葡聚糖凝胶层析

葡聚糖凝胶层析

一、实验目的

1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；

2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。

二、实验原理

凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。

对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排

阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水

体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的

筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。

分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出

柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小

分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这

些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶

层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

三、仪器、材料和试剂

1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。

2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。

四、实验步骤

1、装柱

将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。

2、上样

装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。

3、洗脱和收集

打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。

4、样品的检测

收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。

五、实验结果及分析

1、实验结果：

2、蛋白质样品洗脱曲线：

收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：

流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。