生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究

酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究

一、蔗糖酶的制备

1、提取

称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。再于35℃恒温水浴中搅拌30min，然后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜。之后，1000r/min离心10min，抽取酯层后再次离心，得到无细胞提取液。用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分Ⅰ。（取出3ml于冰箱中保存）

2、热处理

（1）盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。

（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，1000r/min离心10min。

（3）上清液即为热级分Ⅱ。（取出3ml于冰箱中保存）

3、乙醇沉淀

将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此过程共需30 min）。然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。然后4℃，1000r/min离心10min。倾去上清，并滴干。将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分Ⅲ。

二、蔗糖酶的纯化

将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。及洗脱峰图如下：

三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定

（一）还原糖含量测定

1、各级分稀释倍数的确定

级分Ⅰ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）

级分Ⅱ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）

级分Ⅲ：取50μl稀释至15ml（300倍）取20μl稀释至2ml（100倍）

释100倍。

在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E'=Glu含量*稀释倍数/（10 min*0.6 ml）Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数

由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白（第一个峰一般情况下是杂蛋

备注：由测定数据可知，第二个峰不是目标蛋白，第三个峰为目标蛋白。（二）蛋白质含量测定

1、各级分稀释倍数的确定

由以上数据可知，级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释，级分Ⅲ需稀释5倍。

2、蛋白质含量的大批量测定

（见下页）

理论上，随着反应时间的延长，生成的还原糖含量越高，曲线斜率较大，当反应到达某一数值后，随着反应时间的延长，生成还原糖的含量基本不变，曲线基本上与横轴平行。但

该曲线并不符合理论曲线，分析其原因，制备最初酶液时，稀释倍数太大，浓度太小，导致其酶学性质变化不明显。

由上图可知，随着PH值的升高，酶的活力不断增强。当PH值升高到某一数值后，随着PH值的升高，酶活力逐渐下降（事实上，PH值升高到某一数值后，蔗糖酶就会失活）。而且，由图表还可推断出，蔗糖酶的最适PH值为5.0左右。

由上图可知，随着温度的升高，酶活性逐渐增强，当温度升高到某一数值后，酶活性随着温度的升高而降低（事实上，温度上升到某一数值后，酶已失活）。该酶的最适温度在60℃左右。

和最大反应速度V的测定

八、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K

由上图可知，横截距为1.926，由-1/K m=1.926可求得，K m =-0.5193mol/L。理论上，直线的横截距应为负值，纵截距应为正值。该数据明显为错误数据。但计算方法无误。导致错误的原因，很可能是原酶液稀释倍数太高，致使最后的计算结果发生错误。

九、尿素对蔗糖酶的抑制作用

由上图可知，四条直线的纵截距大致相等，由此可推断，脲应为竞争性抑制剂，它和底物竞争与酶的结合。当脲与酶结合后，就妨碍了底物与酶的结合，减少了酶的作用机会，因而降低了酶的活力。