第五章聚合酶链式反应
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
聚合酶链式反应ppt课件
Extension 72˚C
Annealing
Tm-5˚C
PCR的基本过程
1.变性：将反应体系升温至95℃左右，样品中 双 链 DNA 解 开 成 两 条 单 链 ， 各 自 作 为 模 板 （待拷贝的 DNA 称为模板）。
2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55℃左 右)，5’端和3’端的引物各自与两条单链DNA 模板的互补区域结合。
(1944-)
1983 年提出PCR方法 1993年度诺贝尔化学奖
第一节 PCR技术的原理和特点
一、PCR基本原理
• PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生 物体内的DNA复制过程。
• 依据DNA半保留复制的机理。 • PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。
细胞内复制的过程
1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解 链成两条单链，各自作为模板。
RNA样品必须先经过逆转录 生成cDNA， cDNA作为PCR扩增 的模板。这个技术称为逆转录 PCR（RT-PCR）。
3. 常见的扩增对象(含核酸的标本)：
• 病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺 旋体、立克次体、支原体等。
• 病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、 羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养 细胞系。
（五） Mg2+
• Mg2+：为Taq 酶的必需激活剂。 浓度为0.5~2.5mmol/L。
太少：酶活性明显降低； 太多：导致非特异性扩增。
反应温度和时间
1. 变性： 95℃，30”~1’
双链DNA变成单链。
2. 退火：55℃，30”~1’
引物与模板互补结合。退火温度对特异性影响很大。
退火温度=Tm值-(5～10℃)
5. 模板量要合适，一般为102~105拷贝。
5 聚合酶链式反应
RT-PCR
反转录PCR（reverse transcription PCR） RNA反转录产物作为模板用于PCR。
用途： cDNA克隆； 半定量RT-PCR （Semi-Quantitative RT-PCR）
实时PCR（real time PCR） 利用荧光标记作为检测手段的定量PCR
多重PCR
引物
在一个反应体系中 使用一对以上引物 的 PCR 称 为 多 重 PCR 。 其 结 果 是 产 生 多 个 PCR 产 物 ， 用于检测特定基因 序列的存在或缺失。
电 泳
简并引物PCR
AA： Val-Asn-Phe
DNA：GTA AAT TTT T C G C C
GTN AAY TTY
5.2 PCR体系及优化
反应体系（25μL）：
10X缓冲液 2.5μL
程序：
94℃ 55℃ 72℃ 0.5min 0.5min 1－3min
28－35 cycles
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 10pmol/μL 50～500ng 0.5U 1.5mmol/L
生物的DNA体内合成
底物（ substrate ）： dATP ， dGTP，dCTP，dTTP； 聚合酶（polymerase）：依 赖DNA的DNA聚合酶 模板（template）：解开成 单链的DNA母链 引 物 （ primer ） ： 一 小 段 RNA； 其他的酶和蛋白质因子
5.1 基本原理
不同模板浓度曲线
Ct
各反应之间具有相同的反应动力学
数学模型
Tn＝T0(1＋E)n
Ct为循环数
K＝T0(1＋E)Ct
聚合酶链式反应
行扩增。
实时监测
03
在PCR过程中，可以通过实时荧光检测或凝胶电泳等方法监测
扩增产物。
后续处理阶段
产物分析
数据整理与报告
PCR结束后，对扩增产物进行分析，如凝胶 电泳、测序等，以确定扩增的特异性。
整理实验数据，编写实验报告，包括PCR产 物的大小、特异性、重复性等信息。
质量控制
防止污染措施
确保实验过程符合质量控制标准，如引物 特异性、模板纯度等。
1990年代
第三代PCR仪出现，采用半导体材料 进行温度控制，提高了反应速度和灵 敏度。
05
04
1985年
第二代PCR仪问世，实现了温度自动 控制，提高了扩增效率和特异性。
在科学研究中的应用
基础研究
PCR技术可用于基因克隆、基 因突变分析、DNA测序等基础
研究领域。
医学诊断
PCR技术广泛应用于遗传病、 传染病、肿瘤等疾病的诊断和 监测。
THANKS
感谢观看
转基因作物检测
利用PCR技术，可以对转基因作物进行检测，确保食品安全和生态 安全。
动物疫病检测
通过PCR技术，可以对动物疫病进行快速、准确的检测，预防和控 制动物疫病的传播。
动物品种鉴定
利用PCR技术，可以对动物品种进行鉴定，保护动物资源和生态平衡。
06
PCR技术的未来展望
新技术的开发与改进
下一代PCR技术
个性化医疗
根据基因检测结果，可以为患者 提供个性化的治疗方案，提高治 疗效果和生存率。
生物进化研究
物种鉴定和分类
利用PCR技术，可以对生物物种进行鉴定和 分类，研究物种的进化关系和系统发育。
生物多样性研究
聚合酶链反应及其应用课件
DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA链的物理损伤 PCR反应体系的洁净度
•聚合酶链反应及其应用
•7
DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响
DNA聚合酶的保真性主要取决于其3’→5’的核酸外切酶活性，它 负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNA聚合酶的 出错率在每轮延伸每核苷酸1.6 X 10–6 - 2.1 X 10–4范围内。DNA聚合 酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：
模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一般
而言，模板DNA长度小，PCR扩增产物的量就大，因此对于大分子 量的模板DNA（尤其是真核生物基因组DNA），在扩增之前最好先 用超声波处理或限制性酶消化。
•聚合酶链反应及其应用
•21
4 PCR的引物设计及合成
PCR引物的设计原则 引物的在线设计工具及免费软件简介 PCR引物的使用
Taq DNA酶在使用时应注意：
避免稀释保存Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性
•聚合酶链反应及其应用
•9
用于PCR的DNA聚合酶简介
KlenTaq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）
KlenTaq DNA聚合酶是一种N端缺失了的Taq DNA聚合酶，因而 没有5’的核酸外切酶活性；
•聚合酶链反应及其应用
•19
粗样品中的PCR抑制剂
粪便 胆盐、胆红素（抑制浓度50mg / mL） 血液 亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、heparin（抗凝剂） 植物 硫酸右旋糖苷 土壤 腐殖物质、含铁化合物 食品 未鉴定的抑制剂 痰液 未鉴定的抑制剂
•聚合酶链反应及其应用
•20
PCR模板的使用
第五章聚合酶链式反应
第五章聚合酶链反应及其相关技术PCR技术从Mullis最初建立到现在共约20多年时间，因为此技术具有高特异性、高敏感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，使PCR技术由最初的单一技术体系逐步发展成为一系列的技术综合。
PCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的（pg DNA）目的基因在较短的时间内（通常1-3h）扩增达到纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。
因此PCR技术目前已经成为人们获取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其杰出的贡献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速繁殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的三大主流技术。
在这三项技术中，PCR技术自1983年由美国Cetus公司Kary.Mullis提出并于两年后建立以来，得到了快速的发展，成为最常用的分子生物学技术之一。
这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片断扩增数百万倍，给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化。
由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。
目前，一系列的PCR方法被设计开发出来，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。
5.1 PCR技术原理聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。
它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。
聚合酶链式反应 实验报告
聚合酶链式反应实验报告《聚合酶链式反应实验报告》摘要：本实验旨在利用聚合酶链式反应（PCR）技术，对特定DNA片段进行扩增，以验证PCR技术在分子生物学研究中的应用。
实验结果表明，PCR技术能够快速、准确地扩增特定DNA片段，为分子生物学研究提供了重要的技术支持。
引言：PCR技术是一种能够在体外扩增特定DNA片段的技术，它的应用领域非常广泛，包括基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等。
PCR技术的核心是聚合酶链式反应，通过该反应可以在短时间内扩增目标DNA片段，为分子生物学研究提供了重要的技术手段。
材料与方法：1. 实验材料：PCR试剂盒、目标DNA模板、引物、Taq聚合酶等。
2. PCR反应条件：预变性步骤（95°C，5分钟），30个循环（95°C，30秒；55°C，30秒；72°C，1分钟），最终延伸步骤（72°C，10分钟）。
3. PCR产物分析：利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。
结果：经过PCR反应，我们成功地扩增出了目标DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，在PCR反应后，出现了明显的目标DNA条带，证明了PCR技术的有效性和准确性。
讨论：本实验结果表明，PCR技术能够快速、准确地扩增特定DNA片段，为分子生物学研究提供了重要的技术支持。
通过PCR技术，我们可以在短时间内获得大量目标DNA片段，为基因克隆、基因检测等研究提供了便利。
同时，PCR技术还可以用于DNA指纹分析、疾病诊断等领域，具有广阔的应用前景。
结论：本实验验证了PCR技术在分子生物学研究中的重要应用，为进一步深入研究基因克隆、基因检测等领域提供了重要的技术支持。
PCR技术的快速、准确和高效特点，使其成为分子生物学研究中不可或缺的技术手段。
希望通过本实验的结果，能够更好地推动PCR技术在生物学领域的应用和发展。
聚合酶链式反应(PCR)36页PPT
▪ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
36
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
聚合酶链式反应（PCR）
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
聚合酶链式反应
反应的控制
变性温度和时间 95℃，30s 退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 延伸温度和时间 72℃，1min/kb（10kb内） Tm值=4(G+C) +2(A+T) 循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有 效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性 逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
引物退火
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后 在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
Hale Waihona Puke 物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时 间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
PCR原理
PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚 合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性 解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合 酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂 贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不 需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临 床。
聚合酶链式反应名词解释生物化学
聚合酶链式反应名词解释生物化学
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术。
它利用DNA聚合酶在适当温度下的体外酶促反应，在较短时间内大量复制目标DNA片段，并使其扩增至可检测水平。
PCR包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤使DNA双链解开成两股单链，退火步骤使引物与目标DNA特异性结合，延伸步骤利用DNA聚合酶在合适温度下合成新DNA链。
这三个步骤连续循环进行，每一轮都会产生双倍数量的目标DNA。
PCR具有高度特异性、高灵敏性和高速度的特点，可以从少量的起始DNA样品中扩增出目标DNA片段，常用于分子生物学研究中的DNA定量、基因检测、基因测序、基因工程等多个领域。
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些，故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
(完整版)(整理)聚合酶链式反应
聚合酶链式反应定义1：用引物和DNA聚合酶进行体外扩增特定的DNA区域的一种技术。
应用学科：生态学（一级学科）；分子生态学（二级学科）定义2：体外酶促合成特异脱氧核糖核酸片段的技术。
应用学科：水产学（一级学科）；水产生物育种学（二级学科）定义3：通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA 特定序列的方法。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）定义4：由穆利斯(K. B. Mullis)于1988年首创的一种在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术。
应用学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布求助编辑百科名片概述DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenowfragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taq polymerase),则是于1976年从温泉中的细菌（嗜热菌）（Thermusaquaticus）分离出来的。
它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe提出。
他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。
而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。
此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第五章聚合酶链反应及其相关技术PCR技术从Mullis最初建立到现在共约20多年时间，因为此技术具有高特异性、高敏感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，使PCR技术由最初的单一技术体系逐步发展成为一系列的技术综合。
PCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的（pg DNA）目的基因在较短的时间内（通常1-3h）扩增达到纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。
因此PCR技术目前已经成为人们获取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其杰出的贡献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速繁殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的三大主流技术。
在这三项技术中，PCR技术自1983年由美国Cetus公司Kary.Mullis提出并于两年后建立以来，得到了快速的发展，成为最常用的分子生物学技术之一。
这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片断扩增数百万倍，给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化。
由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。
目前，一系列的PCR方法被设计开发出来，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。
5.1 PCR技术原理聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。
它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。
从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物（见图5-1）。
在PCR反应中，欲扩增的目的DNA片段由两条单链组成。
首先合成出与两条链两端互补的寡聚核苷酸引物(约含20个核苷酸)，然后将起始反应液中的模板DNA加热而变性解链。
在降低温度复性时，引物分别与A，B链两端的互补序列配对结合。
最后，在DNA聚合酶的催化下，以目的DNA片段为模板进行聚合反应。
第一轮反应结束后，目的DNA增加了一倍。
新合成的DNA片段本身又能作为下一轮反应的模板。
如此反复进行，DNA片段的数目可以呈2的指数增加。
由于在PCR操作过程中，需要反复加热解链，一般的DNA聚合酶容易变性失活。
后来从耐热菌中纯化得到一种TaqDNA聚合酶，能在较高的温度下(70～75℃)进行催化聚合。
这样就不需要在每次循环时加入新酶，而且可以获得质量更好的DNA片段，从而使PCR技术达到更成熟的阶段。
5.1.1聚合酶链式反应操作过程Mullis最初建立的PCR方法使用三种温度的水浴进行实验，并以大肠杆菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段催化复性引物的延伸。
由于该酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，所以每一轮反应都需添加新的酶，使得操作繁复且产量不高，而且对实验操作要求较高。
1988年Saiki等将从温泉中分离的一株嗜热杆菌（Thermus aquaticus）中提取到的耐热DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）引入了PCR技术。
由于该Taq酶能够耐高温，在DNA热变性时不会被钝化，所以整个反应只需添加一次酶即可，此酶的发现为如今通过PCR 仪实现DNA的自动化扩增奠定了坚实的基础。
PCR扩增靶DNA序列扩增操作过程一般包括3个步骤，即变性、退火、延伸。
⑴变性（denaturation）是将反应体系混合物加热94℃并维持一定时间，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板。
⑵退火（annealing）是将反应体系温度降低至特定的温度（寡核苷酸引物的融点温度Tm值左右或以下），使引物能与模板的互补区域结合，形成模板－引物复合物。
由于模板链分子较引物复杂得多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，DNA模板单链之间互补结合的机会很少。
另外，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短。
⑶延伸（elongation）是将反应体系的温度升至72℃并维持一定时间，使反应体系中已结合到模板DNA链上的引物在聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸（dNTP）作为底物，按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3'端，合成新的DNA链。
上述三个步骤作为PCR的一个循环，由于每个循环所产生的DNA片段作为下一个循环的模板，所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加一倍。
因此，反应产物量以指数形式增长，一个分子的模板经过n个循环可得到2n拷贝产物，如经过25次循环后，则可产生225个拷贝数的特异性DNA片断，即3.4×107倍待扩增的DNA片断。
但是，由于每次PCR的效率并非100％，并且扩增产物中还有部分PCR的中间产物，所以25次循环后的实际扩增倍数为1×106到3×106数。
另外从图中可以看出，PCR反应经过3个循环，扩增产物中就出现待扩增的特异性DNA片断。
5.1.2 参与PCR反应体系的成分及其作用参与PCR反应的成分主要包括：模板核酸、一对寡核苷酸引物、催化依赖模板的DNA 合成的耐热DNA聚合酶、缓冲液、Mg2+，4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR促进剂等。
现对它们的作用介绍如下：1、模板用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。
核酸模板来源广泛，可以从动植物细胞、培养的细胞、细菌、病毒、组织，病理样品，考古样品等中提取。
当用RNA 作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。
包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线粒体DNA等。
模板DNA都需要通过纯化以除去DNA聚合酶抑制剂（如SDS、氯仿、乙醇等）和其它杂质(如RNA)，以保证有较高的纯度。
DNA模板中过多的RNA污染会造成RNA与DNA的杂交或RNA与引物的杂交，导致特异性扩增效率的下降。
在用RNA作为扩增模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反图5-1 聚合酶链式反应示意图应。
除了上述的DNA 或RNA 可用作模板外，PCR 还可以直接以细胞为模板。
一般来说PCR 对模板纯度的要求不是很高，模板不需要达到超纯。
对于来源于组织细胞的模板DNA ，只要先溶细胞，经蛋白酶消化去除蛋白质，再用酚、氯仿抽提，经乙醇沉淀的模板即可应用。
某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA 溶液作模板。
但在DNA 溶液中，不能有影响扩增反应的物质存在，例如蛋白酶、核酸酶、结合DNA 的蛋白质等；另一类是尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；还有一类是二价金属离子的络合剂(如EDTA)等，会与Mg2+络合，影响TaqDNA 聚合酶的活性。
上述物质的存在会3` 5`3`5`含靶序列的DNA 模板5`5` 3`5`第一次退火引物1 引物25`3` 5`3`3` 第二次变性、退火5 （其它不同长度的链未标出）影响扩增效果，甚至使扩增失败。
一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。
有时加的模板太多，会令扩增失败。
这时如果对模板稀释后再加入反应体系中，往往能获得成功。
2、引物引物是与靶DNA的3'端和5'端特异性结合的寡核苷酸，是决定PCR扩增产物的特异性和长度的关键。
只有当每条引物都能特异地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。
一般情况下，设计的引物长度介于15～30个核苷酸之间，3'端必须带有游离的－OH基团，反应体系中各引物浓度一般介于0.1~0.5 μmol/L之间，过高或过低均不利于反应的正常进行。
引物设计是决定PCR反应成败的关键。
引物具有定位和定向作用：一对引物分别与一条单链模板结合，并且与靶序列3’端侧翼碱基互补，从而限定了引物只能结合在所识别的链上的靶序列3’端。
另外由于DAN聚合酶的5’一3’合成特点，引物的3’端得以延伸，两引物延伸方向相对并指靶序列的中央；决定片段大小：引物之间的距离决定了扩增靶序列的大小及特定范围。
PCR反应中，对引物也有一些特殊的要求，引物过短会影响PCR的特异性，要求有16～30bp。
，引物过长使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度，亦会影响产物的特异性。
)G+C 的含量一般为40％～60％。
引物的四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌呤或嘧啶存在。
尤其是引物3’不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。
引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
两引物之间不应互补，尤其是它们的3’端不应互补。
一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体。
引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。
引物3’端是引发延伸的点，因此不应错配。
由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3’端A影响最大，因此，尽量避免在引物3’端第一位碱基是A。
引物3’末端也不应是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异。
引物5’端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，启动子序列，蛋白质结合DNA 序列等。
引物浓度一般要求在0．1～0．5pmol之间。
浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。
引物Tm值最好在55～70℃范围。
简并引物实际上是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。
若PCR扩增引物的核苷酸组成顺序是根据氨基酸顺序推测而来，就需合成简并引物。
简并引物同样也可以用来检测一个已知的基因家族中的新成员，或是用来检测种间的同源基因。
使用简并引物的PCR反应，其最适条件往往是凭经验确定的，尤其是要注意所选定的变性温度，以避免引物与模板之间发生错配。
有的学者建议，使用热起始法(hotstart method)能够有效地克服错配现象。
热起始法要求将反应混合物先加热到72℃，然后才加入Taq DNA 聚合酶。
经过这样的处理，增加了PCR扩增产物的特异性，所得到的靶DNA片段在EB琼脂糖凝胶电泳中可以容易地观察到，而且背景中的非靶序列的条带全消失了。
为了尽可能减少非靶序列的扩增，最近已经发展出一种嵌套引物(nested primers)的策略。