研究生电生理技术实用教材

电生理技术实用教材
肖中举 周英杰 陈 娟
教授 讲师 助教
南方医科大学 基础医学院生理教研室

Chapter 1
用微电极记录细胞外的单单位和多单位放电
J. MILLAR
1. 简介：细胞外放电的来源
神经元的跨膜动作电位可向周围组织扩布，从而产生电压，即细胞外峰电位。哺乳动物 中枢神经系统神经元产生的细胞外锋电位时程取决于神经元的类型和锋电位记录系统的带 宽，范围在 0.2ms 至 20ms 之间。幅度可在 2 微伏到数毫伏间变化。对神经生理学家来说， 细胞外记录的优势在于它可以记录到神经元的活动但不必因穿刺而损伤神经元。 为了避免损 伤细胞，应尽量避免穿刺，因为细胞太小穿刺很困难，另外血压及呼吸运动造成的机械震动 会使组织产生移动从而使穿刺的稳定性受到影响。 正是由于这些原因使得麻醉后动物的神经 元的记录与脑片和细胞培养不同，采用的是细胞外记录。 细胞外记录的缺点是很容易同时记到两个或多个单位放电， 即所谓的 ‘multi-unit’ 记录。 如果能够分辨两个细胞的放电的话，这问题就迎刃而解了。当然，这很困难。这就好比两人 在嘈杂的环境中用一个麦克风在说话一样， 声音可以通过响度被区别开来， 但如果要区分的 声音响度（幅度）很相近，其它的特征如音高甚至说话的速度等都要加以考虑。 同理，某一时间记录到的放电和 40ms 前记到的放电不能保证是来自于同一个细胞，我 们需要根据电位的幅度和形状及发放模式来加以判断。 只有能够确定锋电位形状或模式， 使 其能明显区别于产生于同一记录部位的其它电位， 我们才能说记录得自于同一细胞。 胞外记 录的电位有可能只比噪声大一点点， 所以记录电极的噪声控制尤为重要。 目前应用的具有最 低噪声的细胞外记录电极是镀银碳纤电极。镀铂钨电极噪声也非常小并且多年来一直在用。 玻璃电极是最容易制作的细胞外记录电极， 但相对于上述两种实芯导线型的电极来说噪声大 了很多。下面将要介绍这三种电极的制作细节。用于特殊用途（如用于长期记录的微丝）的 一些其它类型的细胞外电极的制作细节可以参见参考文献部分。
2.钨丝微电极
2.1 背景
钨丝微电极可以说是一种经典的细胞外记录电极， 自上世纪五十年代以来， 在神经元功 能分析领域成功运用了相当长的时间。 Nobel 奖获得者者 Hubel 和 Wiesel 关于视觉系统的研 究就采用了这种电极。
2.2 优点
显然，微电极的直径需要很短，至少尖端如此，这可以使其在进入神经元组织时所造成 的损伤最小化。同时电极也需要有一定的刚性，保证在推进的时候不会发生弯曲。因为一个 易弯曲的电极会从目的路径侧向“飘移”相当远的距离，给定位造成很大困难。钨是一种很 容易得到的金属，钨丝也很便宜（常用来制作灯丝） ，并且够硬。
2.3 缺点
钨丝微电极的主要缺点如下： 钨丝的噪声大，除非镀上铂； 制作困难，尽管有些文献并不这么认为；

钨丝的电化学特性决定钨丝微电极不适于进行长时间的记录，除非表面镀上铂。
2.4 原材料的供给性
钨丝可做成两种微电极： 表面涂清漆的电极和涂玻璃的电极。 清漆绝缘型钨微电极制作参见 D.H.Hubel 1957 年文献所述（1） ，但随后由于其长久记录维持困难，玻璃绝缘型电极成为目 前的主流模式。其制作需要一些特殊仪器，从长远看制作这些特殊仪器是值得的，这种电极 的另一个好处是可用作微刺激装置。
2.5 玻璃绝缘型钨电极的制作
2.5.1 设备 需要如下设备： 目镜和物镜的放大倍数为 10 倍的旧显微镜 钨丝腐蚀装置 垂直型微电极拉制器 两个用来将电极和铂钩移入显微镜视野的微操纵器 电极电镀装置 旧显微镜可以用来观察钨丝的第二次腐蚀和电镀过程，腐蚀和电镀过程常常避免不了溅 射， 会使显微镜台受到一些侵蚀， 所以用旧的显微镜为佳 （可用被解剖科室淘汰的旧显微镜） 。 显微镜要可以放大到 100 至 200 倍，如目镜为×10,物镜为×10 或×20。额外的（或附带的） 照明也很必要,可以用导光纤维灯源来照明，将其从侧面成一定角度固定在台上。 腐蚀装置需要将电极重复浸入腐蚀溶液池中，直到电极变成合适的锥形。试验性的或少 量的电极制作完全可以用手工完成。如需要量大，有两种腐蚀装置可用，二者在腐蚀过程中 都需要一个电极固定设备。图 1 所示是一个圆形的铜筒，长度与直径都是 2cm。一面钻孔， 装上杆，电极通过微孔带固定在筒的另一面。一种腐蚀装置（2）是用杆将筒上的电极以一 定的角度浸入腐蚀液中， 杆不断转动导致电极产生椭圆形横切面。 采用一种垂直浸入方法可 以获得更可靠的腐蚀效果。电极固定在筒上，伸向腐蚀液，筒用一根杆将之悬挂在一种韧性 线上，此线通过一个“Guide Eye”再连接并固定到垂直转盘的某一点（见图 2） 。此转盘由 一个 5r.p.m 的小马达来驱动。两个小的触发器附着在转盘外周，可以经微开关通过一个中 介装置使腐蚀液被不停的通电和断电交替进行， 控制腐蚀过程。 杠杆使腐蚀液上方的筒上下 移动从而使电极随之浸入或移出腐蚀液。 腐蚀液采用 150g/100ml 的亚硝酸钾溶液，可用 100ml 的玻璃烧杯或水槽盛装。一个浸 入到溶液中的碳棒（一套用电线平行缠绕的碳棒更佳）用来构成腐蚀所用的 counter 电极。 腐蚀需要大约 6 伏、 数安培 （A） 大小的交流电源， 可通过自耦电源变压器轻易获得 0 至 250 伏的交流电压，然后再连上一个 12V（5A）的额定输出的变压器。用鄂鱼夹连接的多股柔韧 的缆线连接在纺锤体和碳棒上接通电环路。 第二次腐蚀过程中， 将两小杆贴在显微镜台上或一个固定在微操纵器的杆上， 然后将铂 丝(100 微米)固定在两者之间。铂丝的中部被折成直径大约 1mm 的小线圈，线圈通过表面张 力可吸附一滴腐蚀液， 可以在显微镜视野下将线圈移动。 第二个操纵器可将电极丝从第一次 腐蚀过程中移出。 第一次腐蚀过程中所用的电压也适用于第二次腐蚀过程， 但需要稍稀释的 溶液。 为了给腐蚀后的电极丝涂上玻璃， 最好要有具有多管拉制功能的强力电极拉制器， 我们 使用 Narishige PE-2 型拉制器。将由泡沫橡胶制成的磨擦环围在杆的底部（通过此处进入 螺线圈），这样就可以在需要时减慢杆下降的速度。附着在主要支持设备上的夹子也可发挥 闸样作用，在玻璃被拉长一段适宜距离后使其停止拉制。