第八章 比色法及分光光度法
比色法和分光光度法的基本知识
比色法和分光光度法的基本学问**节比色法和分光光度法的基本学问一、光的特性光是由光量子构成的，具有二重性，即不连续的微粒和连续的波动性。
波长和频率是光的波动性和特征，可用下式表示：λ＝C/V式中λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。
Ｖ为频率，即每秒钟振动次数。
Ｃ为光速等于299770千米／秒。
光属于电磁波。
自然界中存在各种不同波长的电磁波，列成表1—1所示的波谱图。
分光光度法所使用的光谱范围在200nm—10μ（1μ=1,000nm）之间。
其中200nm－400nm为紫外光区，400nm －760nm为可见光区，760nm－10,000nm为红外光区。
二、光的互补色假如两种色光（单色光或复色光）以适当地比例混合而能产生白色感觉时，则这两种颜色就称为“互为补色”。
非发光物体的颜色（如颜料），重要取决于它对外来光线的汲取和反射，所以该物的颜色与照射光有关。
一般把物体在白昼光照射下所呈现的颜色称为该物体的颜色。
假如将白昼光照射在黄蓝两种颜色混合后的表面时．因黄颜料能反射白光中的红、橙、黄和绿四种色光，而蓝色光能汲取其中的红、橙和黄三种色光，结果使混合颜料显示绿色。
这种颜色的混合与色光的加色混合不同，三、光的选择性汲取物质对光的汲取是物质和光能相互作用的一种形式。
由于光的波粒二象性只有当入射光的能量同吸光物质的基态和激发态能量差相等时才会被汲取，而物质的基态和激发态是由物质的原子结成和原子间相互作用决议的，不同的物质的能态不同，对光的选择性汲取也就不一样。
所以物质对光具有选择汲取性。
要讨论光的选择性汲取，首先必需搞清楚其产生的机理。
原子是由质子和核外电子构成的，核外电子以不同速度在质子四周不同轨道上旋转，每个轨道的能级是不一样的。
好像卫星围绕地球转的情况是相像的。
同时，每个轨道又有方向不同的亚轨道，而同一轨道的不同亚轨上的能量也是不相同的。
当电子的运动轨道更改都会伴有汲取和释放能量。
所以不同的能量变化有不同的汲取光谱。
吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一类
1852年；比尔： 阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关 系.
Ak2c
由比尔将二者结合起来,就得到布格-朗伯-比尔定 律,一般叫做朗伯-比尔定律.
AKbc
2、朗伯-比尔定律 的推导〔数学表达 式〕<略〕
3、灵敏度的表示方法
<1>吸收系数a〔吸光系数a 〕 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c以
§8-4 吸光光度法分析条件的选择
在光度分析中,一般需先选择适当的试剂与试样中的 待测组分反应使之生成有色化合物,然后再进行测定.
因此,分析条件的选择包括反应条件和测量条件的选 择.
一、显色反应及其条件的选择 〔一〕显色反应和显色剂 1、概念：
显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称 为显色反应. M + R = MR
这种方法简便、快速,对于解离度小的络合物,可 以得到满意的结果.
2、等摩尔连续变化法
此 法 的 做 法 是 保 持 CM 和 CR 的 浓度保持不变,即CM + CR = 常数, 连续改变CM和CR的比值,在选定 的仪器条件和波长下测定溶液的 吸光度A.
以A对CM/CR +CM作图.
等摩尔连续变化法测定络合物组成
g·L-1为单位时,K用a表示,称为吸收系数,其单位为 L·g-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表示为
A=abc
<2>摩尔吸光系数ε 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c
以mol·L-1为单位时,K用ε表示,称为摩尔吸收系 数,其单位为L·mol-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表 示为
A= εbc
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
光度法的误差除各种化学因素外,还有因仪器精度 不够,测量不准所带来的误差.
【分析】第八篇吸光光度法
【关键字】分析第八章吸光光度法基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法。
包括比色法、看来及紫外分光光度法等。
本章主要讨论看来光区的吸光光度法。
利用看来光进行分光光度法分析时，通常将被测组分通过化学反应转变成有色化合物，然后进行吸光度的测量。
例如：测量钢样中Mn的含量，在酸性溶液中将Mn 氧化为MnO4-，然后进行吸光度的测量。
与化学分析法比较它具有如下特点：（一）灵敏度高分光光度法常用于测定试样中1－0.001%的微量组分。
对固体试样一般可测至10-4%。
（二）分析微量组分的准确度高例如：含铁量为0.001%的试样，如果用滴定法测定，称量试样，仅含铁0.01mg，无法用滴定分析法测定。
如果用显色剂1，10-邻二氮杂菲与铁生成橙红色的1，10-邻二氮杂菲亚铁配合物就可用吸光光度法来测定。
Fe2+ + 3(1,10-phen) → [ Fe(1,10-phen)3] 2+（三）操作简便，测定快速（四）应用广泛几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可直接或间接地用分光光度法测定。
可用来研究化学反应的机理、溶液中配合物的组成、测定一些酸碱的离解常数等。
§8-1 吸光光度法基本原理一、物质对光的选择吸收当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生了反射、散射、吸收或透射（p241, 图9-1）。
若被照射的是均匀的溶液，则光在溶液中的散射损失可以忽略。
当一束由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色的光复合而成的白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过。
当透射光波长在400-700nm范围时，人眼可觉察到颜色的存在，这部分光被称为看来光。
透射光和吸收光呈互补色，即物质呈现的颜色是与其吸收光呈互补色的透射光的颜色。
例如：CuSO4溶液由于吸收了580-600 nm的黄色光，呈现的是与黄色呈互补色的蓝色。
不同波长的光具有不同的颜色，见P294,表9-1。
物质吸收了光子的能量由基态跃迁到较高能态（激发态），这个过程叫做物质对光的吸收。
第八章分光光度法
8.2 比色法和分光光度法 一、比色法
1.目视比色法
观察方向
c1
c2
c3
c4
cc1 2
c3
c4
方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。
04:56:48
2. 光电比色法
通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)
04:56:48
灵敏度和准 确度较差
光电比色计结构示意图
二、分光光度法
• 特点： • 光源——通过棱镜或光栅得到一束近似的单色
λ1
棱镜
λ2
聚焦透镜 出射狭缝
800 600 500
400
04:56:48
光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度 等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。
原理： 利用光通过光栅时
平面透 射光栅
透 镜
光屏
发生衍射和干涉现象而
分光.
M1
M2
光栅衍射示意图
出 射
狭
缝
04:56:48
检测器
朗伯—比尔定律的前提条件之一是入射光 应为单色光。分光光度计只能获得近乎单色 的狭窄光带。复合光可导致对朗伯—比耳定 律的正或负偏离。
(2) 化学性因素
朗伯—比尔定律的假定：所有的吸光质点 之间不发生相互作用。故：朗伯—比尔定律 只适用于稀溶液(浓度大,易发生偏离)。溶液 中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的 形成等化学平衡时,使吸光质点的浓度发生变 04化:56:4，8 影响吸光度。
末端吸收:出现在短波区,紫外区末端吸收 增强,未成峰形. 生色基团:能产生吸收峰的原子或原子团
助色基团:本身不能产生吸收,对周围的生 色基团发生作用,使生色基团吸收 红移:吸收峰向长波方向移动
分光光度比色法的原理
分光光度比色法的原理
一、物质对光的吸收
分光光度比色法的基础是物质对光的吸收。
当光线穿过物质时，物质会吸收特定波长的光线，导致光的强度减弱。
物质对光的吸收程度与物质的浓度成正比，这是分光光度法进行定量分析的基础。
二、光的色散
光的色散是指光线通过棱镜或光栅等光学元件时，被分解成不同波长的光谱。
通过色散，我们可以将一束白光分解成不同颜色的光谱。
分光光度计利用这个原理，将物质吸收的光线分解成特定波长的光谱，从而确定物质对哪些波长的光线有吸收。
三、比色测定
比色测定是指在特定波长下测量物质对光的吸收程度。
通常，我们将待测物质与已知浓度的标准物质在相同条件下进行比色测定，然后根据标准曲线的斜率和截距计算出待测物质的浓度。
比色测定是分光光度比色法的重要步骤，通过它可以对物质进行定量分析。
四、定量分析
通过比色测定得到的数据，我们可以计算出待测物质的浓度。
在分光光度比色法中，我们通常使用标准曲线法或标准加入法来进行定量分析。
标准曲线法是通过绘制标准物质浓度与吸光度的关系曲线，然后根据待测物质的吸光度在曲线上找到对应的浓度。
标准加入法则是将已知浓度的标准物质加入待测样品中，然后根据吸光度的变化计算待测物质的浓度。
总之，分光光度比色法的原理主要包括物质对光的吸收、光的色散、比色测定和定量分析等方面。
通过这些原理的应用，我们可以快速、准确地测定物质的浓度，广泛应用于化学、生物学、医学等领域。
比色法和分光光度法及其仪器
-
THANKS FOR WATCHING
谢谢观看
汇报人：xxxx 汇报时间：20XX年X月
分光光度法
分光光度法的优点和缺点
分光光度法的优点包括高精度、高灵敏度和高选择性。它能够提供精确的定量数据，适用 于各种不同物质的测量。此外，分光光度法通常具有较高的灵敏度和较低的检测限，能够 检测到微量的物质 然而，分光光度法也有一些缺点。首先，它需要昂贵的仪器设备，通常只有实验室级别的 分析才使用分光光度计。其次，分光光度法需要一定的操作技能和经验，因为不同物质的 测量可能需要不同的条件和参数设置。此外，对于某些特定物质的测量，可能需要使用特 定的试剂和标准品，这可能会增加实验成本和时间
比色法和分光光度 法及其仪器
2
-
目录
CONTENTS
1 比色法 2 分光光度法Biblioteka 比色法和分光光度法及其仪器
比色法和分光光度法是两种常用的化学分析方法，用 于测量溶液中的物质浓度
x
这两种方法都基于朗伯-比尔定律，该定律描述了溶液 的吸光度与溶液浓度之间的关系
PART 1
比色法
比色法
比色法是一种通过比较有色物质 溶液的颜色深度来确定其浓度的
技术
它主要基于颜色的差异，使用肉 眼或比色计来比较样品溶液和标 准溶液的颜色
比色法
比色法仪器
比色法通常使用比色计作为仪器。比色计是一种简单的 光学仪器，它通过比较样品溶液和标准溶液的颜色来测 量浓度。比色计通常由一个光源、一个滤光片和一个接 收器组成。光源发出的光通过滤光片，然后照射到样品 溶液和标准溶液上。接收器接收反射回来的光，并将其 转换为电信号。通过比较样品溶液和标准溶液的反射率 ，可以确定样品的浓度
第8章-分光光度法精选全文完整版
• 特点 :
– 灵敏度高：测定下限可达10-5～10-6mol/L,
10-4 %～10-5 %
– 准确度能够满足微量组分的测定要求：
相对误差2～5％ （精密光度计为1～2％）
– 操作简便快速
– 应用广泛
3
研究物质在 紫外(200-400nm)、可见光区 (400-800nm) 的分子吸收光谱 的分析方法称为
*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。 *显色条件易于控制，重现性好。
36
8.3.2 显色条件的确定
1. 显色剂用量（c(M)、pH一定）
拐点
c(R)
c(R)
Mo(SCN)32+ 浅红 Mo(SCN)5 橙红 Mo(SCN)6- 浅红
c(R)
Fe(SCN)n3-n
37
2. 显色反应酸度（c(M)、 c(R)一定）
8
4. 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律
I I-dI
朗伯定律(1760年)
I0
s
A=lg(I0/It)=k1b
It
b dx
比尔定律(1852年)
A=lg(I0/It)=k2c
A=lg(I0/It)=kbc
吸光度
介质厚
度(cm) 9
吸光度与光程的关系 A = bc
吸光度
0.00
光源
检测器
原理： 利用光通过光栅时
平面透 射光栅
透 镜
光屏
发生衍射和干涉现象而
分光.
M1
M2
光栅衍射示意图
出 射
狭
缝
27
检测器
目视比色法和分光光度法的分析和比较
目视比色法和分光光度法的分析和比较2015年12月5日龙浪李珂璇王宇鑫李嘉浩程卫东王佳佳临床医学院指导教师：徐尧一、摘要本讨论报告通过分析和比较目视比色法和分光光度法两种比色法的主要优缺点，即目视比色法操作简便但精度较低，分光光度法精确度较高但对溶液的性质要求较高；并且结合实例说明两种比色法各自的适用范围和浓度限制，即两种比色方法分别在光的波长、物质的组分、以及对朗伯-比尔定律的符合情况上有不同的适用范围，并给出了适用的吸光度范围（0.2-0.8）和浓度范围。
由此针对不同情况给出了不同的选择方案。
这对实际的研究和生产生活具有指导性的意义。
二、前言在确定有色溶液待测组分含量时，常常可以通过比较和测量溶液的颜色来进行，这种方法叫做比色法。
早在19世纪30-40年代，比色法就开始作为一种定量分析的方法被应用到研究和生产中。
常用的比色法有目视比色法和分光光度法两种，其中前者主要通过眼睛观察得出结论，后者借助光电比色计进行。
由于这两种比色方法的实际应用非常广泛，因此分析和比较两种方法对于方法的优化显得尤为重要。
三、内容（一）两种比色方法优缺点比较1.目视比色法1）优点（1）比色时操作简便，成本较低相比分光光度法，目视比色法不需要动用分光光度计，只需要几个比色管便可以完成测定，因此显得仪器设备简单，操作简便，使用成本低。
同时节省了电能，有利于能源的节约和保护。
在分析大批试样时，其优势就显得更加明显，大大节省了人力、物力、财力以及测定消耗时间。
在本实验中，我们仅需配置5个标准溶液，便可直接在比色管架上进行比较，与分光光度法中所需的多次清洗比色皿的操作要求相比比较简易。
（2）适用范围较广，可用于不严格符合Lambert-Beer定律的情况目视比色法是通过比较通过光的强度来测定组分含量，可以在白光下进行[2]，因此对于有些不严格符合Lambert-Beer定律的显色反应也是适用的。
例如在用碘量比色法测定油脂中过氧化值时，碘和淀粉反应的特征蓝色只有在含碘量在2~10μg[6]时才较为严格地符合Lambert-Beer定律，因此只要反应产生的碘稍稍过量或不足，使用分光光度法测定就会产生较大误差，只能使用目视光度法。
第八章苯乙胺类拟肾上腺素药物的分析
盐酸苯乙双胍中有关双胍的检查 检查方法：纸色谱法（PC）
分离后，甲醇萃取，紫外-可见分 光光度法于232nm波长处测定吸 光度，控制吸光度以控制有关双 胍的量
供试样品制备：本品→流动相溶解（1mg/ml）
对照样品制备：供试品溶液→对照溶液（0.01mg/ml）
系统适用性样品：本品→甲醇溶解→加甲醛溶液→加热→ 吹干溶剂→用水和流动相溶解→HPLC分析（R＞4）
药物
肾上腺素
I2
在中性或酸性条件,红色,放置可变 为棕色多聚体
重酒石酸去甲 肾上腺素
加酒石酸氢钾 饱和液(pH=3.56)
+
I2
Na2S2O3
无色 微红色 淡紫色
盐酸去氧肾上 腺素
盐酸异丙肾上 腺素
加盐酸 +
(pH=3~3.5)
I2
Na2S2O3
红棕色
脂肪族伯胺的专属反应
重酒石酸间羟胺的脂肪伯氨基
对照法定量
偶合剂N-（1-萘基）-乙二胺遇 亚硝酸也能显色，干扰比色测定， 所以在重氮化后，应加氨基磺酸铵 将剩余的亚硝酸分解除去，再加偶 合试剂N-（1-萘基）-乙二胺。
取本品20粒，精密称定，切成小片，精密称取适量（约相 当于盐酸克仑特罗0.36mg），置分液漏斗中，加温热的三氯甲 烷20ml使溶解，用盐酸溶液（9→100）振摇提取3次（20ml、 15ml、10ml），分取酸提取液，置50ml量瓶中，用盐酸溶液 （9→100）稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品 溶液；另取盐酸克仑特罗对照品适量，精密称定，加盐酸溶液 （9→100）溶解并定量稀释制成每1ml中含7.2g的溶液，作为 对照品溶液。精密量取对照品溶液与供试品溶液各15ml，分别 置25ml量瓶中，各加盐酸溶液（9 →100）5ml与0.1%亚硝酸钠 溶液1ml，摇匀，放置3分钟，各加0.5%氨基磺酸铵溶液1ml， 摇匀，时时振摇10分钟，再各加0.1%盐酸萘乙二胺溶液1ml， 摇匀，放置10分钟，用盐酸溶液（9→100）稀释至刻度，摇匀， 照紫外-可见分光光光度法（附录IV A），在500nm的波长处分 别测定吸光度，计算，即得。
比色法和分光光度法
例如, 白光通过CuSO4溶液时, 溶液 颜色为蓝色。
吸收曲线: 为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况, 可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。
光栅:色散元件, 利用光的衍射和干 涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。
c. 吸收池(比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液。 按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。
d. 检测器 作用: 是将光强度信号转换为可 测电信号, 常见检测器有光电池和 光电管。 光电池: 国产581-G型光电比色 计及72型分光光度计。
与目视比色法相比, 光度法的特点: ① 灵敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ② 准确度较高; ③ 仪器设备较简单, 操作简便、 快速； ④ 应用广泛。
(2) 光的性质和物质的颜色 光的性质: 光是一种电磁波, 具 有波粒二象性。光的波动性可用 波长来描述, 其单位常用纳米(nm) 表示, 波长越短, 能量越高。
具有同一波长的光称为单色光,由不 同波长光组成的光称为复合光。
互补色光: 若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光, 那么这两种光称为 互补色光。
物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的。 当一束白光通过溶液时, 若溶液对各 种色光都不吸收, 则白光全部通过, 溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全 被吸收, 则溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某种色光, 则溶液呈透过光的颜色, 也 就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。
(2) 吸光系数 当b以cm, c以g/L为单位, K为吸光 系数, 用符号a表示, 单位为L/g · cm A=abc 当b以cm, c以mol/L为单位时, K为 摩尔吸光系数, 用符号ε表示, 单位 为L/ mol · cm A=εbc a a与ε的关系: M
第八章 吸光光度分析法
要使A测定的相对误差 要使 测定的相对误差∆c/c 最小(∣Er∣= 2.7%)： 测定的相对误差 ∣ ∣ ：
T = 36.8% A = lg1/T = 0.434
2、A测量的误差 、 测量的误差
朗伯-比尔定律： A=lg1/T=εbc 朗伯 比尔定律： 比尔定律 微分： 微分： dA = -dlgT = -0.434dlnT = - 0.434T -1 dT =εb dc
两式相除得： 两式相除得： dA/A= （ 0.434 / TlgT ）dT = dc/c 以有限值表示： 以有限值表示： Er = ∆c/c =∆A/A = 0.434∆T/TlgT
注意：适用于单色光； 注意：适用于单色光； A具有加和性； 具有加和性； 具有加和性 Aபைடு நூலகம்单位。 无单位。 无单位
三、吸光系数
为单位， 为单位， 当b以cm为单位，c以g·L-1为单位，K 称为吸光 以 为单位 以 系数， 表示， 系数，用 α表示，单位为 -1·cm-1。 表示 单位为L·g
A = αbc
方法：配制一系列不同含量的标准溶液 方法： 选用适宜的参比， (c1, c2, c3 … cn)，选用适宜的参比， 在相同的条件下， 在相同的条件下，测定系列标准溶液的吸 光度(A 曲线， 光度(A1, A2, A3 … An)，作A-c曲线，即 标准曲线. 标准曲线. 在相同条件下测定未知试样c 在相同条件下测定未知试样cx的吸光 度Ax，从标准曲线上就可以找到与之对应 的未知试样的浓度。 的未知试样的浓度。
比色分析法
第四节 测量条件的选择
一、入射光波长的选择： A 应为最大吸收峰的波
长，才能保证测定的灵敏
度和准确度。
精选课件
λ1
8
λ2
λ
二、参比溶液的选择：
在测量吸光度时，利用参比溶液来调节仪器的零点及T = 100 ％，可以消除由于比色皿、溶剂及试剂对人射光的反射和吸收带来 的误差。
1.当试液及显色剂均无色时→用蒸馏水； 2.当显色剂无色时，待测试液中存在其他有色离子→用不加 显色剂的试液； 3.如显色剂和试液均有色→试剂空白(不加试样)。
由于不同物质，其结构不同、能级
不同，故吸收的光线也不同。
白光
青蓝
蓝 紫
结论：物质对光有选择性吸收。
4．吸收曲线：以波长(λ)为横坐标，
以溶液对光的吸收程度(Α)为纵坐标→吸
收曲线→λmax(吸收峰)
精选课件
3
二、光吸收的基本定律——朗伯-比尔定律： 1．透光率和吸光度：
当一束平行的单色光通过有色溶液时：
2
（2）单色光：只有一种波长的光。
（3）互补光：适当波长(颜色)的单色光按一定强度比例混合→
白光。 互补光对应的颜色→互补色
绿
黄
青
3．光的选择性吸收: 当一定光源所产生的电磁波通过某 橙
一溶液时，其中一部分频率的辐射能→ 被溶液介质吸收→质点由基态→激发态 (激发态不稳定)→基态→能量(以光线的 红 形式放出)，能量大小不同，释放的光 线的颜色也不同。
三、吸光度范围的选择：
✓ T=0.368、 A=0.434， 测量的相对误差最小
✓ T=15％～65％ A＝0.2～0.8 时测量的相对误差≤2% 控制方法：(1)计算并且控制试样的称出量，含量高→少取样或稀释
8第八章 比色分析法
上式为朗伯-比尔定律的数学表示式。它表示一束 单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度 和液层厚度的乘积成正比。 医学化学
上页 下页 回主目录 返回
式中，K为吸光系数，当溶液浓度c和液层厚度b 的数值均为1时，A=K，即吸光系数在数值上等 于c和b均为1时溶液的吸光度。对于同一物质和 一定波长的入射光而言，它是一个常数。
T 比色法中常把I/I0 称为透光度，用T表示，
def
透光度和吸光度的关系如下：
I I0
A =－lgT
医学化学
上页
下页
回主目录
返回
当c以质量体积浓度（g· ml-1）表示时，吸光系数 称为质量吸光系数，用a表示。当c以mol· L-1为单 位时，吸光系数称为摩尔吸光系数，用ε表示， 其单位是L· mol-1· cm-1。吸光系数越大，表示溶液 对入射光越容易吸收，当c有微小变化时就可使 A有较大的改变，故测定的灵敏度较高。一般ε 值在103以上即可进行比色分析。
医学化学
上页
下页
回主目录
返回
用标准曲线法时，应注意的问题：
（1）标准液的测定和被测液的测定应在相同条件 下进行。 • （2）溶液的浓度应在标准曲线的线性范围内。
•
医学化学
上页
下页
回主目录
返回
在测定溶液吸光度时，为了消除与被测物质吸收 无关的因素的影响，如溶剂或其他物质对入射光 的吸收，光在溶液中的散射以及吸收池界面对光 的反射等，必须采用空白溶液（又称参比溶液） 作对照。常用的空白溶液有三种： （1）溶剂空白 （2）试剂空白 （3）试样空白 P85
则
c = -lg65%/2235×2.0=4.19×10-5(mol· L-1)
第八章分光光度法
1.电磁波谱紫光波长：400~450nm红光650~750nm一、光的基本性质吸光光度法（分光光度法）：根据物质对光的选择性吸收来进行测定的一种方法可见光教材：199页，表8-1光学光谱区（真空紫外）远红外中红外近红外可见近紫外远紫外10nm~200nm200nm ~380nm 380nm ~780nm 780 nm ~2.5 µm 2.5 µm ~50 µm 50 µm ~300 µm2. 光的波粒二象性波动性：λ=νC 粒子性：E波粒二象性：λC E=h ν=h结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低。
单色光：具有相同能量(相同波长)的光。
混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起，例如白光。
h 为普朗克常数：6.63×10-34J.s二、物质对光的选择性吸收1.物质对光的选择性吸收青（蓝绿）红橙黄绿绿蓝蓝紫物质的分子具有一系列不连续的特征能级，通常分子处于能量最低的基态，吸收了一定入射光的能量后产生能级跃迁，进入能量较高的激发态，当入射光的能量与物质分子的某一能级差恰好相等时，才有可能发生能级跃迁（1）（2）基态第一激发态第一激发态λC E=h ν=hλ/nm:650~700λ/nm:400~450λmax 440nm540nmAλnmK 2Cr 2O 7KMnO 4K 2Cr 2O 7和KMnO 4的吸收曲线定量分析基础定性分析基础c增大2．吸收曲线三、吸光光度法的特点1.灵敏度高（0.01克黄金/吨矿石）2.操作简便，测定速度快3.应用广泛，几乎可测所有无机离子，广泛应用于冶金，环境，生物，医学等领域吸收光谱峰的位置（λmax ）定性峰的高矮（吸收程度的大小）定量I a =I 0 -I一、朗伯-比尔定律I oIbSdx I a当一束平行单色光垂直照到某均匀溶液时，假设：液层厚度b ，截面积为s ，溶液浓度为c ，入射光强度为I 0，该溶液吸收光的强度为I a ，透过光的强度为I将b 切割为dx ，薄层中所含吸光质点数为dN ，入射光强度为I b ，穿过薄层后光的强度减弱了dI b-dI b = K 1I b dN dN = 6.02×1023cSdx -dI b = K 16.02×1023S cI b dx 令:K 2= 6.02×1023K 1S ∴-dI b = K 2I b cdx ，cdx K I dI 2b b =−∫∫=−bI I b b cdx K I dI20cb K I I20ln=−Kcb I I=−∴0lg303.22K K =令：液层厚度b ，截面积S ，吸光物质浓度c ，薄层中所含吸光质点数为dNI 0dx bII bI t根据光的量子理论：透光率或透射比T (0~1, 0~100%)定义透光率：I I T =定义吸光度：有意义的取值范围为∞-0KbcI I T A =−=−=0lglg 透过光强度入射光的强度朗伯-比尔定律的数学表达式Kcb I I=−0lgI II I A 00lg lg =−=朗伯-比尔定律朗伯-比耳定律是吸光光度法的理论基础，是用光度法进行定量测定的依据朗伯-比耳定律的物理意义：当一束平行单色光垂直通过某均匀溶液时，溶液的吸光度A 与液层厚度b 及吸光物质的浓度c 成正比：A= Kbc单色平行光均匀溶液注意：A=-lg= KcbI I 0吸光度与光程的关系A = K b c0.10b0.202b0.00光源检测器显示器参比吸光度与浓度的关系A = Kb c0.10c0.202c0.00光源检测器显示器参比二、光度法的灵敏度1．吸光系数a （吸收系数）当液层厚度b 以cm ，吸光物质的浓度c 以g/L 为单位时，朗伯-比尔定律表示为A = abca 称为吸光系数，单位为L/(g ⋅cm)在朗伯-比尔定律A = Kbc 中，系数K 在一定条件下是常数，表明用光度法进行测定的灵敏度KλT吸光物质性质K=cbA 2.摩尔吸光系数εc mol/L b cm εL/(mol.cm)A= bcεε吸光物质的灵敏度吸光物质对光的吸收能力ε=cbA 当液层厚度b 以cm ，吸光物质浓度c 以mol/L 为单位时，朗伯-比尔定律表示为二乙基胺二硫代甲酸钠（铜试剂，DDTC ）双硫腙ε436=12800 L/(mol.cm)CuCuε495=158000 L/(mol.cm)<ελT吸光物质性质λmaxεmaxA= -lgT = -lg0.603 = 0.220c=140×10-6112.4=1.25 ×10-6mol/Lε=bcA =2 ×1.25 ×10-60.220= 8.8×104 L/(mol.cm)例1 （203页，8-1），利用双硫腙光度法测Cd 2+,已知Cd 2+的质量浓度为140µg/L,比色皿厚度为2cm,在520nm 处测得透光率为0.603，求吸光度A 及摩尔吸光系数ε（M cd =112.4g/mol)解：A= εbcε=bc A A= εbc c mol/Lbcmmol/1000cm 3bc/1000mol/cm 2bcM ×1061000S(µg/cm 2)∴S=bcM ×103将代入得bc=εAS=εAM ×103µg/cm 23.桑德尔灵敏度SA=0.001时(检测极限)，单位截面积光程内所能检出吸光物质的最低含量µg/cm 2bc →单位截面积光程所能检出吸光物质的最低含量因为：A=0.001，代入上式：S 灵敏度ε灵敏度S=εM ∴例2（205页，8-2）、已知双硫腙光度法测定Cd 2+时ε520nm =8.8×104L/(mol ·cm)，求桑德尔灵敏度S.A=0.001时，单位截面积光程内所能检出吸光物质的最低含量µg/cm 2解，S=εM cd =8.8×104112.4=1.3 ×10-3µg/cm 2A= εbcS=εAM ×103例3，Fe 2+用邻二氮菲显色，当c=0.76 µg/ml,于波长λ510nm,吸收池厚度b=2.0cm 时,测得T%=50.2,求摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度各为多少？(M Fe =55.85 g/mol)c= 0.76 µg/ml=7.6 ×10-4g/L=1.36 ×10-5mol/L由A=εbc 得:解：A=-lgT=-lg0.502=0.299ε=A bc =0.2992.0×1.36 ×10-5=1.1 ×104L/(cm.mol)S=εM Fe =1.1×10455.85= 5.1 ×10-3µg/cm 2三、利用朗伯-比尔定律进行定量分析A= εbc b 一定, λmax 一定，同一种物质，ε一定配制一系列标准溶液，由标准溶液：c 1, c 2, c 3……测得吸光度：A 1, A 2, A 3…...A 对c 作图工作曲线1.工作曲线法（标准曲线法）c (mg/ml)c 1c 2c 3c 4c 5A.....A xc x 工作曲线（标准曲线）A 1A 2A 3A 4A 5A 标A x=ε标b c 标εx b c x2.比较法：四、对朗伯-比尔定律偏离.工作曲线（标准曲线）A= εbccc 1c 2c 3c 4c 5A..原因：仪器或溶液的实际条件与朗伯-比尔定律所要求的前提条件不一致..A 总=-lg I t1+I t2I o1+I o2=-lgI o110-ε1bc +I o210-ε2bc I o1+I o2（一）、由于非单色光引起的偏移∴I t =I o 10-εbcA= εbc =-lgII o假设：入射光I oλ2I o2I t2A 2λ1I o1I t1A 1A 总=-lg10-εbc （I o1+I o2）I o1+I o2= εbc 造成偏离A 总= εbc若λ1与λ2相差很大，ε1= ε2=ε如果λ1和λ2相差不大，即∆λ= |λ1-λ2|很小，可以近似认为ε1= ε2= εA 总=-lg I t1+I t2I o1+I o2=-lgI o110-ε1bc +I o210-ε2bcI o1+I o2克服由非单色光所造成的偏离¾选择单色器（单色性能较好）¾选择入射光波长（λmax )¾选择适当的浓度范围（不应过高）浓度及非单色光的影响λ1λ2abA 5A 1A 4A 2λ3λ/nmA浓度: b>a波长: λ3>λ2>λ1A 3A 6（二）、由于溶液本身的化学和物理性质所引起的偏离1.由于介质不均匀所引起的偏离bI oI I a 发生散射：T 实I o -I a -I r=I o=II o2.由于溶液的化学反应所引起的偏离分析浓度或总浓度C 总吸光质点浓度C 质C工作曲线A=Kcb I r因为：T 实<T 理∴A 实>A 理T 理I o -I a =I o =I I o 吸光物质因解离、络合、缔合等化学变化而改变浓度如：Cr 2O 72-+H 2O 2CrO 42-+2H +λ=375nmλ=350nm单体：SNH +(CH 3)2NN(CH 3)22SNH +(CH 3)2NN(CH 3)22λmax = 660 nm 二聚体：λmax = 610 nmAcλmax = 660 nmAλ660 nm 610 nm亚甲基蓝阳离子（MB ）方便、较灵敏，准确度差（半定量）一、光度分析的几种方法1.目视比色法观察方向空白c 1c 2c 3c 4c x1).可以任意选择某种波长的单色光2).扩大入射光波长的范围3）灵敏度、准确度高2.光电比色法和吸光光度法：共同点：以朗伯-比尔定律为基础的仪器分析方法主要区别：获得单色光的手段不同光电比色法以滤光片为单色器，谱带宽度约有几十纳米吸光光度法以棱镜或光栅为单色器，谱带宽度约有几纳米光源单色器狭缝样品室检测器二、紫外-可见分光光度计氙灯氢灯钨灯1．光源卤钨灯。
分光光度法与比色法
1、几个概念：分光光度法在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。
如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。
利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。
用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。
它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。
但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。
比色法colorimetry以可见光作光源，比较溶液颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法。
以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。
比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30～40年代。
比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。
选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。
常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A＝εbc)为基础。
常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。
试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。
光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。
与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。
但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能得到一定波长范围的复合光，而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第八章比色法及分光光度法第一节一、填空题。
1.比色法及分光光度法同化学分析法比较具有___________、_____________、_____________、_______________等四个特点。
2.光的波长范围在___________称为可见光，波长小于__________称为紫外光，波长大于___________称为红外光。
3.____________通过三棱镜就可分解为____________________，这种现象称为光的色散。
4.光吸收程度最大外的波长叫做_____________，用_________表示。
5.同物质不同浓度的溶液λmax不变，具有____________的吸收曲线，不同物质具有__________的吸收曲线，可以此进行物质的___________。
6.物质呈现一定的颜色是由于___________。
7.同一物质不同浓度在一定波长处吸光度随浓度增加而________,这个特性可作为_________的依据。
二、选择题。
1.已知光的波长λ=800nm，则它应属于（）A、红光B、紫光C、红外光D、紫外光2.Fe（SCN）3溶液（红色）的吸收光颜色为（）A、红色B、黄色C、蓝色D、蓝绿色3.绿光的互补色为（）A、紫红色B、橙色C、绿蓝D、蓝绿色4.二苯硫腙的CCl4溶液吸收580~600nm范围的光，它显（）色。
A、绿色B、蓝色C、紫色D、黄色三、判断题。
1.白光是一种可见光。
（）2.同一物质不同浓度的有色溶液λmax不变。
（）3.在λmax处测定吸光度则灵敏度最高。
（）4.比色法及分光光度法同化学分析比较，准确度高，灵敏度低。
（）5.硫酸铜溶液因吸收了白光中的红色而呈现蓝色。
（）第二节光吸收定律一、填空题。
1.光吸收定律又称_______，它表明当_______________垂直通过______________，溶液的吸光度A与______________及____________成______。
其数学表达式为_______________。
2.偏离朗伯—比耳定律的因素有________、_________、_________、_______等四方面。
二、选择题。
1.某有色溶液，其他测定条件相同，若增加液层厚度，则其吸光度A( )A、增加B、不变C、减小D、不确定2.某有色溶液，其他测定条件相同，若增加液层厚度，则其透射比T（）A、增加B、不变C、减小D、不确定3.若某有色溶液透射比为0.333，则其吸光度为（）A、0.333B、0.500C、0.666D、0.4784.若某溶液ε=1.1×104L\（mol·cm），с=3.00×10－5mol/L,b=2.0cm，则A为（）A、0.10B、0.32C、1.30D、0.66三、判断题。
1.光吸收定律仅适用于可见光。
（ ）2.朗伯—比耳定律不仅适用于均匀、非散射的液体，同时也适用于固体及气体。
（ ）3.在λmax 下的εmax 值是有色物质的重要特征常数。
（ ）4.摩尔吸光系数ε在实验中可以直接测量其数据。
（ ）5.光吸收定律适用于乳浊液、胶体等均匀溶液。
（ ）6.当入射光波长不同时，K 值总是常数。
( )四、计算题。
1.用邻菲罗啉分光光度法测定铁，λ=508nm ，比色皿的厚度为2.0cm ，试液浓度为600µg/L，测得吸光度为0.236，计算此波长下的摩尔吸光系数ε及透射比T 。
2.将0.088mg 铁以硫氰酸盐显色后，转移至50mL 容量瓶中，用不稀释至刻度。
λ=480nm ，比色皿厚度为1cm ，测得吸光度为0.74，求摩尔吸光系数ε及透射比T 各为多少？3.用1.0cm 的比色皿，在λ=525nm 处，测得KMnO 4溶液吸光度为0.301，问该溶液航向比T 1是多少？如比色皿不换，将其浓度增大一倍，溶液的透射比T 2又是多少？4.有一浓度为 3.4×10－5mol/L 的有色溶液，在525nm 处的摩尔吸光系数为3200L/(mol ·cm )，当比色皿的厚度为1.0cm ，计算此波长下的吸光度A 及透射比T 。
第三节 显色反应一、填空题。
1.将_______转变或________的反应称为显色反应。
2.与_________形成_______的试剂称为显色剂，显色剂可分为_______、_______两大类，_________在比色及光度分析中应用不多，而__________却被广泛应用。
3.选择显色反应的一般标准是_______、________、______________________、_______________、_____________。
4.影响显色反应的因素有________、_________、___________、___________及_________。
二、选择题。
1.有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，一般要求λmax MR 与λmaxR 之差在（ ）nm 以上。
A 、100B 、160C 、60D 、2002.有色化合物具有较高的摩尔吸光系数时，显色反应（ ）A 、不能进行B 、灵敏度高C 、选择性好D 、准确度高3.在实际工作中，显色剂的用量（ ），保证显色反应完全。
A 、要在B 、恰好与被测组分反应完全C 、要小D 、通过实验来确定4.在实际工作中，显色时间（ ），保持测定过程中吸光度基本不变。
A 、越长越好B 、越短越好C 、一般要求30minD 、通过实验来确定三、判断题。
1.M ＋R=MR 显色反应表示在分析工作中显色剂浓度越大，越有利于生成有色化合物。
（）2.有色化合物与显色剂之间颜色越相近越有利于测定溶液的吸光度。
（）3.摩尔吸光系数ε越小，灵敏度越低。
（）4.显色剂必须只与被测离子发生显色反应，否则无法准确测定有色化合物的吸光度。
（）5.显色时间越，生成有色化合物越稳定。
（）6.升高温度有利于显色反应的完成，故在实验过程中要注意随时加热。
（ ）第四节 比色法和分光光度法及其仪器一、填空题。
1._______比较_______与________颜色深浅来确定物质含量的分析方法称为目视比色法。
2.将_______的标准溶液________各比色管中，分别加入等量___________，然后稀释至_____，摇匀，即形成______的标准色阶。
3.目视比色法的优点是_______、________、_________、_______、_______。
缺点是_______。
4.分光光度计的主要部件有___________、__________、__________、__________、____________。
5.将光源发出的________色散分解为__________装置，称为________。
它是由________等色散元件及________组成。
6.分光光度计中常用的检测器是___________，它是一种两极管，在________或_______内装有两个电极，阳极通常是__________，而阴极是____________。
7.721型分光光度计光源为__________，其工作波长范围为_________nm，751型分光光度计光源为_____________，其工作波长范围为_________nm。
二、选择题。
1.在比色法及光度分析中，绘制吸光度对溶液浓度的曲线应为（）A、直线B、抛物线C、双曲线D、圆弧2.751型分光光度计的色散元件为（）A、玻璃棱镜B、岩盐C、石英棱镜D、狭缝3.721分光光度计是在( )区域内使用的仪器A、可见光B、紫外光C、近红外光D、以上均可三、判断题。
1.吸光度与溶液浓度、透射比成正比。
（）2.标准曲线法适合于成批试样的分析。
（）3.721型分光光度计的色散元件为石英棱镜。
（）4.751型分光光度计是在波长200~1000nm区域内使用的仪器。
（）5.721型分光光度计在使用前必须让仪器预热20min。
（）四、计算题。
1.称取0.7790gCuSO4·5H2O溶于水中，移入1000mL容量瓶中，稀释至刻度。
用吸量管取此标准溶液0、1.00、2.00、3.00、…、9.00mL于10支目视比色管中，加水稀释至25mL，制成标准色阶。
称取含铜试样0.5080g，溶解后转移至250mL的容量瓶中，稀释至刻度。
用吸量管取出5.00mL转移至比色管中，加水稀释至25mL，其颜色深度介于第八和第九个标准色阶之间，求试样中铜的质量分数w（Cu）。
2.钢试样1.00g溶解于酸中，用KIO3将Mn2＋氧化成MnO4－，稀释至250mL，测得吸光度等于1.00×10－3mol/L的KMnO4溶液吸光度的1.5倍，计算钢样中Mn的质量分数w（Mn）。
3.有Ⅰ、Ⅱ两种不同浓度的某有色溶液，若液层厚度相同时，对于某一波长的光，Ⅰ有色溶液为6.51×10－4mol/L，测得透射比为0.65，计算透射比为0.42的Ⅱ有色溶液浓度c。
4.测定硅酸盐中的铁含量，心铁的质量分数w（Fe）=0.5%的已知试样做标准，经过同样方法处理后于分光光度计上，测得用2.00cm比色皿时，标准试样的吸光度与用1.0cm比色皿时被测试样吸光度值相等，求试样中铁的质量分数w（Fe）。
5.用哇钼蓝比色法测定钢样中硅的含量。
（1）试用下列数据绘制标准曲线。
ρ(SiO2)/(mg/mL)0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 吸光度A0.210 0.421 0.639 0.839 1.10（2）称样重0.500g ，溶解后转入50mL 容量瓶中，在与工作曲线相同条件下显色，是吸光度为0.522，求试样中硅的质量分数w (Si)。
综合练习题一、填空题。
1.最大吸收波长是指_______的波长，用符号______表示。
在______处测定的吸光度，其灵敏度最高，随着溶液浓度增加，吸光度也相应______，这个特性可作为__________的依据。
2.Fe(SCN)3溶液因吸收了白光中的_________而呈现_________。
3.选择显色反应一般标准是_______、__________、___________________、__________________、__________________。
4.朗伯—比耳定律又称___________，它的数学表达式为______________，这是比色法及分光光度法的_______________。
5.分光光度计的主要部件有___________，_____________,_______________,______________,________________,检测系统是利用______________________将_____________________转换成___________进行测量的装置，常用的检测器是____________等。