免疫组织化学解析
(整理)免疫组化知识
免疫组织化免疫组织化学免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。
它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
1．发展简史——1941年Coons首先用荧光素标记抗体一检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术铁蛋白标记Ab技术。
——70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
——80年代Hsu等建立了抗生物素一生素（ABC）法之后，免疫金一银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
——90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。
——2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。
2．免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分成：①贴片染色；②漂浮染色。
（2）根据Ag—Ab结合方式分成：①直接法；②间接法；③多层法。
（3）按标记物的性质分成：①免疫荧光技术（免疫荧光法）；②免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）；③免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）。
3．标记物（1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。
（2）常用标记物①荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（rho—damineRB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光；②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
③生物素：（Biotin）④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。
其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）4．应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
免疫组织化学的特点
免疫组织化学的特点1. 嘿,各位小伙伴们,今天咱们来聊聊免疫组织化学这个有趣的检测方法。
说起来它就像是一个超级侦探,能在组织里找出各种蛛丝马迹!2. 这项技术最厉害的地方就是它的特异性特别强。
就像是狗鼻子一样,能在茫茫人海中找到特定的目标。
抗体就像是一把钥匙,只有遇到对应的锁才能打开,准确得不得了。
3. 要说敏感性,那可真是没得说。
它能找到组织里特别少量的物质,就像是大海捞针,针再小也逃不过它的"火眼金睛"。
有时候只有一丁点儿的目标物质,它也能给你揪出来。
4. 这项技术还能保持组织的原有结构,让咱们看得清清楚楚。
就像是给细胞拍了个高清照片,该在哪儿就在哪儿,一点都不乱。
这可比把组织打碎了检测强多了。
5. 说到操作简便性,那可真是太友好了。
虽然步骤看起来不少,但都是套路,熟悉了就跟玩儿似的。
就像是跳广场舞,动作都是固定的,练熟了就顺溜。
6. 重复性也特别好,只要按照标准程序来,结果基本都差不多。
就像是照着菜谱做菜,只要步骤对了,做出来的味道都不会差太远。
7. 这技术还能同时检测好几个目标,就像是一箭多雕。
想看这个,又想看那个,没问题!多重染色技术让你一次性看个够。
8. 成本方面也挺实惠的。
虽然一开始买设备可能要花点钱,但日常检测的花费并不高。
比起其他高大上的检测方法,它就像是一个经济实惠的家常菜。
9. 保存时间长也是它的一大特点。
染色好的切片能保存好几年,就像是给细胞拍了张永久照片。
过个几年再拿出来看,样子还是那么清楚。
10. 不过话说回来,它也有些小脾气。
比如背景染色有时候会捣乱,就像是照相时候的杂光。
还有假阳性和假阴性的问题,得特别留意。
11. 结果判读也需要一定经验,这就像是看中医把脉一样,得有点火候。
新手可能看着一头雾水,老手一看就明白是怎么回事。
12. 总的来说,免疫组织化学就像是医学实验室里的万能侦探,帮我们揭示了无数生命的奥秘。
虽然它也有些小毛病,但瑕不掩瑜啊!每次看到那些漂亮的染色图片,都觉得特别神奇,这可真是个了不起的发明!。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
免疫组织化学指标
免疫组织化学指标免疫组织化学是一种用于检测免疫系统功能的方法，通过检测特定抗原或抗体的存在和分布来评估细胞或组织中的免疫反应。
这些指标可以用于诊断和治疗许多免疫相关疾病，如免疫缺陷、自身免疫性疾病和癌症。
本文将对常见的免疫组织化学指标进行详细介绍。
1.抗原表示：抗原表示是指在组织或细胞表面上特定抗原的存在。
例如，免疫组织化学可以用特定的抗体来检测肿瘤细胞表面的特定抗原，从而帮助医生确定肿瘤的类型和分级。
常见的抗原表示指标包括细胞表面抗原CD3、CD20和CD45，它们分别标记T细胞、B细胞和白细胞。
2.抗体表示：抗体表示是指在组织或细胞中检测特定抗体的存在。
例如，通过检测组织中的IgA、IgG和IgM抗体，可以评估免疫系统的功能状态。
抗体表示的指标包括IgA、IgG和IgM的表达水平，以及它们在组织或细胞中的分布模式。
3.炎症标志物：炎症标志物是指在炎症反应中产生的分子，如细胞因子和炎症介质。
它们可以通过免疫组织化学的方法来定位和测量。
常见的炎症标志物包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和C反应蛋白（CRP）。
测量炎症标志物的表达水平可以帮助医生评估炎症的程度和活性，以指导治疗方案的选择。
4.细胞增殖指标：细胞增殖是指细胞的分裂和繁殖过程。
在一些情况下，细胞增殖异常可能与疾病的发展有关。
免疫组织化学可以用细胞增殖标记物，如Ki-67和PCNA，来评估细胞的增殖程度。
对肿瘤细胞增殖的评估可以帮助医生判断肿瘤的恶性程度和预后。
5.细胞死亡指标：细胞死亡是指细胞的死亡和去除过程，包括凋亡和坏死。
免疫组织化学可以用细胞死亡标记物，如Caspase-3和DNA片段化，来评估细胞的死亡情况。
这对于评估各种疾病的发展和治疗反应至关重要。
总之，免疫组织化学是一种重要的免疫学研究和临床诊断方法，可以评估免疫系统的功能状态、炎症反应的活性、细胞增殖和死亡等关键过程。
通过检测特定抗原和抗体的存在和分布，可以帮助医生诊断和治疗免疫相关疾病，并指导治疗方案的选择。
免疫组织(细胞)化学培训课件
孵育一抗
孵二抗试剂1 37度20分钟
孵二抗试剂2 37度30分钟
梯度酒精 二甲苯
血清封闭（试剂A）室温2 h
DAB显色 复染
脱水、透明 封片
免疫组织（细胞）化学
ABC
孵一抗
孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h
放 大 法
孵ABC液（试剂C） 37度40分钟
16
一抗
➢ 首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的 信息，选择所需试剂的型号
免疫组织（细胞）化学
27
免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际 工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗 原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主 要是定位指标，与功能有关。
免疫组织（细胞）化学
28
一、阳性标记免疫特征：分"弱(+)、中(++)、强(+++)" 三级。免疫酶标记（HRP- DAB/H2O2）表现为淡黄 色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易 见。
➢ 孵育时间：可先选择短时间如2 h，若结果不理想， 则适当延长时间。但确定后不要更改。
➢ 孵育温度：室温为宜（25 ℃左右），如过夜则置 于4℃孵育，加二抗前复温至少0.5 h。37℃孵育 可能会使染色过强，或产生非特异性着色。
免疫组织（细胞）化学
18
对照
➢ 阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做。 用于排除方法和实验系统有无问题；
物素含量高的组织抗原检测。
免疫组织（细胞）化学
5
内容
免疫组化* 免疫荧光 显微镜的使用
免疫组织（细胞）化学
6
二甲苯 梯度酒
精
即 用 型 二 步 法
免疫组化原理、步骤及要注意的事项.
免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
第六章__免疫组织化学
具有4个与生物素亲和力极强的结合点。
链霉亲和素（ strept
avidin ）是一种从链 霉菌培养物中提取的蛋白质， 和亲和素一 样，也有4个生物素结合位点。
生物素（ Biotin ） :
维生素H，是一种小分
子的维生素。
抗生物素具有4个与生物素亲和力极强的结合点， 这种亲和力较抗原抗体的亲和力高100万倍，而
免疫原性指的是它能刺激机体免疫系统
产生免疫应答；
反应原性指的是它能与抗体或致敏淋巴
细胞特异性地结合而发生反应。
2.1.2 分类 完全抗原:兼有免疫原性和反应原性的物质 称完全抗原。大多数蛋白质是良好的完全抗 原。 半抗原:只有反应原性而无免疫原性的物质 称半抗原或不完全抗原，绝大多数低分子量 的多糖和所有的类脂均属半抗原。
第六章
免疫组织化学
第一节
1.1 概 念
概
述
免疫组织化学（immunohistochemistry）: 将化学反应中呈色反应与免疫学抗原抗 体反应结合起来，用标记的特异性抗体（或 抗原）对细胞及组织内抗原（或抗体）的分 布进行组织或细胞内原位检测的一门技术。
1.2
与组织化学的关系
从广义上理解： 免疫组织化学为组织化学的分支。 不同点：
2.1.3
抗原的特异性
抗原具有与相应抗体或致敏淋巴细胞发
生反应的特异性。这是由抗原分子表面
具有化学活性的基团—抗原决定簇的性
质、数目和空间构型决定的。抗原决定 簇能被免疫活性细胞所识别，能与相应 抗体的可变区结合。
2.1.4 抗原的异物性 抗原化学结构必须与宿主自身物质的化学 结构相异。
①异种物质。如鸭血清蛋白对于兔为强抗 原，对于鸡则为弱抗原。 ②同种异体物质。如人类的ABO血型的抗原 物质； ③自身抗原。如被血——睾屏障所严密封 闭的精子所含的物质。
免疫组织化学反应结果的判断标准
免疫组织化学反应是一种通过对细胞或组织中特定抗原的免疫反应进行定位和定量分析的方法。
免疫组织化学反应结果的判断标准对于研究和临床诊断具有重要意义。
本文将从深度和广度两个方面探讨免疫组织化学反应结果的判断标准。
一、浅谈免疫组织化学反应免疫组织化学反应是通过特定抗原和抗体的结合来识别目标分子在组织中的位置和表达水平的方法。
在实验室中，常用的免疫组织化学方法包括免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）等。
这些方法通过特定的染色试剂或荧光标记物与靶分子结合，再通过显微镜观察，可以定量和定位组织中的目标分子。
免疫组织化学反应作为一种重要的实验技术，在肿瘤诊断、生物医药研究等领域具有广泛的应用价值。
二、免疫组织化学反应结果的判断标准免疫组织化学反应结果的判断标准包括阳性和阴性的判断、定量的判断以及定位的判断。
阳性和阴性的判断是根据染色或荧光信号的强弱来确定目标分子在组织中的表达情况。
通常情况下，染色强度越强，表示目标分子在组织中的表达水平越高，反之则表示表达水平较低或不表达。
而定量的判断则是通过图像分析系统对染色或荧光信号进行定量化分析，得到具体的表达水平数值。
定位的判断则是通过观察目标分子的染色或荧光信号在组织中的位置，从而确定其在细胞或组织中的分布特点。
在判断标准的具体操作过程中，通常会参考一些常用的评价指标，例如染色强度评分、阳性细胞比例、荧光信号强度值等。
一般来说，染色强度评分可分为0-3级，0级表示无染色，1级表示轻度染色，2级表示中度染色，3级表示重度染色。
而阳性细胞比例一般通过计数阳性细胞和总细胞的比例来确定。
三、个人观点和理解对于免疫组织化学反应结果的判断标准，我认为应该根据具体实验的目的和研究问题来确定。
在某些情况下，我们可能更加关注目标分子的表达水平，因此定量分析显得尤为重要；而在另一些情况下，我们可能更加关注目标分子在组织中的定位，因此定位的判断就显得至关重要。
对于不同的研究问题，我们应该灵活运用免疫组织化学反应结果的判断标准，从而获得更加准确和全面的实验结果。
免疫组织化学
免疫组织化学
免疫组织化学是利用免疫反应的原理，采用免疫和组织化学定向技术，根据器官组织的生理病理活动和病理特征，运用特异性抗体分析组织病理变化，从而为解决器官疾病提供内在检测与决策，起到诊断、预后、潜在因素及靶点药物研发等的重要作用。
免疫组织化学主要使用免疫细胞荧光原位杂交技术和免疫组织染色技术，以部分特异性抗体来特异性结合细胞内特异性蛋白质，指出组织病理变化。
抗体可以搭配细胞进行切片扫描，通过细胞真实图像，用细胞色素和抗原结合结构，获得细胞内抗原蛋白质定位准确、低剂量精度高的有效数据，并可以在细胞外和细胞内实现抗原表位的检测，病变程度的评估及细胞的密度分布的快速统计，以解决细胞死亡等影响检测精度的因素，实现内在参数分析。
免疫组织化学除了可以有效检测器官疾病，还能够检测微小病变和早期疾病，研究证实，由于免疫细胞荧光原位杂交技术和免疫组织染色技术的增强抑制特性，an疾病变得早期检测率可达90%，而传统检测方法则仅30%，故有免疫组织化学作为临床医学诊断技术应用得到充分肯定。
总之，免疫组织化学为临床提供了一种更精确的和有效的疾病诊断技术，在器官疾病的检测诊断中，可以按现有病理特征快速定位及统计，而其它辅助检测方法也让免疫组织化学术语更加全面，更有利于精确明确病变，准确预测疾病的发展趋势，以更高的准确率进行精准治疗并有效预防疾病的发作。
免疫组织化学技术
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
免疫组织化学
内室温孵育15～25min，然后吸去孵育液，
不冲洗。（封闭）
5）滴加PBS适当稀释的第一抗体，湿
盒内孵育，或4℃过夜，或室温2～4h。 6）PBS充分冲洗，3次，2min
7）滴加适当稀释的酶标第二抗体， 湿盒内孵育45～60min（室温或37℃）。
8）PBS漂洗，3次，2min。漂洗后，
冰冻切片可用福尔马林固定，固定后再
0.1mol／L Tris－HCl缓冲液（pH8.3）,
用前加入坚牢红TR盐（1mg／ml）。切片
入此液，室温10～15min。取出后用Tris －HCl缓冲液洗净。
10）将切片置流水中终止呈色反应。
11）按需要可进行甲绿或苏木精复染
细胞核。
12）DAB显色标本可经脱水、透明、
树胶封固。其它显色反应用水溶性介质
为抗原制得，其分子量为 HRP的 2～3
倍，比较稳定，内源性 ALP较易清除，
常用于免疫组织化学染色。
2．胶体金标记
其标记就是蛋白质吸附并结合在金颗 粒表面的过程，是由于金颗粒表面带负电 荷和蛋白质表面所带正电荷有静电吸引， 这种吸附取决于pH值，pH值也与胶体金的
聚合状态有关。胶体金标记蛋白（抗体）
所谓抗体标记技术，即利用荧光素或酶或 重金属颗粒使之结合于抗体分子上。
利用双价或多价结合力的物质，如植 物血凝素、生物素－亲和素等，一方面与 标记物（如荧光素、酶等）结合，另一方 面又可与细胞组织内某种物质（如抗体） 结合，这种利用一种物质对组织内某一成 分亲和能力发展起来的技术，即称亲和免 疫组织化学（affinity immunohistochemistry）。
一、抗体的保存
①冷冻干燥；
②添加防腐剂或保护剂；
《免疫学》免疫组织化学的应用ppt课件
05
免疫组织化学的优缺点与展望
优点
高特异性
免疫组织化学技术能够针对特 定的抗原进行高特异性识别，
减少非特异性染色。
高灵敏度
通过使用酶或其他标记物，可 以检测到极低浓度的抗原，提 高检测灵敏度。
定位准确
通过标记特定抗体，可以精确 定位抗原在组织中的位置，有 助于疾病的诊断和病理研究。
多参数同时检测
《免疫学》免疫组织 化学的应用ppt课件
contents
目录
• 免疫组织化学概述 • 免疫组织化学的基本原理 • 免疫组织化学在病理诊断中的应用 • 免疫组织化学在研究中的应用 • 免疫组织化学的优缺点与展望
01
免疫组织化学概述
定义与特点
定义
免疫组织化学是一种利用抗原-抗体 反应原理，通过标记抗体来检测和定 位组织或细胞内特定抗原物质的技术 。
成本较高
需要针对不同的抗原制备特定的抗体 ，因此成本较高。
展望与未来发展方向
优化技术流程
多技术联合应用
通过改进实验流程和缩短实验时间，提高 实验效率和准确性。
将免疫组织化学与其他技术如基因测序、 蛋白质组学等相结合，以更全面地了解组 织样本中的分子表达情况。
自动化与标准化
临床应用拓展
开发自动化免疫组织化学分析系统，实现 标准化操作，减少人为误差。
20世纪80年代
建立了免疫酶标技术，提高了检测的灵敏度 和特异性。
20世纪70年代
建立了免疫荧光技术，成为最早的免疫组织 化学技术。
20世纪90年代至今
免疫组织化学技术不断改进和完善，应用范 围不断扩大。
02
免疫组织化学的基本原理
抗原-抗体反应
抗原和抗体结合的特异性
免疫组织化学的定义
免疫组织化学的定义
免疫组织化学，简称免疫组化，是病理诊断中的一种检测方法。
它应用免疫学的基本原理，即抗原抗体反应，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，来确定组织细胞内的抗原，并对这些抗原进行定位、定性及相对定量的研究。
免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确等优点，被广泛应用于临床病理诊断、法医学鉴定以及生物学和医学基础研究等领域。
在病理诊断中，免疫组织化学技术主要用于协助疾病的诊断和鉴别诊断。
例如，对于肺癌，通过免疫组化可以检测到癌细胞是否表达某些特定的肿瘤标志物，从而帮助医生判断肺癌的类型和恶性程度。
同时，免疫组化技术还可以用于判断肿瘤的来源，例如通过检测癌细胞表面的某些糖蛋白或糖脂来鉴别肿瘤是来自消化系统还是泌尿系统。
在法医学鉴定中，免疫组织化学技术常用于检测生物样本中的毒品、药物等物质，以协助司法机关进行犯罪调查和审判。
此外，免疫组织化学技术还被广泛应用于生物学和医学基础研究中，例如研究细胞生长、发育、分化等过程中的基因表达和调控机制，以及研究肿瘤发生、发展过程中的基因变异和信号转导机制等。
总之，免疫组织化学技术在医学领域中发挥着重要作用，为疾病诊断和治疗提供了重要的依据和支持。
免疫组织化学原理
免疫组织化学原理
免疫组织化学原理是指通过特定的化学方法和技术对免疫组织
进行研究，以了解免疫过程的生化和分子机制。
免疫组织化学的研究方法包括免疫组化、原位杂交、蛋白质组学、基因组学等技术手段。
其中，免疫组化是最常用的技术之一，通过特定的抗体与靶分子结合的方法来检测、定量、定位和鉴定免疫分子和细胞。
原位杂交则是一种通过探针与目标序列的互补配对，来检测细胞内特定基因表达的技术。
通过这些技术手段，可以深入探究免疫过程的分子机制，从而为疾病治疗和预防提供重要的理论依据。
- 1 -。
免疫组织化学问题解答
免疫组织化学问题解答免疫组织化学是一种什么方法？免疫组织化学方法是一种把分子水平的物质准确具体表达出来的一种方法，这些分子水平的物质可能与癌细胞，细菌，病毒等等有关。
自从成功地制作出这些特异性的抗体，使组织结构可以从分子水平中显示出来，这些特异性抗体可以与肿瘤细胞中特定的结构结合，这些抗体被称为单克隆抗体。
把这些单克隆抗体孵育在组织切片上，与特定的靶细胞进行特异的反应。
如单克隆抗体可以与癌细胞发生特异性反应，单克隆抗体可以从特定的肿瘤病人血细胞中获得。
在组织切片中结合的抗体可以用棕色或红色显示出来。
比如，对转移到骨组织中的肿瘤细胞进行标记实验，我们可以用前列腺特异性抗体进行标记，如显示出棕色或红色的阳性反应，我们可以明确地判断这个转移性肿瘤来自前列腺癌，有些转移的肿瘤距原发部位可能更远。
免疫组织化学不仅能帮助准确地诊断出肿瘤的性质，还可以预测肿瘤预后的生物学行为。
例如，我们可以知道所有组织细胞的增殖活性。
这不是更有意义的实验吗？我们能够判定在一种肿瘤组织中，80%的细胞增殖抑制了其他10%的肿瘤细胞的增殖，我们可以判定出这种肿瘤细胞增殖率高，要比其他肿瘤生长迅速，进展快。
在其他方面，免疫组织化学染色可以指导某些肿瘤的化疗，如：可以测定女性乳腺癌细胞中携带雌激素受体的含量。
如果癌细胞中雌激素表达阳性，病人可以进行三苯氧胺的治疗，雌激素能够促进乳腺癌细胞的生长，三苯氧胺有封闭癌细胞中雌激素受体的功能。
在此过程中，携带雌激素受体的癌细胞是通过激素促进它生长的，而且，癌细胞增生可以通过三苯氧胺治疗来阻止其生长的。
因此，免疫组织化学测定雌激素受体的表达情况，可以预测三苯氧胺治疗的意义。
这仅仅是免疫组织化学应用中的一个小例子。
免疫组织化学在确定组织起源中的应用前景是无限的。
免疫组化技术是一个复杂的生物技术，对每一个抗体标记物都有独自特定的染色方法，目的是能够明确各种组织起源，判定组织中是否存在特异抗原。
病理医生是如何对癌症做出诊断的?癌症病人就诊时，外科医生会在肿瘤部位取一小块组织，送给病理科医生。
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免疫标记电镜技术
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免疫荧光技术 免疫荧光技术将 荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显 微镜下可见，从而显示抗原物质的定位
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荧光素
作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物
类脂质 细胞悬液 10％甲醛 1％聚甲醛
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4 ℃ ，30～60min
室温，3～10min 室温，2min
标本的固定与保存
冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的 制片方法。 冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因 固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅 速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构 的破坏。 石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法， 可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研 究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但 是抗原的保存量不如冰冻切片。
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酶消化处理
石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中 由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不 理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应 之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新 裸露。 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。
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抗体处理与保存
复合物； 用缓冲液冲洗去未结合的成分； 直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接 法），或待标本显色后再用显微镜观察结果 （免疫酶直接法）
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免疫染色
对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加 检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。
1.蛋白酶消化法 采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透 性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。 常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。 2.非特异吸附法 免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异 性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相 同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物煮至上的带电 荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2% 左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。
染色 特异性染色 非特异性染色
显色部位
显色定位 显色程度
特定细胞或间质
特定，具有结构性 同一部位呈不同程度显色
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细胞和间质均匀染色或更强
无特定部位，无结构性 无分布规律，某一片均匀着色
几种常用的免疫组化检测技术
荧光免疫组织化学技术
酶免疫组织化学技术
免疫金（银）组织化学技术
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Байду номын сангаас
标本的固定与保存
各种抗原的固定
抗原
蛋白质 免疫球蛋白 丙酮
固定剂
95％乙醇
固定温度与时间
室温，3～15min 4℃，30min
酶
激素 细菌 病毒
四氯化磺
1％聚甲醛 丙酮、甲醇 丙酮，无水乙醇
4 ℃ ，30min
4 ℃ ，4～5h 室温，3～10min 室温，5～10min
四氯化磺
抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选 用的高特异性、高效价的第一抗体为多克 隆抗体。
抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色 应鲜明，背景应钱或不着色。
抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏 感抗体稀释度应越高。
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免疫染色
免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。
标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体
固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内 酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态 与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应 的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在 染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。
好的固定剂： （1）能快速固定抗原 （2）防止抗原物质扩散
（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应
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免疫组化染色中标识物的选择
用量微小，容易在光镜或电镜下识别
机体内无同一物质或类似物质 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，
其结合物也稳定 目前常用标识物质有荧光色素、放 射性同位素、重金属、微粒子、酶等
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设立对照实验
为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通 常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对 照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。 （1）阳性对照 用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化 学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。 （2）阴性对照 用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴 性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和 抑制对照等，用以排除假阳性结果。
间接法
标本的处理
组织材料处理是获得良好免疫细胞组织 化学分析的保障，必须保证要检测的细胞 或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保 存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。
标本的主要来源：活体组织、各种体液、
穿刺液、培养细胞 标本的固定与保存 酶消化处理
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标本的固定与保存
显微镜下观察 结果
抗原抗体 反应和呈 色反应
标本的处 理
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组织抗原
抗体
标记物
1 2 3 4 荧光 酶 亲和技术 金标
标记抗体
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免疫细胞化学反应原理：
组织抗原
＋
标记的抗原抗体复合物
标记抗体
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两种免疫细胞化学反应方法
直接法
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免疫组化的结果判断
免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三 种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可 反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。 阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔， 而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由 显著区别。
免疫组织化学
报告人：傅琦博 指导老师：胡翊群
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何谓免疫组化
免疫组织化学是指在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织呈色 反应，借助可见的标记物，对相应 的抗原或抗体进行定位、定性和定 量检测的一种免疫检测方法。
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免疫组化的全过程
抗原的提取与 纯化 免疫动物或 细胞融合， 制备特异性 抗体及纯化 标记物与抗 体集合形成 标记抗体