2012
December 25, 2012
Thank you for your attention!
http://www.chem.agilent.com/zh-CN/ 服务热线：800 820 3278 Ext 4 消耗品 cuiling.wu@agilent.com jian-zhong_li@agilent.com
Bond Elut™ PBA 独特的硅胶基质的SPE 吸附剂，苯硼酸通过可逆 共价键来保留目标分析物 。这种强的共价保留机理可以保证高的特异性 和更干净的萃取效果。硼酸盐基团对包含顺式-二醇官能团的化合物具有 很强的亲和性，例如儿茶酚、核酸、一些蛋白、糖类和聚乙二醇化合物、 氨基醇、α-羟基胺、酮类化合物等。
Agilent 针对分析鸡肉中抗病毒药物 利巴韦林(Ribavirin)和金刚烷胺(Amantadine) 的解决方案
2012.12
事件背景
近日,央视曝光违规喂食金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒药品的“速生鸡”流入 上海百盛旗下餐饮机构一事，引发沪上人士广泛关注!!!
December 25, 2012
结构性质
Mobile Phase:
0.4 mL/min
A = Water(0.1%Formic acid+5mM Ammonium acetate) B = Acetonitrile Time 0.00 2.00 4.00 5.00 8.00 8.50 10.00 %B 0 0 15 15 30 98 98
标准品 添加样品
空白样品
平均回收率(Recovery)为82.8%
December 25, 2012
金刚烷胺标准品,添加样品和空白样品的TIC谱图
标准品 添加样品
空白样品
平均回收率(Recovery)为70.0%
December 25, 2012
总结 Summary
采用Agilent 1290 + 6460 QQQ在正离子模式下可以同时分析测定鸡肉中抗病毒药
December 25, 2012
利巴韦林危害性
December 25, 2012
金刚烷胺 危害性
December 25, 2012
如何检测鉴定鸡肉中的抗病毒药物?
目前缺乏针对利巴韦林和金刚烷胺在动物源食品中的检测技术 方法和国家标准;
针对鸡肉样品中残留的抗病毒药物含量低,基质干扰大,急需有
标准品 空白样品提取液稀释标准品
经过PBA净化和色谱分离后的样品基质效应很小
December 25, 2012
金刚烷胺在净化后的鸡肉样品中的基质效应
空白样品提取液稀释标准品
标准品
经过PCຫໍສະໝຸດ Baidu净化和色谱分离后的样品基质效应很小
December 25, 2012
利巴韦林标准品,添加样品和空白样品的TIC谱图
Column Temp:
Needle Wash: Column:
30 ºC
Flushport (50%acetonitrile+20%isopropyl alcohol+30%water), 6 s Agilent Poroshell120 EC-C18 (3.0x100 mm, 2.7 µm)
Pump Flow:
December 25, 2012
乙酸铵(Ammonium acetate)
Poroshell120 EC-C18 3.0x100 mm, 2.7 µm:色谱柱部件号695975-302
December 25, 2012
LC Condition: Agilent 1290 Infinity
Injection volume: 2 mL Autosampler temp: 4 ºC
Timesegment2: 4min ΔEMV=200V
December 25, 2012
1ppb混标的MRM谱图
利巴韦林
金刚烷胺
December 25, 2012
灵敏度(Sensitivity)
0.1ppb利巴韦林, 2mL 信噪比(S/N,RMSx3)=89
0.1ppb金刚烷胺, 2mL 信噪比(S/N,RMSx3)=63
洗脱液氮气吹扫浓缩至干，重新用30：70乙腈：水涡旋溶解后过膜 后，直接LC-MS/MS检测
Agilent 1290 Infinity+6460QQQ 仪器解决方案
李建中 LCMS应用工程师 安捷伦科技（中国）有限公司
测试试剂和材料
乙腈(Acetonitrile): Merck Lichrosolv® Hypergrade for LC-MS, Index No:608-001-00-3,1L/瓶; 去离子水(Water): Millpore, Milli-Q,18.2MΩ,TOC≤5ppb; 甲酸(Formic acid): DikmaPure HPLC Grade, 50mL/瓶;
Gradient:
Stop time: 10min Post time: 3min
December 25, 2012
MS Condition: Agilent 6460 QQQ
QQQ MS conditions Ion Mode: ESI/JetStream ESI, Positive
ESI conditions Drying Gas Temperature: 300 ºC Drying Gas Flow: 8 L/min Nebulizer Pressure: 40 psi Sheath Gas Temperature: 300 ºC Sheath Gas Flow: 11 L/min Capillary voltage (+): 3000 V Nozzle voltage (+): 0V MRM Condition: Timesegment1: 0min ΔEMV=400V
涡旋均匀后重新离心，取出一般体积滤液（5mL），过Plexa PCX固相萃取小柱……
鸡肉中金刚烷胺固相萃取过程
Bond Elut PCX 60mg 3mL（P/N 12102105）
活化 1.3mL甲醇； 2.3mL水， 上样 控制流速1mL/min以下 淋洗 3mL2%盐酸；3mL甲醇 ，抽干 洗脱 5mL5%氨水-甲醇-异丙醇（5+70+25）
3、芳香-O羟基酸和酰胺，包含α-羟基酸，1,3-二羟基-，三酮-，氨基醇的化合 物等
不只是二醇类的官能团会被保留，其他一些不同的官能管也会被固化的苯硼 酸通过电荷转移或者是共价作用结合而保留，例如有一些包含芳香-O羟基 酸和酰胺，包含α-羟基酸，1,3-二羟基-，三酮-，氨基醇的化合物。
鸡肉中的利巴韦林分析-样品前处理过程
线性范围 (Linear):0.1ppb～10ppb 稳定性(Stability)
金刚烷胺
Conc. 0.1ppb Area RSD 3.64
0.5ppb 2.50
1ppb 4.95
2ppb 0.64
5ppb 2.63
10ppb 2.60
December 25, 2012
利巴韦林在净化后的鸡肉样品中的基质效应