原核表达 蛋白纯化 EMSA凝胶阻滞 详细步骤
凝胶阻滞-EMSA
Gel-shift实验还可以用来研究发生上述结合作用的DNA序 列的精确特异性，其方法是在DNA-蛋白质结合反应体系中， 加入超量的非标记竞争DNA（competitor DNA）。如果它与同 位素标记的DNA结合是同一种蛋白，那么由于竞争DNA是极 大量的，绝大部分蛋白质将被其竞争结合掉而使探针DNA仍处 于自由状态，所以就不会出现阻滞的条带；相反，如果反应中 加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一蛋白质， 于是探针DNA便仍然与特定的蛋白质结合形成复合物，结果在 放射自显影图谱上就会呈现阻滞的条带。同样，在竞争DNA上 已知的转录因子结合位点，事先引入一个或数个碱基突变，通 过凝胶阻滞实验也可有效地评估这些突变对竞争DNA的功能及 其与转录因子结合作用的影响。
R. Voll 09/01
实验操作步骤
• 1、实验前准备
2、形成蛋白-探针复合物
• 3、制备凝胶，电泳 • 4、转膜 • 5、检测
注意事项
• 1、实验前准备
（1）合理的实验方案 根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非 特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性 抗体组、特异性核酸竞争组等。 （2）样本制备 可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯 化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中 等量加入蛋白。 （3）探针制备
实验原理
在Gel-shift experiment实验中，首先是用32P标记待测的DNA片段 （probe），然后同细胞蛋白质提取物一起温育，于是使有可能形成 DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的PAGE中，在控制使蛋白 质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离，并运用放射自显 影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白提取物中 不存在可与32P标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有的32P都将 集中在凝胶底部；反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻 滞的原因，其特有的32P标记的探针DNA条带都将滞后出现在较靠近 凝胶顶部的位置。
凝胶迁移实验(EMSA)
凝胶迁移实验（EMSA）凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
1实验方法和原理凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
2实验材料、试剂、仪器耗材DNA样品[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、过硫酸铵、TEMED（四甲基乙二胺）、EMSA Gel-Shift结合缓冲液、溴酚蓝等水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽等3实验步骤一、探针的标记1. 如下设置探针标记的反应体系：（1）待标记探针(1.75 pmol/微升) ：2微升。
emsa实验原理
EMSA实验原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与核酸（一般是DNA）之间的相互作用。
该技术通过观察蛋白质-核酸复合物在凝胶电泳中的迁移率变化，可以揭示蛋白质与DNA结合的情况。
实验原理在EMSA实验中，首先需要准备一定浓度的DNA片段，通常是已知序列的DNA探针。
接着，将待检测的蛋白质与这些DNA探针一起混合，形成蛋白质-核酸复合物。
随后，将这些混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。
在凝胶电泳过程中，如果DNA片段没有与蛋白质结合，那么它们将会沿着电场方向运动到特定位置。
但是，如果DNA片段与蛋白质结合形成复合物，则复合物的迁移率会受到影响，迁移速度将会减慢。
结果就是在凝胶中观察到不同带电簇的出现，这些带电簇代表了不同的蛋白质-核酸复合物。
通过对凝胶电泳结果进行分析，可以确定哪些蛋白质与DNA结合，并且可以定量检测它们之间结合的强度和亲和力。
这样的信息对于理解蛋白质功能以及基因调控机制至关重要。
实验步骤1.制备实验样品：准备已知序列的DNA探针和待检测的蛋白质溶液。
2.形成蛋白质-核酸复合物：将DNA探针和蛋白质混合，在合适的条件下形成复合物。
3.加载到凝胶中：将混合物加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
4.电泳分离：在合适的电场作用下，观察蛋白质-核酸复合物的迁移情况。
5.结果分析：分析凝胶电泳结果，确定蛋白质-核酸复合物的形成情况以及强度。
结论EMSA实验是一种简单有效的方法，用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用。
通过该实验，可以揭示蛋白质在基因调控中的作用，帮助科研人员深入理解这些生物大分子之间的相互作用机制。
EMSA技术在基因编辑、药物研发等领域有着广泛的应用前景，对于推动生命科学的发展起着重要作用。
EMSA操作说明
非放射性凝胶迁移试剂盒（EMSA）操作手册本说明书适用于产品号为SIDET001, SIDET003与SIDET004的产品VER. 3.112005年2月目录1. 简介 (3)2. 试剂盒包装清单 (3)3. 自备实验材料与仪器 (4)4. DNA/蛋白质结合反应 (4)5. 聚丙稀酰胺凝胶电泳 (5)6. 电转移 (6)7. DNA的交联固定 (6)8. 化学发光反应 (6)9. 化学发光图像显示 (7)10．常见问题 (8)11. 参考文献 (8)12．注意事项 (9)2005© Viagene，All rights reserved.1．简介EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。
这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。
本非放射性EMSA成套试剂盒是结合高灵敏度的化学致发光技术建立起来的实验系统。
与市场上的EMSA产品比较，Viagene公司的EMSA试剂盒操作更简单迅速，并可得到更好的实验效果；与同位素放射法相比Viagene公司的非放射性EMSA试剂盒解决了探针不稳定、同位素辐射等问题，并具有高灵敏度、快速获得结果、避免材料浪费等优点。
目前Viagene公司提供三套非放射性EMSA试剂盒用来检测活化的NF-KB(核转录因子-KB，Cat#; SIDET001)、STAT3(信号转导和转录激活因子3，Cat#; SIDET003)和STAT5(信号转导和转录激活因子5，Cat#; SIDET004)。
每种试剂盒均经过多次实验测试，并已优化了DNA-蛋白转录因子的结合条件。
EMSA原理流程
凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
实验方法原理凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA—electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA—复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链.当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异）,来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
试剂、试剂盒[γ—32P]ATPT4多聚核苷酸激酶Nuclease-Free WaterT4多聚核苷酸激酶缓冲液醋酸铵TE 无水乙醇TBE buffer重蒸水甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺甘油过硫酸铵TEMED(四甲基乙二胺）EMSA Gel-Shift结合缓冲液溴酚蓝仪器、耗材水浴锅PCR仪离心机电泳仪电泳槽实验步骤一、探针的标记1。
如下设置探针标记的反应体系：(1）待标记探针(1.75 pmol/微升) ：2微升。
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X）：1微升。
凝胶迁移(EMSA)实验总结
EMSA实验总结实验原理：凝胶迁移实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究蛋白与核酸（DNA/RNA）相互作用的技术。
实验步骤：（参考碧云天化学发光法EMSA 试剂盒）1.蛋白：利用原核表达蛋白，进行纯化后测定蛋白的浓度（BSA法测定）。
4 ℃保存。
注：提取的植物总蛋白（贝博试剂盒）进行EMSA实验，蛋白易滞留在点样孔，具体原因尚不明确。
2.探针：合成biotin标记的探针、未标记的探针、突变探针（需要HPLC纯化）。
注：合成单链探针，使用时1:1混合，利用PCR仪合成双链探针。
具体步骤：探针根据使用浓度用DEPC水稀释，正链：反链 = 1:1 ,PCR程序：75 ℃30 min，以后每个循环降低0.1 ℃，直到0 ℃。
3.6 % EMSA非变性胶：制胶前需要把制胶模具清洗干净，不能有SDS残留。
一块胶的用量（6 mL），不用制浓缩胶。
5 × TBE 1 mL30 % acrylamide/bisacrylamide 2 mL40 % 甘油 625 μLO 3.125 mLdd H210 % 过硫酸铵 150μLTEMED 5 Μl4.EMSA结合反应：（20 µl反应体系，蛋白和探针根据实验需求和预实验进行调整）阴性对照反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl标记好的探针样品反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子标记好的探针探针冷竞争反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子未标记的探针标记好的探针突变探针的冷竞争反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子未标记的突变探针标记好的探针Super-shift反应：Nuclease-Free Water add to 20 µlEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 4µl细胞核蛋白或纯化的转录因子目的蛋白特异抗体标记好的探针在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25ºC)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。
(完整版)凝胶迁移实验(EMSA)实验方法
凝胶迁移实验（EMSA）实验方法凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。
最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。
一、实验原理EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。
根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。
二、实验操作步骤1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。
（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。
对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。
（3）探针制备根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。
现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。
2、形成蛋白-探针复合物（1）在0.5ml（2）冰浴5min（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。
3、制备凝胶，电泳（1）制备6.5%（2（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。
（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。
（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。
（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）4、转膜（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。
凝胶阻滞,EMSA
凝胶顶部的位置。
Nuclear extract of non-activated cells
Nuclear extract of activated cells
EMSA: Principle
Radioaktively labeled oligonucleotide with NF-B - binding site (probe) and bound NF-B
பைடு நூலகம்
• 2、检测
（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容 器中，冲洗,注意整个检测过程避免膜干燥。 （2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡， 室温封闭20min。 （3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素 （Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育 45min。（勿将酶标记物直接加到膜上） （4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次， 每次室温轻微震荡1 0min。 （5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育 5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在 膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡） （6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长 短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。
NF-B
Free Probe
Radioactively labeled oligonucleotide with NF-B - binding site (probe)
A double-stranded oligonucleotide containig a NF-B- binding site is labeled with a radioactive isotope and incubated with a nuclear extract. During gel-electrophoresis, NF-B bound to the oligonucleotide causes a shift compared to the free probe.
《现代生命科学研究技术》实验指导-EMSA验证蛋白与DNA的结合-笔记版
利用凝胶阻滞实验（EMSA）验证蛋白与DNA的结合一、实验原理及应用凝胶阻滞实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA），是一种研究蛋白和核酸相互作用的技术。
蛋白质与放射性标记或生物素标记的探针结合后，形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率比自由探针的迁移率大大降低，表现为条带滞后。
凝胶阻滞实验具有简单、快捷、灵敏等优点，可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来进一步确定阻滞条带所结合的蛋白质。
结合定点突变技术，还可以用来研究蛋白结合核酸的关键位点。
许多生物学过程，如染色体的包装、维持及控制，都与蛋白质-DNA间的非特异性相互作用有关。
在古菌中发现的某些小分子量DNA结合蛋白具有与组蛋白类似的功能，按分子量不同分为7kDa、8kDa和10kDa三类。
本实验中所用的蛋白质Sul7d是来源于嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）中的7kDa 蛋白，能够和DNA非特异性结合。
本实验中利用EMSA实验验证体外表达的Sul7d蛋白和DNA的相互作用。
60 bp的DNA片段由公司合成。
部分DNA片段由生物素标记。
将纯化好的Sul7d蛋白与DNA底物共孵育，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；将凝胶上的样品转移到NC膜，利用显色剂显影后即观察到目标蛋白与不同结构底物的结合情况。
生物素标记法采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，以随机引物为起始引物，将生物素标记的dUTP引入到合成的DNA探针中，产生高活性生物素标记的DNA片段。
生物素标记相对于同位素标记，操作方便、安全。
为了获得准确的实验结果，还应该在蛋白质-核酸混合液中分别加入不同浓度的“竞争剂”（competitor）。
竞争剂与探针序列相同，但没有被标记。
如果被检测的滞后条带随“竞争剂”浓度增加而逐渐减弱，说明蛋白质和探针之间的结合是特异的。
emsa实验方法与过程
emsa实验方法与过程EMSA实验方法与过程EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的蛋白质-核酸相互作用分析方法，可以用于检测DNA结合蛋白的存在、纯度和活性。
本文将介绍EMSA实验的方法与过程。
实验方法：1. DNA探针制备：将目标DNA序列合成或从基因组中扩增，然后标记为放射性同位素或非放射性标记物。
2. 蛋白质提取：从细胞或组织中提取目标蛋白质，可以使用细胞裂解液或纯化蛋白质。
3. EMSA反应：将标记的DNA探针与提取的蛋白质混合，形成蛋白质-核酸复合物。
然后将反应混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中，进行电泳分离。
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：将反应混合物电泳分离，根据蛋白质-核酸复合物的大小和电荷，可以观察到不同的带状图案。
5. 膜转移：将凝胶上的DNA和蛋白质转移到膜上，然后用放射自显影或非放射性探针检测蛋白质-核酸复合物。
实验过程：1. 准备实验材料：包括DNA探针、蛋白质提取液、聚丙烯酰胺凝胶、电泳缓冲液等。
2. 制备DNA探针：将目标DNA序列合成或扩增，然后标记为放射性同位素或非放射性标记物。
3. 蛋白质提取：从细胞或组织中提取目标蛋白质，可以使用细胞裂解液或纯化蛋白质。
4. EMSA反应：将标记的DNA探针与提取的蛋白质混合，形成蛋白质-核酸复合物。
然后将反应混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中，进行电泳分离。
5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：将反应混合物电泳分离，根据蛋白质-核酸复合物的大小和电荷，可以观察到不同的带状图案。
6. 膜转移：将凝胶上的DNA和蛋白质转移到膜上，然后用放射自显影或非放射性探针检测蛋白质-核酸复合物。
EMSA实验是一种简单、快速、灵敏的蛋白质-核酸相互作用分析方法，可以用于检测DNA结合蛋白的存在、纯度和活性。
在实验过程中，需要注意控制实验条件，避免误差的产生。
同时，还需要注意实验安全，避免放射性同位素对实验人员造成伤害。
EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)
三、凝胶滞留试验(EMSA)凝胶迁移滞留试验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法,目前已经成为转录因子研究的经典方法,并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合,电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢,即表现为相对滞后。
(一)转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。
裂解液:25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM NaEDTA、1mM DTT和21×Complete Protease InhibitorCocktail。
洗脱液:50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%(v/v)Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。
EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液:25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2Protease InhibitorCocktail。
1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。
2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中,37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。
3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM,28℃、200 rpm培养6 h。
4 冰上放置10 min,4℃、3000×g离心15 min,收集菌体并称重。
5 每克菌体加入3 mL裂解液,重悬菌体,加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1,在冰上温和地搅动菌液30 min。
6 超声波破碎30 s(破碎10 s停10 s)。
凝胶迁移实验(EMSA)
凝胶迁移实验（EMSA）凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
1实验方法和原理凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
2实验材料、试剂、仪器耗材DNA样品[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、过硫酸铵、TEMED（四甲基乙二胺）、EMSA Gel-Shift结合缓冲液、溴酚蓝等水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽等3实验步骤一、探针的标记1. 如下设置探针标记的反应体系：（1）待标记探针(1.75 pmol/微升) ：2微升。
凝胶迁移阻滞实验(EMSA)实验操作方法及注意事项
凝胶迁移阻滞实验（EMSA）转载丁香园大神的帖子！非常详细！EMSA实验技术作为一个经典的DNA/protein,RNA/protein的检测技术,不是很多简单的实验技术可以替代的! EMSA试验技术的独特性和复杂性决定了,要想做成功EMSA试验,拿到阳性结果可总结为一句话: 把握整体,注意细节!EMSA的整体性包括6大点:探针制备(设计,合成,标记,纯化,退火);个人实验设计(时间剃度浓度查阅文献等);核蛋白制备;浓度测定;EMSA操作;实验时竞争设计. 这六大点都是会直接影响到EMSA试验的成功与否!简介:EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。
这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。
发展:从发展史来看,这项实验技术起初是用32P同位素标记人工合成的寡核苷酸形成探针,但是由于同位素的放射性很强,而且半衰期为14天,所以从定购到标记再到做完试验,必须14天完成,种种制约因素导致现代科技发展非同位素EMSA试验技术,这就出现了地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术.在实践中没多久,地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术就暴露了一个严重的缺陷,标记的探真纯化后灵敏度弱,导致实验结果的信号不行,最终就出现了现在的生物素标记探真的EMSA实验技术.配合化学发光技术良好的解决了灵敏度的问题,到目前为止, 生物素标记探真的EMSA实验技术广为应用!EMSA试验成功的关键因素:1.1.试验设计,主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间剃度的问题,这个很关键,很多同学不注意这一点,最后试验确实是拿不到阳性结果,比如我一前一个朋友用药物处理SGC7901细胞,就是因为时间点设计的不好EMSA试验结果是阴性的,后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度,最终得到阳性结果! 所以这个设计很关键给一个个人的实验总结希望能帮助大家:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些,因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程.时间可以长一些,主要根据自己的药物刺激特性确定时间点.2.核蛋白样品的制备;制备蛋白样品的关键是:1.注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做,才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像.2.掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度. 能入核的蛋白本来就不是很多,所以核蛋白的浓度往往不会很高,但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是听高的! 一般要求在1ug/ul以上!有时候稍微低于这个数量级也可以,但是不能太低,否则影响结合反应拿不到结果. 这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失.同时,一般制备核蛋白的材料为细胞和组织, 细胞要比组织好做的多,最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多. 而组织抽提后杂蛋白相对较多!杂蛋白多会影响试验结果不容易得到EMSA阳性结果!!3.探针的制备:又很多站友都在问我生物素标记到3’端还是5’端,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.4.EMSA实验技术. 这一点主要是操作的细节问题! 下面会更细的谈到.技术要点:关于技术要点,我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作,其他的照正常程序就可以了!1. 制胶必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺）3.3ml50% Glycerol（50%甘油）1.0mldH2O（蒸馏水）14.8mlTEMED（四甲基乙二氨）20µl脱气10min10% AP（过硫酸氨）120µl总量20.0ml2. 一般试剂盒包括的试剂l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20 oC)l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20 oC)l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4 oC)l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20 oC)l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20 oC)l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4oC)l 2×Blocking Buffer（2×封闭液）(4 oC)l 5×Washing Buffer（5×洗涤液）(4 oC)l Equilibration Solution（平衡液）(4 oC)l Binding-membrane（结合反应膜）(RT)3. 结合反应每次结合反应需1-5µl核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15µl（1）结合反应体系：10X 结合反应液1.5µlPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0µl细胞核提取物* ? µl双蒸水* ? µl混匀室温静置20 分钟生物素标记的探针0.5µl总量15µl混匀室温静置20分钟或以上。
凝胶迁移实验(EMSA)
凝胶迁移实验（EMSA）凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
1实验方法和原理凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。
同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
2实验材料、试剂、仪器耗材DNA样品[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、过硫酸铵、TEMED（四甲基乙二胺）、EMSA Gel-Shift结合缓冲液、溴酚蓝等水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽等3实验步骤一、探针的标记1. 如下设置探针标记的反应体系：（1）待标记探针(1.75 pmol/微升) ：2微升。
emsa凝胶迁移实验原理 -回复
emsa凝胶迁移实验原理-回复什么是EMSA凝胶迁移实验？EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）凝胶迁移实验，也称为荧光着色凝胶迁移电泳（Fluorescence-Based Gel Shift Assay），是一种常用的分析蛋白质与核酸的相互作用的实验方法。
它的原理基于蛋白质与核酸结合后，形成复合物的电泳迁移速度较慢，从而可以通过凝胶迁移实验来研究这种相互作用。
EMSA凝胶迁移实验步骤：EMSA凝胶迁移实验一般分为以下步骤：制备蛋白质样品、制备探针、组装电泳体系、进行凝胶电泳、可视化和数据分析。
下面将一一介绍。
制备蛋白质样品：首先，需要从细胞中提取目标蛋白质。
其中，核酸结合蛋白质可能需要使用非变性提取缓冲液来保持蛋白质的完整性。
接着，使用蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度，并将提取的蛋白质样品进行冻存备用。
制备探针：探针是通过标记核酸分子，使其可以被可视化的荧光或放射性探针来识别的一种分子。
一般来说，探针可以通过合成或PCR方法获得。
然后，使用标签化的核酸标记试剂对探针进行标记，例如使用小分子的双链DNA或RNA标记试剂进行标记。
组装电泳体系：将已标记的核酸分子和目标蛋白质混合，在细胞提取液的缓冲液中，加入一定浓度的非特异性的竞争性DNA或RNA，这种非特异性核酸可以防止非特异性结合。
然后，将混合溶液与凝胶电泳缓冲液混合，并加入适当的电泳缓冲液。
进行凝胶电泳：将混合溶液加入到已经制备好的凝胶模板中，然后将凝胶模板转移到电泳仪中。
在电泳仪中，将电泳仓填满电泳缓冲液，然后将凝胶模板放入电泳仓中。
启动电泳，在一定的电压下，核酸和蛋白质复合物会从样品孔口开始电泳，不同的核酸和蛋白质复合物根据大小和电荷的不同而迁移的速度也会有所不同。
经过一段时间后，关闭电源，取出凝胶模板。
可视化和数据分析：将凝胶模板置于荧光成像仪或放射线扫描仪上，观察标记物的荧光或放射性信号。
EMSA操作步骤
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白或核蛋白提取物。
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用细胞核或胞质提取物。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）和其它非特异片段，来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。
EMSA操作步骤（PIERCE试剂）1.蛋白的提取2、制胶（1.5mm胶，大约30分钟胶会凝）试剂浓度5.5％H2O ml 7.15*TBE ml 140％丙烯酰胺（37.5：1）ml 1.3850%甘油 ul 50010％AP ul 50TEMED ul 10总体积 ml 10待胶完全凝固后120v预电泳1h，缓冲液用预冷的0.5×TBE。
3 蛋白与探针反应混合后室温放置20分钟。
4 上样预电泳完后马上更换预冷的电泳缓冲液，加5ul的5×上样缓冲液到样品混合液中，马上上样电泳。
180v 30－45分钟。
5 电转移将带正电的尼龙膜放入0.5×TBE中平衡10分钟。
待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。
转膜缓冲液为预冷的0.5×TBE。
380m A 30分钟。
6 交联转膜完成后将膜取出，放在一张干净的滤纸上，做好标记。
于紫外灯下30cm处作用20分钟。
7 封闭用封闭液封闭20分钟。
期间放于摇床上轻柔摇晃。
1秒钟1次。
8 抗体反应倒掉封闭液。
用封闭液将抗体稀释300倍后，孵育30分钟。
期间放于摇床上轻柔摇晃。
1秒钟1次。
9 洗脱用1×的洗脱液清洗5分钟3次。
摇床速度加大。
10 平衡用平衡液平衡5分钟。
11 ECL发光检测。