亲和纯化技术
亲和纯化
具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化； 粒径均一的球形粒子。
可供选择的载体
❖ 琼脂糖凝胶
过滤介质均 可作为亲和配基的载体
❖ 蛋白质参与亲和作用的机理
一般认为蛋白质的立体结构中存在结合位点， 呈凹陷或凸起结构。
具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的 各种相互作用，主要包括静电作用、氢键力、 疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。
生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是 亲和作用特异性高的主要原因。
二、影响亲和作用的因素
第四节 亲和吸附平衡 （略）
第五节 亲和色谱过程分析
❖ 亲和色谱操作过程
上样吸附 清洗（洗涤） 洗脱 再生
1、进料吸附（p329)
亲和色谱操作中可能存在的两种吸附：
❖ 亲和吸附：亲和配基与目标分子间的特异性结合 （选择性高） ❖ 非特异性吸附：料液中各种溶质（包括目标产物）
概述
❖ 生物亲和作用（bioaffinity）
定义： 生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子， 选择性地与其中某一分子相结合，生物分子间的这种 特异性相互作用称为生物亲和作用或简称亲和作用。
通过亲和作用发生的结合称特异性结合（specific binding）或亲和结合（affinity binding）。
配基和目标蛋白的可逆性亲和结合可表示为
E＋L E·L
结合常数
Keq
E L EL
结合常数越大，表示 亲和作用越强
其中：E、L和E·L分别表示蛋白、配基和二者形成的复合体。 Keq一般为104~108dm3/mol，太大(接近不可逆结合）洗脱回收困 难，太小则难于有效吸附目标物质。
质粒亲和纯化-概述说明以及解释
质粒亲和纯化-概述说明以及解释1. 引言1.1 概述质粒亲和纯化是一种重要的生物技术方法，用于从混合物中纯化含有特定亲和标签的质粒。
质粒是一种DNA分子，常常被用来在细菌中进行基因工程。
在质粒亲和纯化过程中，利用质粒与亲和基质之间的特定亲和作用，将含有目标质粒的混合物与其他杂质分离出来，最终得到纯净的目标质粒。
质粒亲和纯化具有高效、特异性强和操作简单等特点，已经广泛应用于分子生物学、基因工程等领域。
本文将详细介绍质粒亲和纯化的原理、步骤和应用，希望能为读者提供一些有益的信息和参考。
1.2 文章结构本文主要分为三个部分：引言、正文和结论。
在引言部分，将介绍质粒亲和纯化的概念和背景，说明文章的意义和重要性，以及本文的目的和意图。
在正文部分，将详细讲解质粒亲和纯化的原理、步骤和应用。
其中，质粒亲和纯化原理部分将介绍质粒和亲和纯化的关系，解释其基本原理。
质粒亲和纯化步骤部分将详细描述进行质粒亲和纯化的具体步骤和操作流程。
质粒亲和纯化应用部分将列举一些质粒亲和纯化在生物技术和研究领域的应用例子。
在结论部分，将对本文的内容进行总结，展望质粒亲和纯化的未来发展方向和可能的应用领域，最后以一些结束语来结束全文，强调质粒亲和纯化在科研和生产中的重要性和价值。
1.3 目的:质粒亲和纯化作为一种常用的蛋白表达和纯化技术，在生物医药领域具有广泛的应用。
本文旨在介绍质粒亲和纯化的原理、步骤以及应用，帮助读者了解该技术的基本概念和操作流程，以及在生物研究和生产中的重要作用。
通过深入了解质粒亲和纯化的相关知识，读者可以更加全面地掌握这项技术，为自己的研究工作提供有力的支持和指导。
希望本文能够帮助读者加深对质粒亲和纯化技术的理解，促进科研工作的进展和创新。
2. 正文2.1 质粒亲和纯化原理质粒亲和纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，其原理基于蛋白质或肽链与金属离子或其他亲和配体之间的特异性结合。
在这种技术中，常用的亲和配体包括金属离子如Ni2+、Cu2+等，亲和配体与负载在固定相上的树脂特异性结合，从而可以有效地将目标蛋白质分离纯化出来。
串联亲和纯化法
串联亲和纯化法
亲和纯化是一种利用毒物与固定结合基的吸附作用，将溶液中的污染物从水中萃取出来，以达到较高的处理效果的技术。
1、原理：亲和纯化技术主要利用水溶液中污染物与某些复杂化学物质结合，
以实现将污染物从水中分离。
该技术可以有效解决水中有机污染物（如硫醇、杂芳香族烃、芳香类胺类、有机磷酸盐等）以及重金属离子等的污染问题。
它通常是通过某种固定结合基（如碱性团聚水合物材料）将复杂污染物分离出来，让污染物在当量的复杂溶液中黏结聚集，从而实现对溶液中污染物的萃取。
2、过程：亲和纯化主要包括以下步骤：
（1）向反应系统中加入一定的固定结合基；
（2）将反应系统中的污染物吸附到此固定结合基上；
（3）从反应系统中移除污染物，以达到污染物消减的目的；
（4）回收得到的固体固定结合基；
（5）处理后的溶液再次进行清洗，以消减可能存在的有机物。
3、应用：亲和纯化技术在工业废水处理上是不可替代的，广泛应用于食品、
制药、化工、石油等工业生产过程中的各种废水处理，也有针对各种单一的污染物的处理，如废水中有机污染物、重金属离子等。
它不仅可以帮助企业在改善水质事业中发挥着重要作用，也能帮助工厂在节能、降耗、减排上发挥重要作用。
4、优势：
（1）效率高：比其他水处理技术效率还要高，可以有效处理各种水中的污染物，
主要用于去除废水中的有机物和重金属。
综上所述，亲和纯化技术是一项有效、安全、可靠的水处理技术，用于清除、净化企业的废水，可以有效解决水中有机污染物、重金属离子等的污染问题。
因此，亲和纯化技术在工业废水处理和污染的控制中起着不可替代的作用。
第八章亲和纯化
加入脲或盐酸胍可减弱亲和作用。 • 但是，脲和盐酸胍是蛋白质的强烈变性剂，
高浓度下容易引起蛋白质的失活或变性。
18
• 2.4 温度 • 由于温度升高使分子和原子的热运动加
剧，结合部位的静电作用弱。但温度上 升可使疏水性相互作用增强.
19
6
• 蛋白质分子表面的凹陷或凸起部位与 整个蛋白质分子相比要小得多，由于 不是整个分子或物质参与亲和结合， 亲和作用的分子(物质)对可以是：大 分子—小分子，大分子—大分子，大 分子—细胞，细胞—细胞。
7
• 具有亲和作用的分子(物质)对之间具 有“钥匙”和“锁孔”的关系。
• 除此之外，还需要分子或原子水平的 各种相互作用才能完整地体现亲和结 合作用。这些相互作用包括以下几个 方面。
• 这种利用金属离子为配基的亲和层析一般称为 金属螯合层析(Metal chelate chromatography) 或固定化金属离子亲和层析(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)。
36
• 2.1.8 组氨酸
• 具有弱疏水性、咪唑环为弱电性,可与蛋白 质发生亲和结合作用。
• 在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质组氨 酸 白质等电点的溶液中，固定化组氨酸 的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大， 亲和吸附作用降低。
• 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差 较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度 的梯度洗脱法。
37
• 2.1.9 肝素 • 肝素(heparin)是存在于哺乳动物的肝、肺、
2.1离子强度
• 如果亲和结合作用主要源于静电引力，则 提高离子强度无疑会减弱或完全破坏亲和 作用。
亲和力分离纯化技术的研究现状与发展
亲和力分离纯化技术的研究现状与发展亲和力分离纯化技术被广泛用于生物大分子的纯化，例如酶、抗体、蛋白质和核酸等。
该技术采用静电作用、亲和力和其他特殊性质分离靶分子，从而使杂质分子与靶分子分离。
本文将探讨该技术的研究现状和发展。
一、常见的亲和力分离纯化技术亲和力分离纯化技术的类别很多。
目前最常用的技术包括以下几种：亲和层析（Affinity Chromatography）、金属螯合层析（Metal Chelate Chromatography）、离子交换层析（Ion-Exchange Chromatography）、亲水相亲和层析（Hydrophobic Interaction Chromatography）和逆相高效液相色谱层析（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography）。
亲和层析是一种基于化学亲和力的纯化方法。
特定的分子（例如抗体和金属螯合酰胺等）和受体之间的化学亲和力使这些分子紧密结合。
该方法可对天然蛋白质、生物大分子和有机分子进行有效的分离。
然而，该技术具有ET-buffer的pH和离子强度等缺陷。
金属螯合层析是一种吸附介质上阴离子络合物毛细管电泳（CEX-HPLC）的变体。
该技术利用螯合吸附剂上金属离子的络合性质，吸附含有亲和基团的靶分子。
然而，该方法不适用于低亲和力分子的纯化。
离子交换层析是一种基于荷电性质的纯化技术。
在这种过程中，杂质分子通过与固定相上的离子交换基团产生相互作用而被分离，而靶分子通过不互相作用的交换基团而流过。
该方法广泛应用于从树脂中去除不需要的离子，并从大量分析样品中纯化DNA碎片、蛋白质和其他生物大分子等。
亲水相亲和层析是一种生物分子纯化技术，可在低离子强度的缓冲液中使用。
该方法通常用于具有高表面亲和性的表面上部分唾液蛋白和醣蛋白质的纯化。
逆相高效液相色谱层析是一种常见的离子交换技术，用于纯化蛋白质、多肽和核酸。
亲和层析纯化
亲和层析纯化亲和层析纯化是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，它基于目标分子与特定配体之间的亲和作用，通过选择性地捕获、洗脱和回收目标分子。
本文将从亲和层析纯化的原理、步骤和应用方面进行阐述。
一、亲和层析纯化的原理亲和层析纯化是基于生物大分子之间特异的相互作用原理进行的。
在该方法中，目标分子与具有亲和性的配体发生结合，形成稳定的复合物。
这种特异的结合使得目标分子能够在混合溶液中被选择性地捕获和富集。
亲和作用可以是多种形式，如氢键、离子键、疏水作用等。
根据目标分子和配体之间的亲和性，可以选择不同类型的亲和层析介质，例如亲和树脂、亲和膜等。
亲和层析纯化通常包括以下几个步骤：样品预处理、柱填充与平衡、样品加载、洗脱和目标分子回收。
1. 样品预处理：首先需要将样品进行预处理，如细胞破碎、蛋白质去除等，以获得目标分子的纯化样品。
2. 柱填充与平衡：将选择的亲和层析介质填充到柱子中，并通过流动缓冲液进行平衡，使介质充分湿润。
3. 样品加载：将样品加入到柱子中，目标分子与配体发生亲和结合，被捕获在柱子内。
4. 洗脱：通过改变流动缓冲液的组成、pH值或离子强度等条件，使非特异性结合的杂质分子被洗脱，而目标分子仍保持与配体的结合。
5. 目标分子回收：通过改变条件，使目标分子与配体的结合解除，从而使目标分子得以回收。
这可以通过改变pH、离子强度、温度等来实现。
三、亲和层析纯化的应用亲和层析纯化在生物技术、生物医药等领域得到了广泛应用。
1. 蛋白质纯化：亲和层析纯化可用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白质。
例如，通过选择性地捕获具有特定亲和性的标签蛋白质，如His标签、GST标签等，实现目标蛋白质的高效纯化。
2. 抗体纯化：亲和层析纯化也被广泛用于抗体的纯化。
通过使用抗体与特定抗原之间的亲和作用，可以高效地纯化特定抗体。
3. 生物药物纯化：亲和层析纯化在生物药物制造中起着重要的作用。
通过选择性地捕获和富集目标生物药物，可以实现高纯度和高产量的生物药物生产。
串联亲和纯化技术
串联亲和纯化技术亲和纯化技术是一种常用的蛋白质分离和纯化方法，在生物科学研究、药物研发等领域广泛应用。
它使用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用，通过一系列步骤实现目标蛋白质的高效纯化。
本文将从亲和纯化的原理、步骤以及应用方面来进行详细介绍。
亲和纯化技术的原理基于分子间的特异性识别和结合。
首先，我们需要选择一个适当的配体，该配体具有与目标蛋白质结合的能力。
配体可以是抗体、亲和色谱介质等。
当样品中含有目标蛋白质时，配体与目标蛋白质结合形成复合物。
随后，我们可以通过控制条件（如pH、离子浓度等）来解离复合物，从而获得纯化的目标蛋白质。
亲和纯化技术的步骤主要包括细胞裂解、配体固定、样品加载、洗脱和再生步骤。
首先，我们需要将细胞裂解得到包含目标蛋白质的混合物。
其次，将配体固定在纯化介质上，形成亲和色谱柱或亲和杂质。
然后，将混合物加载到亲和色谱柱上，目标蛋白质与配体发生结合。
在洗脱步骤中，通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH或离子浓度，从而调控目标蛋白质与配体的结合，使其从亲和柱中洗脱出来。
最后，进行再生步骤，即通过再生缓冲液将配体重新恢复到初始状态，以便于下一次亲和分离的进行。
亲和纯化技术在生物科学研究和药物研发中具有重要的应用价值。
首先，在蛋白质研究领域，亲和纯化可以用于纯化目标蛋白质，获得足够纯度的样品进行结构解析、功能研究和药物筛选。
其次，在疾病诊断和治疗方面，亲和纯化可以用于纯化特定抗原，用于制备相应的诊断试剂盒或制备特异性治疗药物。
此外，亲和纯化还可以用于分离和纯化膜蛋白、酶等难以纯化的蛋白质。
在进行亲和纯化实验时，我们需要注意以下几点。
首先，选择合适的配体是关键，配体必须能够与目标蛋白质特异性结合，而不与其他非目标蛋白质结合。
其次，进行样品加载时，应注意控制加载量和速度，避免样品过量或过快，以免影响纯化效果。
此外，洗脱步骤中要根据实验需求选择适当的洗脱缓冲液，以充分洗脱目标蛋白质。
最后，在实验结束后，应及时进行亲和纯化柱的再生，以确保下次实验的有效性。
抗原亲和纯化
抗原亲和纯化抗原亲和纯化是一项分离和纯化特定蛋白质的方法，该方法利用特定抗体与其相应的抗原结合，并将蛋白质从复杂的混合物中分离出来。
在分子生物学和生物化学领域中，抗原亲和纯化是常用的技术之一，可用于纯化单一蛋白、获得活性蛋白、制备抗体等。
本文将详细介绍抗原亲和纯化的基本原理、技术流程、优缺点及其应用。
一、基本原理抗原亲和纯化的基本原理是利用特定抗体与其相应的抗原结合。
抗原可以是任何分子，包括蛋白质、多肽、小分子化合物等。
抗体是一类高度特异性的蛋白质，它可以识别并结合与其特异抗原相结合的部位。
一般来说，为了进行抗原亲和纯化，需要在动物体内注射抗原，使其产生特异的抗体。
分离和纯化抗体后，将其与待分离蛋白质混合，待其结合后再使用某些方法将其分离出来，得到纯化的蛋白质。
二、技术流程1. 抗原注射：在动物体内注射待纯化蛋白质的抗原，使其产生特异的抗体。
2. 收集血清：收集动物体内产生的血清，含有特异的抗体。
3. 分离抗体：使用某种技术，如离心沉淀、蛋白A或蛋白G纯化、亲和层析等，将抗体从复杂的混合物中纯化出来。
4. 准备抗原柱：使用某种固相材料如琼脂、硅胶、聚丙烯等，在其表面共价结合相应的抗原，制作成抗原柱。
5. 抗原柱层析：将待分离蛋白质加入到抗原柱中，使其与抗原结合，其他蛋白质被洗掉，得到纯化的蛋白质。
三、优缺点抗原亲和纯化具有许多优点，例如高效、高纯度、高特异性、全程在几个小时内完成等。
此外，该方法对样品来源不敏感，适用于多种来源的样品，包括细胞培养物、组织等。
在制备抗体时，其特异性和亲和力都比其他方法制备的抗体要高。
不过，抗原亲和纯化也存在一些缺点。
首先，制备特异抗体的过程耗时且费用较高。
其次，该方法不适用于无法制备到高质量抗体的蛋白质，如一些小分子等。
此外，抗体的亲和力和特异性有时会受到批次之间的变异，需要对纯化效果进行不断优化。
四、应用抗原亲和纯化具有广泛的应用。
在分子生物学中，该方法广泛用于制备纯化的蛋白质，例如酶、激素等。
亲和纯化质谱技术优缺点
亲和纯化质谱技术优缺点亲和纯化质谱技术是一种用于蛋白质纯化和鉴定的方法，结合了亲和层析和质谱技术。
下面是亲和纯化质谱技术的一些优点和缺点：优点：1.高选择性：亲和纯化通过利用特定亲和剂与目标蛋白质之间的特异亲和作用，可以实现高度选择性的纯化。
这可以排除其他非目标蛋白质的干扰，从而提高纯化的纯度。
2.高灵敏度：质谱技术在鉴定蛋白质方面非常灵敏，可以检测到低浓度的目标蛋白质，即使在复杂的蛋白质混合物中也能鉴定和鉴定小量的蛋白质。
3.可靠性和重复性：亲和纯化质谱技术经过精确的实验设计和优化，使用成熟的设备和方法，能够提供可靠和重复的结果。
4.高通量和高效性：亲和纯化质谱技术与高通量平台（如液相色谱和质谱仪）结合使用，可以实现高效的蛋白质纯化和鉴定。
这有助于加快实验进程并提高工作效率。
缺点：1.亲和剂选择：亲和纯化涉及选择适当的亲和剂来与目标蛋白质结合。
亲和剂的选择可能对特定蛋白质具有局限性，需要具有高度特异性和亲和力的亲和剂，这可能对某些蛋白质不适用。
2.惰性和特异性：对特定蛋白质的亲和剂有时无法展现较高的亲和性，或者在样品中存在其他类似的蛋白质结合，导致某些非特异性蛋白质被错误鉴定。
3.蛋白质结构改变：亲和纯化过程中的固定和洗脱步骤可能导致蛋白质结构的改变。
这可能会影响到蛋白质的功能和结构，从而引起对其生物学活性和特性的不良影响。
4.成本：亲和纯化质谱技术需要使用一系列的仪器设备和特定的耗材，包括质谱仪、亲和层析柱和试剂盒等。
这些设备和试剂的购买和维护成本相对较高。
总的来说，亲和纯化质谱技术是一种强大的工具，可以用于蛋白质的纯化和鉴定。
然而，需要根据具体实验的需求和目标蛋白质的特性来权衡其优点和缺点，并选择适当的实验方法和技术。
11第九章--亲和纯化技术
1
亲和纯化技术概念
利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物 物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（Affinity purification）
2
3
本章内容的重点
1、 掌握亲和层析的基本原理，亲和吸附剂的制备 要点包括载体和配基的选择及其它措施。 2、 熟悉亲和层析的基本操作，洗脱条件的控制及 提高分辨率的方法。 3、 了解亲和层析的用途。 4、 掌握亲和过滤、亲和萃取、亲和沉淀、亲和电 泳的有关概念。
用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
48
碳二亚胺缩合法
碳二亚胺为羧 基活化剂。
反应中的脲衍 生物可用有机 溶剂洗涤除去。
49
（三）用于固定化配基的凝胶衍生物
1、CNBr活化的Sepharose 4B
Sepharose 4B经CNBr活化，可偶联蛋白和核 酸类配基。
62
非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。
离子效应 疏水基团 复合亲和力
63
离子效应
配基与载体-间隔臂的不完全 结合，将无关离子基团引入 吸附剂。
具有离子基团的亲和吸附剂 会影响蛋白质的洗脱行为。
64
疏水基团
吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水 区相互吸引，形成非专一性吸附。
疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂”： （2）疏水性配基：
19
（二）常用载体
纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体——壳聚糖 (Chitosan)
20
1、纤维素
纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的 渗入。
亲和纯化原理
亲和纯化原理
亲和纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，其原理是利用蛋白质与其特异性亲和基质之间的非共价相互作用，将目标蛋白质从混合物中选择性地吸附出来，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从亲和基质上解离出来，从而实现目标蛋白质的纯化。
亲和纯化技术因其简便、高效、选择性强等优点而被广泛应用于生物医药、生物工程等领域。
亲和纯化的原理基础是蛋白质与其亲和基质之间的特异性结合。
亲和基质通常是一种固定在固体载体上的化合物，如亲和层析柱中的亲和配体。
这些亲和基质具有特异的结合能力，能够与目标蛋白质发生特异性的非共价相互作用，如亲和配体与其靶蛋白的配体结合位点相互作用。
利用这种特异性结合，可以实现目标蛋白质的选择性吸附和纯化。
在进行亲和纯化时，首先需要将混合物加载到亲和基质上，目标蛋白质会与亲和基质发生特异性结合，而非目标蛋白质则会被洗脱出来。
然后通过适当的洗脱条件，如改变pH值、离子强度或添加特定的竞争性配体等，可以使目标蛋白质从亲和基质上解离出来，从而实现目标蛋白质的纯化。
亲和纯化技术的优点之一是其选择性强，能够将目标蛋白质从复杂的混合物中高效地纯化出来。
此外，亲和基质通常具有较高的结合亲和力和稳定性，能够在较宽的条件下进行纯化操作，使得该技术在实际应用中具有较高的适用性和稳定性。
总的来说，亲和纯化技术是一种简便、高效、选择性强的蛋白质纯化方法，其原理是利用蛋白质与其亲和基质之间的特异性结合。
通过合理设计亲和基质和洗脱条件，可以实现目标蛋白质的高效纯化。
在生物医药、生物工程等领域，亲和纯化技术将会继续发挥重要作用，为蛋白质研究和应用提供有力支持。
串联亲和纯化技术原理
串联亲和纯化技术原理引言：串联亲和纯化技术是一种用于分离和纯化蛋白质的常用方法。
其原理是利用特定的亲和配体与目标蛋白质发生特异性结合，从而实现目标蛋白质的高效分离和纯化。
本文将详细介绍串联亲和纯化技术的原理及其在生物制药和生物学研究中的应用。
一、串联亲和纯化技术的基本原理1. 亲和配体的选择串联亲和纯化技术的第一步是选择适合的亲和配体。
亲和配体是一种能够与目标蛋白质特异性结合的分子，它通常是一种蛋白质或化学修饰物。
常用的亲和配体有金属离子、抗体、亲和标签等。
2. 亲和柱的制备与校正根据选择的亲和配体，可以制备相应的亲和柱。
亲和柱是一种固定了亲和配体的柱状基质，如琼脂糖、硅胶等。
为了确保亲和纯化的高效性和特异性，亲和柱需要进行校正，以确定适宜的结合和洗脱条件。
3. 样品的处理与加载在进行串联亲和纯化之前，需要对样品进行预处理。
通常包括细胞裂解、蛋白质提取、富集等步骤。
预处理后的样品被加载到亲和柱上，目标蛋白质与亲和配体发生特异性结合。
4. 洗脱与再生洗脱是将目标蛋白质从亲和柱上洗脱下来的过程。
洗脱条件通常是改变pH值、离子浓度、温度等。
洗脱得到的蛋白质溶液即为目标蛋白质的纯化产物。
亲和柱在洗脱后需要再生，以去除非特异性结合的杂质。
二、串联亲和纯化技术在生物制药中的应用1. 蛋白质药物的纯化串联亲和纯化技术广泛应用于蛋白质药物的纯化过程中。
通过选择适当的亲和配体，可以高效地纯化目标蛋白质药物，并去除其他蛋白质、核酸、小分子等杂质。
这种方法具有高效、特异性好、纯化度高等优点，可以满足药物的高纯度要求。
2. 疫苗的制备串联亲和纯化技术也可用于疫苗的制备。
例如，通过将目标抗原蛋白质与亲和配体结合，可以高效地纯化目标抗原，然后将其制备成疫苗。
这种方法可以提高疫苗的纯度和效力，减少潜在的副作用。
三、串联亲和纯化技术在生物学研究中的应用1. 蛋白质相互作用的研究串联亲和纯化技术在研究蛋白质相互作用方面发挥了重要作用。
最新亲和纯化技术
亲和色谱
-目标产物的特异性洗脱
特异性洗脱利用含有与亲和配基 或目标产物具有亲和结合作用的小 分子化合物为洗脱剂，通过与亲和 配基或目标产物的竞争性结合，脱 附目标产物。特异性洗脱条件温和， 有利于保护目标产物的生物活性。 另外，由于仅特异性洗脱目标产物， 对于特异性较低的亲和体系或非特 异性吸附较为严重的物系，特异性 洗脱有利于提高目标产物的纯度。
其他亲和过程
-亲和沉淀定义
亲和沉淀是生物亲和作用与沉淀分离相 结合的蛋白质类生物大分子的分离技术， 包括一次作用亲和沉淀和二次作用亲和 沉淀。
其他亲和过程
-一次作用亲和沉淀原理
水溶性化合物偶联多个配基，蛋白质表面含 有两个以上亲和结合位点
化合物与蛋白质因亲和作用产生亲和交联 交联形成的交联网络因分子量较大而沉淀
亲和配基固定在 膜孔表面，流体在 对流状态下透过膜 的过程中目标蛋 白与配基接触而被 吸附
亲和错流过滤-定义
亲和错流过滤是生物亲和相互作用与 膜分离相结合的蛋白质类生物大分子 的分离纯化技术
亲和错流过滤-原理
传统的膜过滤对蛋白质的分离是基于分子量 大小的差异；分子量相差10倍以上的物质可 得到分离，选择性差；
亲和膜-定义
亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜为 亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是 固定床亲和层析的变型。
亲和膜-亲和膜的提出
固定床亲和层析的缺陷
以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限 放大困难（放大采用径向放大）
亲和膜思路提出
“降低柱高、增大柱径以降低压降、提高流速”
亲和膜-亲和膜的原理
其他亲和过程
-二次作用亲和沉淀原理
利用在物理场改变时溶解度下降，发生可逆 性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基， 制备亲和沉淀介质
亲和纯化原理
亲和纯化原理
亲和纯化是一种常用的蛋白质纯化方法，其原理是利用特定配体与目标蛋白之间的高亲和性相互作用来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
在蛋白质纯化过程中，亲和纯化技术因其操作简便、纯化效果好、选择性强等优点而备受青睐。
本文将介绍亲和纯化的基本原理及其在生物制药领域的应用。
亲和纯化的基本原理是利用配体与目标蛋白之间的特异性相互作用。
通常情况下，配体会被固定在固定相上，例如琼脂糖或者磁珠上，而目标蛋白则通过与配体的特异性结合而被选择性地吸附在固定相上。
随后，通过洗脱等步骤，可以将非特异性结合的蛋白质去除，从而实现目标蛋白的纯化。
亲和纯化的选择性来源于配体与目标蛋白之间的特异性相互作用。
这种相互作用可以是多种多样的，例如亲和素-受体、抗体-抗原、金属离子-亲和标记等。
其中，亲和素-受体相互作用是亲和纯化中最常用的一种，因为亲和素与受体之间的结合强度高、特异性好，可以在不同的条件下实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
在生物制药领域，亲和纯化技术被广泛应用于重组蛋白药物的
生产中。
由于重组蛋白药物通常需要高纯度的蛋白质作为药物原料，因此亲和纯化技术可以有效地实现对重组蛋白的高效纯化。
此外，
亲和纯化技术还可以用于从复杂的生物样品中富集目标蛋白，例如
从细胞培养上清液中富集重组蛋白，从血清中富集特定蛋白等。
总的来说，亲和纯化是一种重要的蛋白质纯化技术，其原理简单、操作方便、选择性强，因此在生物制药领域得到了广泛的应用。
随着生物制药行业的不断发展，亲和纯化技术也将不断完善和改进，为生物制药的发展提供更加可靠的技术支持。
《生物制药工艺学》第9章亲和纯化技术
20
（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。 ，
• 甘氨酸 • 小分子物质作为配基
载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
21
（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质:特殊配基和通用
配基。 • 特殊配基（special ligand）
• 具有离子基团的亲和 吸附剂会影响蛋白质的 洗脱行为。
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疏水基团
• 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中 的疏水区相互吸引，形成非专一性 吸附。
• 疏水基团： • （1）长的烃链结构的“手臂”： • （2）疏水性配基：
52
复合亲和力
• 离子效应作用，又有疏水作用。 • 配体与配基有较强生物特异性。 • 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高
酚、醇类等偶联。 •
31
（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其 它凝胶衍生物活化与偶联
• 叠氮化法 • 重氮化法 ( 含氨基载体) • 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
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聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
• 有大量可修饰的酰胺基。 • 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
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叠氮化法
• 聚 丙 烯 酰 胺 的 酰 肼 衍 生 物 ， 加1mol/L的亚 硝酸，反应液搅90s；
化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）、糖类载体活化与偶联
• 溴化氰活化法 • 高碘酸氧化法 • 环氧化法 • 甲苯磺酰氯法 • 双功能试剂法
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溴化氰活化法
• 载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下 用溴化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳 酸”中间体。
• 在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨 基或芳香族氨基的配基偶联。
生物制药工艺中的纯化与浓缩技术应用
生物制药工艺中的纯化与浓缩技术应用随着人们对生物制药品需求的增加，纯化与浓缩技术在生物制药工艺中扮演着重要的角色。
这些技术的应用能够有效地提高药物的纯度与浓度，确保产品符合质量要求。
本文将探讨在生物制药工艺中纯化与浓缩技术的应用。
一、纯化技术在生物制药工艺中的应用1. 亲和纯化技术亲和纯化技术是一种基于生物分子间的特异性相互作用而实现的纯化方法。
该技术的基本原理是利用目标分子与亲和基质之间特定的结合作用，将目标分子从复杂的混合物中提取出来。
例如，亲和纯化可以用于提取重组蛋白、抗体和酶等生物制药品。
亲和纯化技术能够高效地纯化目标分子，并且可以选择性地去除杂质，提高纯度。
2. 过滤技术过滤技术是生物制药工艺中常用的纯化方法。
这种方法通过使用不同孔径的过滤器将目标分子与杂质分离，以达到纯化的目的。
过滤技术可以分为微滤、超滤和纳滤三种类型。
微滤主要用于去除较大的固体颗粒和生物颗粒，超滤适用于去除分子量较大的杂质，而纳滤则可用于去除分子量较小的溶质。
过滤技术具有操作简便、高效快速等优点。
3. 离子交换技术离子交换技术是一种基于分子之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
该技术通过将目标分子与具有适应性功能团的离子交换基质接触，利用目标分子与离子交换基质之间的静电相互作用进行分离纯化。
离子交换技术在生物制药工艺中常用于去除对生物活性产物有不利影响的杂质，如离子性杂质。
二、浓缩技术在生物制药工艺中的应用1. 蒸发浓缩技术蒸发浓缩技术是一种常用于生物制药工艺中的浓缩方法。
通过加热药物溶液，将溶剂蒸发掉，使溶液浓度增加，以达到浓缩的目的。
蒸发浓缩技术适用于高沸点溶剂体系的浓缩，可以有效地去除大量的水和溶剂。
然而，蒸发浓缩技术可能对热敏感的生物制药品造成损害，因此需要根据具体情况选择合适的操作条件。
2. 膜分离技术膜分离技术是一种通过半透膜将溶质与溶剂分离的浓缩方法。
根据溶质与溶剂的分子大小、电荷和亲疏水性等特性，选用不同类型的膜进行浓缩。
亲和纯化等其他纯化方式
亲和纯化等其他纯化方式亲和纯化是一种常见的蛋白质纯化方式，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
除了亲和纯化外，还有许多其他的蛋白质纯化方式，如离子交换纯化、凝胶过滤纯化、逆流纯化等。
下面是对这些纯化方式的介绍和应用。
一、亲和纯化亲和纯化是利用目标蛋白质与配体之间的亲和作用实现的一种纯化方式。
常见的亲和纯化方法包括亲和层析、亲和吸附和亲和电泳等。
亲和层析是最常用的亲和纯化方法之一，其基本原理是将含有某种特定亲和配体的固定相与蛋白混合，使目标蛋白与亲和配体相结合，然后通过洗脱步骤将目标蛋白从其他杂质中分离出来。
亲和层析常用的亲和配体有金属离子、抗体、亲和标记分子等。
二、离子交换纯化离子交换纯化是利用蛋白质分子的带电特性进行分离的一种纯化方法。
其基本原理是通过蛋白质与离子交换基质之间的静电相互作用来实现分离和纯化。
离子交换基质一般是具有阴阳离子交换功能的柱子，可根据蛋白质带电性质的不同选择合适的离子交换材料。
通过调节溶液pH值和离子强度，可以控制蛋白质与离子交换基质的相互作用，实现对目标蛋白的选择性吸附和洗脱。
三、凝胶过滤纯化凝胶过滤纯化是一种根据蛋白质的分子大小进行分离的方法。
该方法通过使用一系列孔径大小不同的凝胶过滤材料，使较大分子的蛋白质无法通过凝胶网孔，从而实现蛋白质的分离和纯化。
凝胶过滤纯化是一种较为简便快速的纯化方式，适用于分离具有不同分子大小的蛋白质混合物。
四、逆流纯化逆流纯化是一种应用于离子交换和亲和纯化中的技术。
其基本原理是通过动态对流和逆流洗脱的方式，增强目标蛋白质与固定相之间的相互作用，从而实现高效的分离和纯化。
逆流纯化不仅能提高蛋白质的纯化效率，还可以有效去除杂质和保护目标蛋白的生物活性。
在蛋白质纯化领域，亲和纯化、离子交换纯化、凝胶过滤纯化和逆流纯化等方式都有各自的优点和应用范围。
科研工作者和生物制药工程师可以根据实际需求选择合适的纯化方法，以实现对目标蛋白质的高效分离和纯化。
亲和纯化
17
• 2.4 温度 • 由于温度升高使分子和原子的热运动加 剧，结合部位的静电作用弱。但温度上 升可使疏水性相互作用增强.
18
• 2.5 离液离子 • 在SCN-，I-和CIO4-等离子半径较大的离 液阴离子存在下，疏水相互作用降低。 • 因此，如果疏水相互作用对亲和结合的 贡献较大，则添加这些离子会降低亲和 结合作用。
• 1.4 配位键 • 如果亲和作用分子对均与同一金属原子配位， 则两者之间可通过金属配位键间接结合。
• 例如羧肽酶(carboxypeptidase)与其底物的 结合需要通过锌原子产生配位键。过渡金 属离子Cu2+，Zn2+和Ni2+等可与组氨酸的咪 唑基产生配位键，形成金属螯合结构。
12
• 1.5弱共价键 • 弱共价键是指结合力较弱的可逆共价键， • 如氨基与甲酰基之间形成的Schiff碱(Schiff base)，醛基与羟基之间形成的半缩醛基 (hemiacetal)均为可逆共价键，结合力较弱。 当亲和作用分子对之间满足形成弱共价键 的条件时可能形成弱共价键。
2
• 生物分子间的这种特异性相互作用称为生 物亲和作用(bioaffinity)或简称亲和作用 (affinity)，通过亲和作用发生的结合称为特 异性结合(specific binding)或亲和结合 (affinity binding)。
• 利用生物分子间的这种特异性结合作用的 原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲 和纯化技术(Affinity purification)，其代表 为亲和层析法(Affinity chromatography)。
第八章 亲和纯化
概念
利用生物分子间特异性结合的原理进行物质分 离纯化的技术称为亲和纯化技术(Affinity purification)，其代表性的方法为亲和层析法 (Affinity chr与该物 质的分子相结合的能力。这种识别并结 合的能力具有排他性，即生物分子能够 区分结构和性质非常相近的其他分子， 选择性地与其中某一种分子相结合。
串联亲和纯化(tap)技术在蛋白质组学中的应用
串联亲和纯化(tap)技术在蛋白质组学中的应用近年来，蛋白质组学在生物化学、计算生物学和药物发现等领域发展迅速，其中串联亲和纯化(tap)技术作为定量研究蛋白质组学的有效工具更加受到重视和应用。
下面介绍串联亲和纯化(tap)技术在蛋白质组学中的应用：一、什么是Tap技术?Tap技术是串联亲和纯化(tap)技术，是一种用于精细定量测定蛋白质复合物在体外环境下的蛋白质组学分析技术。
它是一种基于亲和纯化和串联技术来测量细胞内蛋白质复合物的新技术。
二、Tap技术的优势1. 灵活：Tap技术可以灵活的检测各种复合物并且可以从微量的活细胞状态中进行采样，可以有效查明复合物结构体和活动关系；2. 灵敏度高、定量准确：利用Tap技术可以定量精且准确测量复合物的抑制作用；3. 去除背景噪声：Tap技术较之传统技术可以更加有效地抑制或消除干扰并有效提取特定信号；4. 高分辨率：Tap技术可以快速直接检测活细胞中复合物，实现对蛋白质复合物的形成和活性的高分辨率检测。
三、Tap技术的应用1. Tap技术在蛋白质组学研究中的应用：Tap技术可以有效地检测细胞复合物结构体和活动关系，获得高分辨率的活细胞复合物表达和调控水平，从而实现快速、准确地研究细胞生物学功能；2. Tap技术用于标记大分子研究：把Tap技术与标记大分子技术结合，可以使研究者根据需要获取完整的复合物组蛋白；3. Tap技术在药物研发过程中的应用：Tap技术作为高通量的筛选方法可用于研发新的活性化合物、抗原和抗体，以及作为药物的分子靶标筛选工具等；4. Tap技术在临床检测中的应用：Tap技术可以作为非侵入性、安全有效的检测方法，用于检测肿瘤标记物（如α-肿瘤抗原）体外诊断，以及病毒、重组蛋白等的诊断等。
总之，串联亲和纯化(tap)技术在蛋白质组学研究中无疑发挥着重要的作用，它的应用涉及到生物化学、计算生物学、药物研发和临床检测等多个领域。
Tap技术的运用，能够更加快捷有效地揭示蛋白的结构、功能以及调控机制，进而为更好地理解细胞中的代谢网络，提供新的思路、技术支持。
亲和层析分离纯化技术
亲和层析分离纯化技术亲和层析分离纯化技术，这可是个厉害的玩意儿呢！咱就这么说吧，它就像是一位超级厉害的伯乐，能从一堆“千里马”中精准地挑出那匹最特别的。
你看啊，在这个复杂的生物世界里，各种物质混合在一起，就好像是一场混乱的派对。
而亲和层析呢，就像是派对上那个最有眼光的人，能一下子找到它要找的目标。
它的原理其实也不难理解。
就好比你有一个特别喜欢的东西，比如一个特定的玩具，然后你就会对这个玩具特别敏感，能一下子在一堆玩具中找到它。
亲和层析就是利用这种类似的原理，通过一个特定的“结合位点”，去和目标物质紧密结合。
比如说，咱要纯化一种蛋白质。
那亲和层析就会用一个专门针对这种蛋白质的“诱饵”，把它给吸引过来，然后牢牢地抓住它，其他的杂质就被排除在外啦。
这多厉害呀！这技术在生物领域的作用那可太大了。
就好像是一个神奇的魔法棒，能让科学家们在研究和应用中如鱼得水。
想想看，如果没有亲和层析，要从那么多复杂的混合物中分离出我们想要的东西，那得费多大的劲啊！简直就像是在大海里捞针。
但有了它，就像是有了一双神奇的眼睛，一下子就能找到那根针。
而且啊，亲和层析还特别精准。
它不会随便乱抓一气，而是只针对它设定好的目标。
这就好比一个神枪手，一枪一个准，绝不会打偏。
它的应用那也是相当广泛呢！在制药行业，能帮助分离出有效的药物成分；在生物技术领域，能助力研究各种生物分子的特性。
这不就是在为我们的科技进步添砖加瓦嘛！再想想，要是没有亲和层析，我们怎么能得到那么纯净的生物制品呢？那我们的医学研究、药物开发不都得受到很大的影响嘛！所以说呀，亲和层析分离纯化技术真的是太重要啦！它就像是一位默默无闻的英雄，在背后为我们的科技发展贡献着自己的力量。
我们真应该好好感谢它，不是吗？你说，这么厉害的技术，我们能不好好研究它、利用它吗？它可真是生物领域的一大宝贝呀！。
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组氨酸 肝素
肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质， 肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量 为5到30kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。 到 ，它与凝血蛋白质、
亲和色谱 亲和配基 亲和色谱-亲和配基 色谱
亲和色谱 亲和色谱
-亲和色谱介质应满足条件 亲和色谱介质应满足条件 亲和色谱
如果亲和作用的分子对的一个分子中含有芳 香环或羟基链等疏水基， 香环或羟基链等疏水基，另一方的结合部位 上也含有疏水区， 上也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性 相互作用
苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 甲硫氨酸和脯氨酸
生物亲和作用
-亲和作用中的相互作用力 亲和作用中的相互作用力
静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键
介质的活化方法－ 介质的活化方法－环氧基法
环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高， 环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性 低的特点，是目前广泛采用的制备方法。 低的特点，是目前广泛采用的制备方法。 活化方法：将介质用水冲洗后， 活化方法：将介质用水冲洗后，加入环氧氯丙烷和 适当浓度的NaOH，然后振荡反应 左右。 适当浓度的 ，然后振荡反应2.5h左右。 左右 为了得到更高的活化效率， 为了得到更高的活化效率，其中环氧氯丙烷和 NaOH的用量，NaOH的浓度，反应时间都可以根 的用量， 的浓度， 的用量 的浓度 据具体实验做出调整。 据具体实验做出调整。 由于环氧氯丙烷为油相， 溶液为水相， 由于环氧氯丙烷为油相，而NaOH溶液为水相，为 溶液为水相 了促进两者反应的进行， 了促进两者反应的进行，通常在混合物中加入助溶 剂二甲基亚砜（ 剂二甲基亚砜（DMSO）。 ）。
其它因素对亲和作用的影响
抑制氢键形成的物质
如果亲和结合作用中存在氢键， 如果亲和结合作用中存在氢键，则加入脲或盐酸胍可减弱亲 和作用。 和作用。
温度
温度升高使分子和原子间热运动加剧，减弱静电作用、 温度升高使分子和原子间热运动加剧，减弱静电作用、氢键 和配位键；增强疏水性相互作用 和配位键；
离液离子 螯合剂
亲和作用主要源于静电引力， 亲和作用主要源于静电引力，提高离子强度 会减弱或完全破坏亲和作用； 会减弱或完全破坏亲和作用； 提高离子强度也会降低或消除氢键作用； 提高离子强度也会降低或消除氢键作用； 当亲和结合作用主要源于疏水性相互作用， 当亲和结合作用主要源于疏水性相互作用， 增大离子强度则可提高亲和结合作用； 增大离子强度则可提高亲和结合作用；
亲和作用中的氢键作用
亲和作用的分子对的一个分子中含有氧原子或氮原 结合部位之间形成O-H-O或O-H-N的氢键作用 子，结合部位之间形成 或 的氢键作用 氧和氧或氮和氧原子需与氢原子基本排列在一条直 线上，且原子之间的距离达到一定程度 线上， 氢键的产生与否受结合部位之间的位置关系的严格 制约
亲和作用中的疏水性相互作用
群特异性
亲和纯化定义 亲和纯化
将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与 固体粒子或可溶性物质共价偶联， 固体粒子或可溶性物质共价偶联，可特异性 吸附或结合另一种分子， 吸附或结合另一种分子，使另一种分子从混 合物中得到选择性分离纯化的方法称为亲和 纯化。 纯化。 在亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中被 固定的分子称为亲和结合对象的配基。
含有目标产物的料液连续通入色谱柱 含有目标产物的料液连续通入色谱柱，直至目标产 色谱 物在色谱 色谱柱出口穿透 物在色谱柱出口穿透
杂质清洗(contaminant 杂质清洗(contaminant washing)
利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液， 利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液， 清洗色谱柱除去不被吸附的杂质； 色谱柱除去不被吸附的杂质 清洗色谱柱除去不被吸附的杂质；
生物分离工程
亲和纯化技术
总体学习目的和要求
理解生物亲和作用的本质， 理解生物亲和作用的本质，影 响因素和作用体系。 响因素和作用体系。亲和纯化的原 理与操作。 理与操作。了解几种常用亲和纯化 方法。 方法。
目录
生物亲和作用 亲和色谱原理 亲和色谱 色谱介质 亲和色谱介质 亲和吸附平衡 亲和色谱 色谱的应用 亲和色谱的应用 亲和膜色谱 亲和膜色谱 其它亲和分离技术
三嗪类色素
这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用， 的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用， 这类色素与 的结合部位相同 能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、 能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生 结合作用
亲和配基－ 亲和配基－过渡金属等
过渡金属离子
Cu2+等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生 亲和结合作用。 等过渡金属离子与N、 和 等供电原子 亲和结合作用。Cu2+等过渡金属离子与 、O和S等供电原子 产生配位键。 产生配位键。
亲和配基－ 亲和配基－酶、抗体和蛋白
酶的抑制剂
蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。 蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分 布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（ 布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常 数为10 ），也有小分子化合物如氨基苄脒 数为 9 L/mol），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数 ），也有小分子化合物如氨基苄脒（ 为4×104 L/mol）。 × ）
产物洗脱(target 产物洗脱(target product elution)
利用可使目标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物
柱再生（ 柱再生（column regeneration)
利用清洗液清洗再生色谱柱 利用清洗液清洗再生色谱柱 色谱
亲和色谱介质－ 亲和色谱介质－学习要点 色谱介质
理解：间隔臂的作用， 理解：间隔臂的作用，常用亲和配基种类 应用：了解亲和配基的固定方法，应用实 应用：了解亲和配基的固定方法， 例以及亲和吸附介质的要求
生物亲和作用-学习要点 生物亲和作用 学习要点
识记： 识记：生物亲和作用的概念 理解：生物亲和作用的本质， 理解：生物亲和作用的本质，影响 亲和作用的因素 应用： 应用：了解常用的亲和作用体系
亲和作用的由来
Affinity一词源于拉丁语的affinitus，意为结 婚或亲缘关系
生物亲和作用-定义 生物亲和作用 定义
pH值对亲和作用的影响 值对亲和作用的影响
作为两性电解质的蛋白质含有多个解离基团， 作为两性电解质的蛋白质含有多个解离基团， 不同解离基团具有不同的解离常数； 不同解离基团具有不同的解离常数； 如果静电引力对亲和结合作用贡献较大，pH 如果静电引力对亲和结合作用贡献较大， 值会严重影响亲和作用，即适当的pH值下亲 值会严重影响亲和作用，即适当的 值下亲 和结合作用较高，而在其他pH值下亲和结合 和结合作用较高，而在其他 值下亲和结合 作用减弱直至消失； 作用减弱直至消失；
亲和分配平衡
在亲和作用体系中，如果用L表示配基， 在亲和作用体系中，如果用L表示配基，E表示蛋白 质，则配基和蛋白质之间的结合反应可表示为
E + L EL
结合常数 K eq
Kd
[E L] K eq = [E][L]
[E ][L] = [E L]
结合常数越大（或解离常数越小），表示亲和结合作用越强。 一般亲和体系的结合常数为104～108L/mol，最高可达到1015 L/mol，此时的亲和ห้องสมุดไป่ตู้合基本上不可逆的。
具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附； 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度 物理和化学稳定性高， 含有可活化的反应基团 粒径均一的球形粒子
亲和色谱 亲和色谱
-亲和配基固定化 亲和配基固定化
亲和配基的固定化方法
介质的活化
介质的活化方法－ 介质的活化方法－溴化氰法
亲和色谱原理-学习要点 亲和色谱原理 学习要点 色谱原理
理解：亲和色谱的原理与操作 理解：亲和色谱的原理与操作 色谱
亲和色谱定义
亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物 亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物 色谱 物质的液相色谱 色谱法 物质的液相色谱法。
亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲 和吸附介质（亲和吸附剂）
如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配位键， 如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配位键，加入 乙二胺四乙酸等螯合剂除去金属离子会使亲和作用消失
常见的亲和作用体系
特异性 高特异性 亲和体系 抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
亲和配基－ 亲和配基－凝集素和色素
凝集素
凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。 凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上 具有糖的结合位点。可作为多糖、 具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的 配基。 配基。
辅酶和磷酸酰苷
各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。 各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。 辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。 辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。
亲和作用中的静电作用
中性pH值下，蛋白质分子上的天冬氨酸、 中性 值下，蛋白质分子上的天冬氨酸、谷氨酸和 值下 半胱氨酸等酸性氨基酸残基带负电荷，精氨酸、 半胱氨酸等酸性氨基酸残基带负电荷，精氨酸、赖氨 酸和组氨酸等碱性氨基酸带正电荷 N末端氨基酸 氨基带正电荷，C末端氨基酸的羧基 末端氨基酸α-氨基带正电荷 末端氨基酸 氨基带正电荷， 末端氨基酸的羧基 带负电荷 近距离上产生强烈的静电引力
溴化氰活化法用于亲和色谱介质连接含有氨基的配 溴化氰活化法用于亲和色谱介质连接含有氨基的配 色谱 基 最初的溴化氰活化法，需要加入NaOH至pH为11， 最初的溴化氰活化法，需要加入 至 为 ， 成功地将配基连接到软性介质上。但是， 成功地将配基连接到软性介质上。但是，溴化氰是 剧毒试剂，并且具有挥发性。 剧毒试剂，并且具有挥发性。 溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解， 溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解，而影响 偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷， 偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷，导致非 特异性吸附增加等。 特异性吸附增加等。