免疫组织化学解析

间接法
标本的处理
组织材料处理是获得良好免疫细胞组织 化学分析的保障，必须保证要检测的细胞 或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保 存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。
标本的主要来源：活体组织、各种体液、
穿刺液、培养细胞 标本的固定与保存 酶消化处理
傅琦博 F0318102
标本的固定与保存
免疫标记电镜技术
……
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免疫荧光技术 免疫荧光技术将 荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显 微镜下可见，从而显示抗原物质的定位
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荧光素
作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物
固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内 酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态 与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应 的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在 染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。
好的固定剂： （1）能快速固定抗原 （2）防止抗原物质扩散
（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应
复合物； 用缓冲液冲洗去未结合的成分； 直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接 法），或待标本显色后再用显微镜观察结果 （免疫酶直接法）
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免疫染色
对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加 检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。
1.蛋白酶消化法 采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透 性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。 常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。 2.非特异吸附法 免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异 性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相 同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物煮至上的带电 荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2% 左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。
染色 特异性染色 非特异性染色
显色部位
显色定位 显色程度
特定细胞或间质
特定，具有结构性 同一部位呈不同程度显色
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细胞和间质均匀染色或更强
无特定部位，无结构性 无分布规律，某一片均匀着色
几种常用的免疫组化检测技术
荧光免疫组织化学技术
酶免疫组织化学技术
免疫金（银）组织化学技术
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标本的固定与保存
各种抗原的固定
抗原
蛋白质 免疫球蛋白 丙酮
固定剂
95％乙醇
固定温度与时间
室温，3～15min 4℃，30min
酶
激素 细菌 病毒
四氯化磺
1％聚甲醛 丙酮、甲醇 丙酮，无水乙醇
4 ℃ ，30min
4 ℃ ，4～5h 室温，3～10min 室温，5～10min
四氯化磺
显微镜下观察 结果
抗原抗体 反应和呈 色反应
标本的处 理
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组织抗原
抗体
标记物
1 2 3 4 荧光 酶 亲和技术 金标
标记抗体
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免疫细胞化学反应原理：
组织抗原
＋
标记的抗原抗体复合物
标记抗体
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两种免疫细胞化学反应方法
直接法
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免疫组织化学
报告人：傅琦博 指导老师：胡翊群
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何谓免疫组化
免疫组织化学是指在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织呈色 反应，借助可见的标记物，对相应 的抗原或抗体进行定位、定性和定 量检测的一种免疫检测方法。
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免疫组化的全过程
抗原的提取与 纯化 免疫动物或 细胞融合， 制备特异性 抗体及纯化 标记物与抗 体集合形成 标记抗体
抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选 用的高特异性、高效价的第一抗体为多克 隆抗体。
抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色 应鲜明，背景应钱或不着色。
抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏 感抗体稀释度应越高。
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免疫染色
免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。
标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体
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酶消化处理
石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中 由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不 理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应 之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新 裸露。 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。
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抗体处理与保存
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免疫组化染色中标识物的选择
用量微小，容易在光镜或电镜下识别
机体内无同一物质或类似物质 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，
其结合物也稳定 目前常用标识物质有荧光色素、放 射性同位素、重金属、微粒子、酶等
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设立对照实验百度文库
为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通 常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对 照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。 （1）阳性对照 用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化 学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。 （2）阴性对照 用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴 性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和 抑制对照等，用以排除假阳性结果。
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免疫组化的结果判断
免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三 种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可 反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。 阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔， 而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由 显著区别。
类脂质 细胞悬液 10％甲醛 1％聚甲醛
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4 ℃ ，30～60min
室温，3～10min 室温，2min
标本的固定与保存
冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的 制片方法。 冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因 固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅 速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构 的破坏。 石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法， 可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研 究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但 是抗原的保存量不如冰冻切片。