MACS磁珠分选

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医学-流式细胞术基本原理

Long pass
Short pass
Band pass
• 透射光路
FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统
• 全反射光路
PerCP-Cy5.5
PE SSC
FITC PE-Cy7
PE-TexasRed
FACS Aria流式细胞仪器信号检测系统
1.2.3 电子系统
• 光电检测器
将光信号转换成电子信号。
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
PMT
前向散射光光电二极管
（二）电信号两种放大方式
• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
线性(linear; lin)
对数(logarithmic; log)
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。
标记抗体的荧光素
激发光波长发射光波长
（nm）
（nm）
490
520
488
575
490
675
650
660
496/546
670
496/546767495519650
665
中文名
异硫氰酸荧光素藻红蛋白多甲藻叶绿素蛋白别藻青蛋白藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7

干货流式细胞分选的那些事儿

干货流式细胞分选的那些事儿作者：解螺旋.罗小黑转载请注明来源：解螺旋，医生科研助手将感兴趣的目的细胞分离纯化出来，一直是细胞生物学中的一个重要研究手段。

无论是体外刺激研究细胞因子的表达谱，还是细胞共培养检测细胞功能，均对细胞的纯度具有很高的要求。

目前分离纯化细胞的手段主要有两种：MACS（magnetic-activated cell sorting），原理就是用结合了磁珠的抗体去标记细胞，让目的细胞带上磁珠，通过磁场将结合了磁珠与没结合磁珠的细胞分离开来。

MACS是细胞分选的重要手段，设备简单，只需要一块磁铁，不需要专门的大型仪器，得到的细胞活性好，适合大多数的实验室。

缺点就是能分选的细胞类型有限。

FACS（fluorescence-activated cell sorting），也就是我们今天要了解的流式分选。

这部分原理与流式分析一致。

利用荧光素标记不同的分子，通过调节合适的电压、补偿等，通过荧光将目的细胞与非目的细胞区分开来。

MACS和FACS的优缺点：流式分选和流式分析在样本的准备上具有很多相通的地方，都是把样本处理成单细胞，最后上样的时候让细胞处于单个悬液的状态。

绝大部分人不需要进行仪器的操作，更关心的是如何提高细胞得率以及如果提高分选出来的细胞活性等问题。

首先是样本的准备，无论是组织还是血液来源的细胞，均应保证细胞在上样之前处于比较好的状态。

提示：o可以在重悬细胞的时候PBS中加入1%-2%的胎牛血清o大部分流式分选仪的上样器均没有冷却系统，要想分选后获得比较好的细胞活性，应尽量减少细胞在室温的暴露时间o样本较多的时候可以分成小份体积上样，每次1ml或者2ml，剩下的放在冰箱冷藏。

该方法长时间分选的时候能较好地提高分选出来的细胞活性，缺点就是人不能长时间离开，以防止样品跑空，空气进入分选管道。

其次，我们来聊一聊分选的模式，一般的流式分选仪上都有三种模式：纯化（purify）、富集（enrich）、单细胞（single cell）。

磁珠分选xiu

• 清除不需要旳细胞； • 缺乏针对目旳细胞旳特异性抗体（如肿瘤
细胞）； • 不需要抗体和目旳细胞结合，即细胞不被
激惹（如T细胞、B细胞、NK细胞功能分析）； • 复合分选旳一部分。
联合使用两种以上分选策略，主要用于细胞亚群旳分选或者得到高纯度非常稀有旳细胞。
合用范围：
（1）非目旳细胞也体现用来阳性选择旳抗原（2）分选非常稀有细胞，先清除非目旳细胞再行阳性分选，可取得高纯度旳稀有目旳细胞。
MACS分选策略
• 阳性分选 • 清除分选 • 复合分选
。
• 阳性分选中，目旳细胞被磁性标识后，作为阳性标识组分直接分选出来。阳性分选
策略优点：纯除分选是把非目旳细胞磁性标识后从细胞混合物中清除旳措施，即未磁性标识旳细胞为目旳细胞。
清除分选策略合用范围
素微珠、抗荧光素微珠 • 多选微珠:专门为分选细胞亚群而研制旳一种微珠。这种微珠经过特殊旳方式与抗体偶联，在第一次阳性分选完毕后，与细胞结合旳多选微珠能够被解离试剂剪切下来，阳性分选旳细胞能够进行再次阳性分选或者清除分选。
• MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠旳塑料容器，铁珠表面有亲水包被
2.上分离柱前,充分振荡,混悬细胞,打散细胞团块; •
3.用分离柱分选, 降低水中气泡,使分离柱不被气泡阻滞; 分选过程中不能干柱 •
其他磁分选产品
Dynal 大磁珠后续应用研究，如流式细胞术，则需要将 Dynabeads 与靶细胞分离。合用于高频细胞
stemcell
MACS 与FACS
• MACS相比FACS旳优点： 1，适合大批量旳细胞分选，FACS分选速度相对而言要慢诸多； 2，稳定性高，反复性强，而FACS因为机器运营时间长会造成参数漂移故而实际获取得靶细胞阳性率会大大下降； 3，不必大型设备，普遍适合大多数试验室旳细胞分选工作； 4，操作简朴，不必专门旳设备操作人员（FACS操作需要一定旳经验）。 FACS相比MACS旳优点： 1，少许细胞分选时比MACS精确得多，速度也快； 2，能够多种marker分选、正选负选同步进行（例如 CD117+/CD90lo/Sca-1+/CD45-），而MACS一般只能进行阳选或阴选， marker往往同步只能做一种（或一类）； 3，抗体能够用荧光直接标旳，也可用间标旳（最佳是厂家标明能够用于FACS），选择余地大，但是MACS旳抗体往往需要和磁珠配套，选择余地小。

MACS如何选择合适的分选器

如何选择合适的分选器？美天旎MACS技术已经成为磁性细胞分选的金标准，其文献引用量一直远超同类其他产品。

MACS磁珠分选所用到的主要组份有：MACS磁珠、MACS分选柱和MACS分选器。

如果您是第一次使用美天旎磁珠，则可以选择合适的起始套装，这样既能满足您的分选要求，又节省成本。

美天旎提供以下套装产品供您选择，针对您的实验，选择最适合您的分选器套装产品。

手动分选产品产品一：MiniMACS Starting Kit （送磁珠）130-090-312 MiniMACS Starting Kit对应使用分选柱：MS适合分选策略：阳性分选最大上样量：2X108最大目的细胞吸附量：107一次上样数量：1个产品二：MidiMACS Starting Kit （送磁珠）130-042-301 MidiMACS Starting Kit（LS）对应使用分选柱：LS适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大上样量：2X109最大目的细胞吸附量：108一次上样数量：1个130-090-329 MidiMACS Starting Kit（LS）对应使用分选柱：LD适合分选策略：阴性分选最大上样量：2X109最大目的细胞吸附量：108一次上样数量：1个产品三：Mini & MidiMACS Starting Kit（送磁珠）130-042-501 Mini & MidiMACS Starting Kit（MS LS）对应使用分选柱：MS LS适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大上样量：2X108+2X109最大目的细胞吸附量：107+108一次上样数量：2个Mini & MidiMACS Starting KitMACS MultiStand 分选架MidiMACS Separation Unit 分选器130-042-501 Mini & MidiMACS Starting Kit （MS LD）对应使用分选柱：MS LD适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大上样量：2X108+2X109最大目的细胞吸附量：107+108一次上样数量：2个产品四：OctoMACS Starting Kit （送磁珠）130-042-108 OctoMACS Starting Kit对应使用分选柱：MS适合分选策略：阳性分选最大上样量：8X2X108最大目的细胞吸附量：8X107一次上样数量：8个产品五：QuadroMACS Starting Kit （送磁珠）130-091-051 QuadroMACS Starting Kit （LS）对应使用分选柱：LS适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大上样量：4X2X109最大目的细胞吸附量：4X108一次上样数量：4个130-092-857 QuadroMACS Starting Kit（LD）对应使用分选柱：LD适合分选策略：阴选最大上样量：4X2X109最大目的细胞吸附量：4X108一次上样数量：4个产品六：VarioMACS Separator（手动细胞分选）130-090-282 VarioMACS Separator（手动细胞分选）对应使用分选柱：MS, LS, LD and CS适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大上样量：4X10E9最大目的细胞吸附量：2X10E8一次上样数量：1个半自动分选产品130-095-346 MultiMACS Cell24 Separator（半自动分选器）对应使用分选柱：LS LD适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大细胞上样量：24X2X10E9最大一次上样量：24个全自动分选产品autoMACS Starting Kit（全自动分选器）对应使用分选柱：自动分选柱（可重复使用）适合分选策略：阳性分选和阴性分选最大细胞上样量：4x10e9最大目的细胞吸附量：2x10e8最大一次上样量：6个。

德国美天妮磁珠分选

MD0043.02
MACS® 细胞分选策略
• 阳性分选
• 去除分选 • 去除分选后再阳性分选
• 多重分选
MD0044.02
MACS细胞分选策略
1、阳性分选：
• 根据特异性标志分选细胞: 阳性分选是指目的细胞磁性标记
后，作为阳性的标记组分直接分选出来。
• 优点：
》高纯度，尤其是富集稀有的细胞》高回收率》操作简便、迅速
MD0044.02
识别DC和DC亚群 New
DC 亚群特异性标志: Blood Dendritic Cell Antigens
Lineage- (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) HLA-DR+ CD11c+ CD123low/-
BDCA-2/4+ BDCA-1+ BDCA-3+
MD0044.02
MACS® 技术分选与分析功能性T细胞
T细胞分选
T细胞亚群
T细胞功能亚群
抗原特异性 T细胞
Th细胞（ CD4） Tc细胞（ CD8）调节性 T细胞 (CD4+CD25+) TCRr/d 细胞 (TCRr/d微珠 ) NK/T细胞 (CD56多选微珠＋ CD3微珠 )
NaiveT细胞 (CD45RO阴选 ) 活化 T细胞（ CD69、 CD25、 CD30）效应 T细胞（ CD27）记忆 T细胞（ CD45RA阴选、 CD45RO阳选） Th2细胞 (anti-CRTH2)
IFN-r IL-2 IL-4 IL-10 TNF-a
MD0044.02
MACS® 细胞因子分泌细胞分析与分选 New
Catch Reagent

MACS(磁珠分选)介绍-优宁维

技术一：MACS磁珠分选介绍MACS技术为德国美天旎生物技术有限公司（Miltenyi Biotec GmbH）的专利产品，是一种集合了免疫学、细胞生物学、磁力学等知识于一体的高度特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。

MACS技术已成为细胞分选的标准方法，从实验室到临床，从小规模到大规模，从常见细胞到稀有细胞和复杂的细胞亚群，从人类和小鼠细胞到其它种系的细胞，MACS技术提供了一种可在每一个实验室进行高品质细胞分选的方法。

MACS技术主要组成成分为MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。

MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。

MACS分选柱置于一个永久性磁场—MACS分选器中，可以将磁力增强1000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的细胞。

用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。

分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。

所有的操作在2.5－30分钟内即可完成，得到的细胞可立即用于后继实验。

德国美天旎公司是一个以细胞分选技术为主、拥有多样化产品的生物技术公司。

开发研制并销售世界上最先进的细胞分选、细胞生物学、相关分子生物学产品和技术，尤其在干细胞分选、DC细胞分选与分析、细胞因子分泌细胞分选与分析、免疫治疗、再生医学方面占有极大的优势，CD133、BDCA-2（CD303）、BDCA-4（CD304）单抗为其专利产品。

MACS技术优点1、稳定、高质量的分选使用MACS技术，可获得高纯度（90-99%）、高回收率的分选细胞群。

2、对细胞无损伤50nm微珠和MACS分选柱均无毒性，对细胞无损伤，可以纯化有活力和功能活性的细胞而不影响其活性。

3、操作简便、快速MACS技术操作简单，消毒方便。

磁珠孵育时间很短，仅需15分钟。

手动分选可在30分钟内完成，autoMACS分选可在2.5-10分钟之内完成。

4、从实验室到临床MACS技术可以实现从105到1011个细胞分选。

德国美天妮磁珠分选

MACS技术技术
设备与试剂
• MACS分选器
autoMACS分选仪分选仪
• 9种程序，一机完成所有细胞分选种程序，种程序 • 成本低，两个可重复使用的分选成本低，周内100次柱（2周内次）周内 • 快速（3－10分钟）快速（－分钟分钟） •重复性好重复性好 • 全自动分选，仪器操作简单全自动分选， • 适用范围广：从少量标本（105）适用范围广：从少量标本（到大量标本（），进样量到大量标本（4X109），进样量 0.5ml-50ml • 8种全血微珠，可以做常见细胞的种全血微珠，种全血微珠全血分选，全血分选，省去了费时的提取单个核细胞过程
• 去除分选是磁性标记非目的细胞，并将其从细胞混合物中去去除分选是磁性标记非目的细胞，
除，即未磁性标记的细胞为目的细胞。即未磁性标记的细胞为目的细胞。
• 去除分选策略适用范围：去除分选策略适用范围：
》去除不需要的细胞缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）》缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）》不需要抗体和目的细胞结合》需进一步通过阳性选择分选细胞亚群
MD0347.01
MACS® 磁性分选
MACS微珠进行微珠进行磁性标记
洗脱阳性分选的细胞
未标记的细胞先行流出
MD0651.01
分选前标本制备：分选前标本制备：过滤
.02
MACS 技术
设备与试剂
» MACS微珠微珠 » MACS分选柱 MACS分选柱 » MACS 分选器 » 详细分选方案详细分选方案*
MD0197.02
MACS技术技术
设备与试剂
• MACS微珠：微珠：微珠
MACS 微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，可用于目的细胞的磁性标记。磁化微粒，可用于目的细胞的磁性标记。

磁珠分选与流式分选该如何选择？

磁珠分选与流式分选该如何选择？目前常见的分选方法有两种，一种是流式分选，一种是磁珠分选，两种方案各有优势，下面我们分别来了解一下。

1、什么是MACS 磁性分选？答：首先使用磁珠偶联的抗体去标记细胞，然后把标记好的细胞过分选柱（分选柱周围会有磁铁），带磁珠的细胞就留在柱子上，不带磁珠的细胞就流走了，从而实现分选，需要搭配分选器。

2、什么是FCS流式分选？答：流式分选一般都是电荷式分选，即对感兴趣的目标细胞所在的液滴充上电荷，液滴经过电极板，通过电场作用发生偏转，从而实现分选，需要搭配流式分选仪。

3、MACS磁性分选的优势？（1）对细胞的刺激。

磁珠分选最大的优势就是对细胞的刺激要小一点。

因为流式分选细胞首先要经过几十微米的喷嘴，然后要被充电，还要经过几千伏的电场，最后以几十米每秒的速度落到收集管里面，有些原代细胞就受不了，分选免疫细胞也要考虑细胞活化的影响；而磁珠分选相对来说就对细胞没什么刺激。

（2）设备要求。

磁珠分选小的实验室就能做，买一些专用的磁铁和柱子就可以了，而流式分选就需要分选型的流式细胞仪，都是几百万以上的。

对操作员的要求来说，流式分选也要高一点，需要专门培训，需要注意的细节也要多很多。

如果你周围有什么流式平台的话，磁珠分选和流式分选的成本应该是差不多的，流式分选一次大约1-2千（各地方不同），磁珠分选的柱子磁珠差不多也要烧这么多钱。

（3）试剂不同。

这个最好理解，流式分选用的是荧光素偶联的抗体，磁珠分选用的是磁珠结合的抗体。

4、FACS流式分选的优势？（4）多参数分选。

流式细胞术很大的优势就是多参数，比如我可以分选CD4+CD25+CD127low的Treg，三色的一次就能分选。

磁珠分选就必须先分CD4，再分CD25，更多参数的就没法进行。

（5）低表达群细胞分选。

比如有些干细胞它的表达比例只有百分之零点几，比例太少磁珠分选无法操作，流式就可以把这些细胞富集起来。

（6）胞内荧光分选。

流式分选在分子生物学中很大一部分应用就是分选GFP、YFP等阳性细胞，还有可以用Hoechst染精子的单倍体进行分选，这些针对胞内成分的分选也是磁珠分选无法实现的。

MACS磁珠分选

MACS磁珠分选阳性分选和去除分选。

复合分选策略是将两种基本分选策略相结合或者联合使用多选微珠，从而实现细胞亚群的分选。

1、阳性分选策略（Positive selection strategy）阳性分选中，目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。

分选后的细胞不必去除MACS微珠，可立即用于培养或者后续操作。

该方法可以将磁性标记的靶细胞富集10000倍。

阳性分选策略优点：纯度高，回收率高，操作迅速、简便。

2、去除分选策略（Depletion strategy）去除分选是把非目的细胞磁性标记后从细胞混合物中去除的方法，即未磁性标记的细胞为目的细胞。

MACS分选柱技术加上强磁性标记可以去除高达4个对数级的细胞。

去除分选策略适用范围：去除不需要的细胞；缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）；不需要抗体和目的细胞结合，即细胞不被激惹（如T细胞、B细胞、NK细胞功能分析）；复合分选的一部分。

3、复合分选策略联合使用两种以上分选策略，主要用于细胞亚群的分选或者得到高纯度非常稀有的细胞。

（1）去除后再阳性分选（Depletion followed by positive selection）细胞亚群的分选，可以先磁性标记非目的细胞，去除分选后对阴性组分再行磁性标记和阳性分选。

适用范围：在细胞悬液中，非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原，就需要先去除这群非目的细胞；如果要分选非常稀有细胞，先从细胞悬液中去除非目的细胞，在富集细胞的基础上，进行阳性分选，可获得高纯度目的细胞。

（2）多重分选策略（MultiSort Strategy）MACS多重分选是一种根据多种表面标志磁性分选细胞的技术。

多重分选中，首先用MACS多选微珠标记目的细胞，进行第一参数阳性分选。

然后细胞与多选解离试剂共同孵育，后者可以将微珠从抗体上酶性解离下来。

接着使用针对另一细胞表面标志的抗体－微珠复合物磁性标记阳性分选细胞。

二次标记的细胞可以再次进行阳性分选或者去除分选。

MACS技术介绍

高功率，水冷
需要调整 488nm、 633nm、 407nm 模拟否 7
数据处理模式脱机补偿最多检测FL
分选速度
300/sec
no
70000/sec
10000/sec
MACS分选与 FACS分选比较 MACS优势1
• 快速》FACS分选时间: 》MACS® 分选时间: （FACS Aria） (autoMACS™ 分选仪) 每秒钟获取70 000 细胞平均每秒钟处理107 细胞 108 cells => 2 3 min 108 cells => 5 min 109 cells => 4 h 109 cells => 5 min （没有包括操作人员调节（无需调节机器）机器时间） • 操作简单、无需专人操作，可随时使用 • 分选后细胞活性好 • 无菌分选：仪器小巧，可以进操净台，耐受紫外线照射，消毒方便，耗材为无菌性包装
• 在没有直接标记微珠可选时
• 使用自备抗体或配体的磁性分选中
• 分选或去除用多个抗体混合物标记的多种细胞
• 分选稀有细胞和抗原弱表达的细胞
• 分选标记蛋白质
MACS分选柱
填充有磁性铁珠，有亲水包被，对细胞柔和。
在分选器中产生高梯度磁场，滞留带有微珠磁性标记的细胞
MACS分选柱
• 能进行完全的清洗 • 单独无菌包装，便于无菌条件使用 • 可用于分选多种细胞及亚细胞物质、细菌、病毒、mRNA 和蛋白质
美天旎中国
• 2001年设立中国代表处，目前美天旎中国总部位于上海，在北京、广州设有办事处。 • 美天旎中国目前有近15名员工，分属销售与产品推广部，市场与技术服务部，客服与物流部。 • 美天旎中国合作伙伴总进口商:中仪英斯泰克进出口公司代理商：上海强智生物技术有限公司上海优宁维生物科技有限公司北京利文商贸有限公司

磁珠分选产品

美天旎公司MACS(磁珠分选)相关产品一、MACS微珠（MicroBeads）MACS微珠是一种与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞或者去除细胞的磁性标记。

微珠直径约有50nm，比细胞小200多倍，体积为细胞的百万分之一，光学显微镜下不可见。

微珠由多聚糖和氧化铁组成，无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解。

MACS微珠与流式细胞仪兼容，不会影响细胞的光散射特性；磁性标记只占用20－30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。

此外，MACS微珠可以最大限度地避免细胞活化；无需解离磁珠，可以直接进行后续实验：如流式细胞仪分析或分选、细胞培养、分子生物学研究、回输给人或者动物。

MACS微珠主要有三种：直标微珠、间标微珠、多选微珠。

其中间标微珠有抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠。

多选微珠是专门为分选细胞亚群而研制的一种微珠。

这种微珠通过特殊的方式与抗体偶联，在第一次阳性分选完成后，与细胞结合的多选微珠可以被解离试剂剪切下来，阳性分选的细胞可以进行再次阳性分选或者去除分选。

MACS技术分选的CD8阳性T细胞（箭头所示为磁性结合在细胞表面的微珠）二、MACS分选柱（Separation Column）MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被，因此不会损伤细胞。

在磁场外MACS分选柱不带有磁性，但是当置于一个永久性磁场—MACS分选器中时，分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍，足以滞留仅标记有极少量微珠的目的细胞；磁性标记细胞从分选柱中通过时可以受到均匀的磁力作用，从而提高分选纯度和回收率。

手动操作在30分钟内可完成，自动分选仅需2.5-10分钟，得到的细胞可立即用于后续实验。

此外，大多数MACS分选柱都是无菌包装，一次性使用，可以满足细胞培养所需的无菌条件。

三、MACS分选器（MACS Separators）MACS分选器由永久性磁铁和支架构成。

CD138磁珠分选SOP

骨髓CD138MACS操作步骤1.抽取2-5mL骨髓，骨髓转移至锥形管（50mL）中，管内含等体积的细胞培养基（HEPES缓冲液调配）2.滤膜过滤细胞悬液（孔径大小100μm），去除骨碎片或细胞团块。

滤膜使用前须用分选缓冲液（autoMACS running buffer）打湿。

3.20℃，445g离心10min。

4.弃上清，勿激起细胞沉淀，加入分选缓冲液稀释沉淀至初始体积。

5.进行磁珠标记实验，加磁珠。

每1mL抗凝全血或骨髓加50μL 全血CD138微磁珠。

6.混匀，置于冰箱（2-8 ℃）孵育，15min。

7.洗涤细胞。

每1mL抗凝全血或骨髓加入2-5mL分选缓冲液，室温445g离心10min。

8.弃上清，勿激起细胞沉淀，保留一定的上清，避免细胞丢失。

分选缓冲液稀释悬液至1mL。

9.全血分选柱（Whole Blood Column）预处理：从柱顶端加入3mL分选缓冲液，使缓冲液完全流过分选住，去除流出物。

10.将细胞悬液转移到预处理后的分选柱上，收集流出的未标记细胞。

11.再用3×3mL分选缓冲液清洗，收集未标记的细胞片段，与上步收集的流出物混合。

12.卸下全血分选柱，置于收集管上。

13.加入5mL洗脱缓冲液（全血分选柱），向下推挤柱塞，同时收集洗脱流出物。

此流出物即为磁珠标记细胞。

注意：1.本实验选用直接磁珠标记法，实验操作尽量快速、保证细胞的低温环境、使用预冷溶液。

高温、时间太久导致非特异性细胞被标记，影响实验效果。

2.本实验选用全血分选柱（Whole Blood Column）进行磁珠分选。

3.为了增加磁珠标记成分的纯度，可将洗脱成分通过MS/LS分选柱，重新富集。

08-MACS磁性分选细胞

MACS磁性分选细胞BDCA-4分离操作规则●分离PBMC1.采集新鲜抗凝血，抗凝剂可用肝素或枸橼酸等；2.用2-4倍体积的PBS（含有2mM EDTA）稀释血液；3.淋巴细胞分离液（密度1.077，20℃）15ml上铺35ml的稀释血；4.20℃，400g离心20-30分钟；5.吸取上层液体到干净管中，此层中含有稀释的自体血清，可用作缓冲液补充剂；6.仔细的把中间层转移到新的离心管中。

7.用含有2mM EDTA的PBS充满离心管，20℃，200g离心10分钟。

仔细倒掉上清；8.重复第7步；9.把细胞重悬于缓冲液中。

（每108细胞用300μl缓冲液，低于108细胞也用300μl缓冲液）注：1.缓冲液=PBS+0.5%BSA+2mM EDTA+自体血清；2.外周血保存不得超过8小时；3.悬于缓冲液中的细胞可过夜保存。

●磁标记PBMC1.将分离好的PBMC用过滤器或尼龙膜去除凝块；2.将细胞重悬于缓冲液中，每108细胞用300μl缓冲液；3.每108细胞加入100μl FcR阻断剂；4.每108细胞加入100μl 抗BDCA-4 微粒；5.充分混合，4-8℃孵育15分钟；（注：温度升高和孵育时间延长都将导致非特异性标记，冰上操作需要增加孵育时间）6.加入10-20倍体积的缓冲液洗涤细胞（每108细胞加入5-10ml）, 300g离心10分钟，并完全去除上清；7.把细胞悬于缓冲液中（每108细胞加入500μ l缓冲液）；8.根据需要选择合适的MACS柱和MACS分离器。

●通过MACS柱进行磁分离（LS分离柱）1.把分离柱放置在MACS分离器的磁场中；2.用3 ml缓冲液淋洗柱子以便平衡柱子基质；3.柱口处放一个合适的管子。

所需细胞滞留在柱子基质上，收集流下的含有阴性细胞的液体；注：用过滤器或尼龙膜提前去除凝块4.用3 ml缓冲液冲洗柱子3次，并用同一个管子在柱口收集；5.把柱子从分离器拿开，并放置在另外一个合适的管子上。

macrophage(CD11b beads)巨噬细胞磁珠分选说明

Index1. Description1.1 Principle of MACS® separation1.2 Background and product applications1.3 Reagent and instrument requirements2. Protocol2.1 Sample preparation2.2 Magnetic labeling of human PBMCs2.3 Magnetic labeling of mouse cells2.4 Magnetic separation3. Example of a separation using CD11b MicroBeads4. References1. DescriptionComponents 2 mL CD11b MicroBeads, mouse/human:MicroBeads conjugated to monoclonal rat anti-mouse/human CD11b (Mac-1α) antibodies(isotype: rat IgG2b; clone: M1/70.15.11.5). Size For 1×109 human total cells, up to 100separations;for 2×109 mouse total cells, up to 200separations.Product format CD11b MicroBeads are supplied as a suspensioncontaining stabilizer and 0.05% sodium azide. Storage Store protected from light at 4−8 °C. Do not freeze.The expiration date is indicated on the vial label.1.1 Principle of MACS® separationFirst the CD11b+ cells are magnetically labeled with CD11b MicroBeads. Then the cell suspension is loaded onto a MACS® Column which is placed in the magnetic field of a MACS Separator. The magnetically labeled CD11b+ cells are retained on the column. The unlabeled cells run through and this cell fraction is depleted of CD11b+ cells. After removal of the column from the magnetic field, the magnetically retained CD11b+ cells can be eluted as the positively selected cell fraction.1.2 Background and product applicationsCD11b MicroBeads are developed for separation of human and mouse cells based on expression of the CD11b antigen. In humans, CD11b is strongly expressed on myeloid cells, and weakly expressed on NK cells and some activated lymphocytes. In mouse, the CD11b antigen is expressed on monocytes/macrophages, and to a lower extent on granulocytes, NK cells, CD5+ B1 cells and a subset of dendritic cells.The CD11b (Mac-1 α; integrin αM chain) antibody reacts with the 170 kDa αM subunit of CD11b/CD18 heterodimer (Mac-1, αMß2 intergrin). It functions as a receptor for complement (C3bi), fibrinogen or clotting factor X. Examples of applications●Positive selection or depletion of human monocytes/macrophagesand granulocytes from peripheral blood or lymphoid tissue.●Positive selection or depletion of myeloid cells from human andmouse bone marrow.●Positive selection or depletion of mouse macrophages fromlymphoid tissue.1.3 Reagent and instrument requirements●Buffer (degassed): Prepare a solution containing PBS (phosphatebuffered saline) pH 7.2, 0.5% BSA (bovine serum albumin) and2 mM EDTA by diluting MACS BSA Stock Solution (# 130-091-376) in autoMACS™ Rinsing Solution (# 130-091-222). Keep buffer cold (4−8 °C).▲ Note: EDTA can be replaced by other supplements such as anticoagulant citrate dextrose formula-A (ACD-A) or citrate phosphate dextrose (CPD). BSA can be replaced by other proteins such as gelatine, mouse/human serum or fetal calf serum.Buffers or media containing Ca2+ or Mg2+ are not recommended for use.● MACS Columns and MACS Separators: Monocytes andmacrophages can be enriched (positive selection) or depleted by using MS, LS or XS Columns. For efficient depletion of myeloid cells from bone marrow, and depletion of granulocytes and NK cells we recommend using LD, CS or D Columns. Positive selection or depletion can also be performed by using the autoMACS Separator.▲Note: Column adapters are required to insert certain columns into VarioMACS™Separator or SuperMACS™ Separator. For details, see MACS Separator data sheets.●(Optional) Fluorochrome-conjugated CD11b antibody forflow-cytometric analysis, e.g. CD11b-FITC (# 130-081-201), CD11b-PE (# 130-091-240) or CD11b-APC (# 130-091-241). CD11b MicroBeads mouse/humanOrder No. 130-049-601Magnetic cell sorting140-000-059.05● (Optional) PI (propidium iodide) or 7-AAD for flow-cytometricexclusion of dead cells.● (Optional) Pre-Separation Filters (# 130-041-407) to remove cellclumps.2. Protocol2.1 Sample preparationSample preparation of human PBMCsWhen working with anticoagulated peripheral blood or buffy coat, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) should be isolated by density gradient centrifugation (see "General Protocols" in the User Manuals or visit /protocols).▲Note: Remove platelets after density gradient separation: resuspend cell pellet in buffer and centrifuge at 200×g for 10−15 minutes at 20 °C. Carefully remove supernatant. Repeat washing step and carefully remove supernatant. Sample preparation of mouse tissueWhen working with tissues, prepare a single-cell suspension by a standard preparation method (see "General Protocols" in the User Manuals or visit /protocols).▲Note: Dead cells may bind non-specifically to MACS MicroBeads. In case of high numbers of dead cells, removal of dead cells by density gradient centrifugation or the Dead Cell Removal Kit (# 130-090-101) is recommended.2.2 Magnetic labeling of human PBMCs▲ Work fast, keep cells cold, and use pre-cooled solutions. This will prevent capping of antibodies on the cell surface and non-specific cell labeling.▲ Volumes for magnetic labeling given below are for up to 107 total cells. When working with fewer than 107 cells, use the same volumes as indicated. When working with higher cell numbers, scale up all reagent volumes and total volumes accordingly (e.g. for 2×107 total cells, use twice the volume of all indicated reagent volumes and total volumes).▲ For optimal performance it is important to obtain a single- cell suspension before magnetic separation. Pass cells through 30 µm nylon mesh (Pre-Separation Filters # 130-041-407) to remove cell clumps which may clog the column.1. Determine cell number.2. Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Pipette offsupernatant completely.3. Resuspend cell pellet in 80 µL of buffer per 107 total cells.4. Add 20 µL of CD11b MicroBeads per 107 total cells.5. Mix well and incubate for 15 minutes at 4−8 °C.▲ Note: Working on ice may require increased incubation times. Higher temperatures and/or longer incubation times lead to non-specific cell labeling.6. (Optional) Add a fluorochrome conjugated antibody, e.g.add 10 µL of CD11b-FITC (# 130-081-201), and incubate for5 minutes at 4−8 °C.7. Wash cells by adding 1−2 mL of buffer per 107 cells and centrifugeat 300×g for 10 minutes. Pipette off supernatant completely.8. Resuspend up to 108 cells in 500 µL of buffer.▲ Note:For higher cell numbers, scale up buffer volume accordingly.▲ Note: For depletion with LD Columns, resuspend up to 1.25×108 cells in 500 µL of buffer.9. Proceed to magnetic separation (2.3).2.3 Magnetic labeling of mouse cells▲ Work fast, keep cells cold, and use pre-cooled solutions. This will prevent capping of antibodies on the cell surface and non-specific cell labeling.▲ Volumes for magnetic labeling given below are for up to 107 total cells. When working with fewer than 107 cells, use the same volumes as indicated. When working with higher cell numbers, scale up all reagent volumes and total volumes accordingly (e.g. for 2×107 total cells, use twice the volume of all indicated reagent volumes and total volumes).▲ For optimal performance it is important to obtain a single- cell suspension before magnetic separation. Pass cells through 30 µm nylon mesh (Pre-Separation Filters # 130-041-407) to remove cell clumps which may clog the column.1. Determine cell number.2. Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Pipette offsupernatant completely.3. Resuspend cell pellet in 90 µL of buffer per 107 total cells.4. Add 10 µL of CD11b MicroBeads per 107 total cells.5. Mix well and incubate for 15 minutes at 4−8 °C.▲ Note: Working on ice may require increased incubation times. Higher temperatures and/or longer incubation times lead to non-specific cell labeling.6. (Optional) Add a fluorochrome conjugated antibody, e.g. add10 µL of CD11b-FITC (# 130-081-201), and incubate for 5minutes at 4−8 °C.7. Wash cells by adding 1−2 mL of buffer per 107 cells and centrifugeat 300×g for 10 minutes. Pipette off supernatant completely.8. Resuspend up to 108 cells in 500 µL of buffer.▲ Note:For higher cell numbers, scale up buffer volume accordingly.▲ Note: For depletion with LD Columns, resuspend up to 1.25×108 cells in 500 µL of buffer.9.Proceed to magnetic separation (2.3).2.4 Magnetic separation▲Choose an appropriate MACS Column and MACS Separator according to the number of total cells and the number of CD11b+ cells (see table in section 1.3).Magnetic separation with MS or LS Columns1. Place column in the magnetic field of a suitable MACS Separator(see "Column data sheets").2. Prepare column by rinsing with appropriate amount of buffer:MS: 500 µL LS: 3 mL.140-000-059.053. Apply cell suspension onto the column.4. Collect unlabeled cells which pass through andwash column with appropriate amount of buffer.Perform washing steps by adding buffer three times,each time once the column reservoir is empty.MS: 3×500 µL LS: 3×3 mL.Collect total effluent. This is the unlabeled cell fraction.5. Remove column from the separator and place it on a suitablecollection tube.6. Pipette appropriate amount of buffer onto the column. Immediately flush out fraction with the magnetically labeled cells by firmly applying the plunger supplied with the column.MS: 1 mL LS: 5 mL.▲ Note: To increase the purity of the magnetically labeled fraction, it can be passedover a new, freshly prepared column.Magnetic separation with XS ColumnsFor instructions on the column assembly and the separation, refer to the "XS Column data sheet". Depletion with LD Columns 1.Place LD Column in the magnetic field of a suitable MACS Separator (see "LD Column data sheet").2. Prepare column by rinsing with 2 mL of buffer.3. Apply cell suspension onto the column .4. Collect unlabeled cells which pass through and wash columnwith 2×1 mL of buffer. Collect total effluent. This is the unlabeled cell fraction.Depletion with CS Columns 1.Assemble CS Column and place it in the magnetic field of a suitable MACS Separator (see "CS Column data sheet").2. Prepare column by filling and rinsing with 60 mL of buffer. Attach a 22G flow resistor to the 3-way-stopcock of theassembled column (see "CS Column data sheet").3. Apply cell suspension onto the column.4. Collect unlabeled cells which pass through and wash columnwith 30 mL buffer from the top. Collect total effluent. This is the unlabeled cell fraction.Depletion with D ColumnsFor instructions on column assembly and separation, refer to the "D Column data sheet".Magnetic separation with the autoMACS™ Separator▲ Refer to the "autoMACS™ User Manual" for instructions on how to use the autoMACS Separator.1.Prepare and prime autoMACS Separator.2. Place tube containing the magnetically labeled cells in theautoMACS Separator. For a standard separation, choose following separation programs: Positive selection: "Possel"Depletion: "Depletes"▲ Note: Program choice depends on the isolation strategy, the strength of magnetic labeling and the frequency of magnetically labeled cells. For details see autoMACS User Manual: "autoMACS Cell Separation Programs".3. When using the program "Possel", collect positive fraction(outlet port "pos1"). This is the purified CD11b + cell fraction.When using the program "Depletes", collect unlabeled fraction (outlet port "neg1"). This is the CD11b - cell fraction.3. Example of a separation using CD11b MicroBeadsA: Separation of human PBMCsSeparation of human PBMCs using CD11b MicroBeads. Cells arestained with CD11b-FITC (# 130-081-201). Monocytes can be identified as CD11b bright cells and NK cells as CD11b dim cells.B: Separation of CD11b + cells from a mouse spleen cellsuspensionPositive selection of CD11b + cells from a mouse spleen cell suspensionusing CD11b MicroBeads, an MS Column and a MidiMACS™ Separator.R e l a t i v e c e l l n u m b e rNegative fractionPBMCs before separation Positive fractionCD11b-FITCSpleen cells before separation140-000-059.05Forward scatterC D 11b -P EForward scatterC D 11b -P EForward scatterC D 11b -P ESpleen cells after depletion ofCD11b + cellsIsolated CD11b + cells4. References1. Ehlich, A; Martin, VM; Müller, W; Rajewsky, K (1994) Analysis of the B CellProgenitor Compartment at the Level of Single Cells. Current Biology 4: 573-583.[33]WarningsReagents contain sodium azide. Under acidic conditions sodium azide yields hydrazoicacid, which is extremely toxic. Azide compounds should be diluted with running waterbefore discarding. These precautions are recommended to avoid deposits in plumbingwhere explosive conditions may develop.WarrantyThe products sold hereunder are warranted only to be free from defects in workmanshipand material at the time of delivery to the customer. MILTENYI BIOTEC GmbH makesno warranty or representation, either expressed or implied, with respect to the fitnessof a product for a particular purpose. There are no warranties, expressed or implied,which extend beyond the technical specifications of the products. MILTENYI BIOTECGmbH’s liability is limited to either replacement of the products or refund of thepurchase price. MILTENYI BIOTEC GmbH is not liable for any property damage,personal injury or economic loss caused by the product.MACS® is a registered trademark of Miltenyi Biotec GmbH.140-000-059.05。

CliniMACS临床

单核细胞来源的 DCs
CD14+ 单核细胞分选
富集前
23 %
富集后
99 %
CD15-PE
CD15-PE
DC的种类
• 单核细胞来源的DCs - MoDC (CD14)
PBMCs中的频度5－10％
• 髓血细胞来源的DCs – mDC1(BDCA-1)
PBMCs中的频度0.29％(0.09-0.42%)
CABG + TMLR + CD133+ 干细胞
手术干细胞操作流程
干细胞处理 Operating room I 外科手术 Operating room II
决定CD133+ 细胞灌注
骨髓采集Biblioteka 0 min胸阔切开术
收集、洗涤
孵育、洗涤 CliniMACS® 分选
60 min
移植物收集
ECC
90 min 心肌再灌注
CliniMACS 构造
• 2. 无菌管道系统: 一次性使用滴流管避免气体激活液体感受器预选柱机械性过滤非特异性的细胞分选柱
CliniMACS管道系统
• CliniMACS TS: 60 x 109 （5min/ml) • CliniMACS LS TS: 120 x 109 （10min/ml) • DTS:120 x 109(标记40 x 109)
造血系统恶性肿瘤（自体、异体移植）自身免疫性疾病实体瘤遗传、代谢性疾病
CliniMACS CD133试剂
• • • • 阳性分选CD133＋干细胞一支试剂最多标记6 x 108 CD133+细胞应用： 1.造血系统方面：
自体、异体干细胞移植（同CD34）

免疫磁珠方法分选细胞

免疫磁珠方法分选细胞2007-12-17内容快照：用免疫磁珠做细胞分选(MACS)是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。

原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。

磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱/试管上，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离。

本节介绍超微磁珠间接标记、用分离柱阳性分选细胞的方法。

Protocal：1.离心收集待分离细胞，用少量PBE孵育液(0.5％BSA、0.08％EDTA PH7.2 PBS，真空抽滤除菌及液体内气体)充分混悬细胞(0.5ml/1×108细胞)，加入一抗(10~20μg/ml终浓度)，4° C孵育30分钟。

2.用20倍体积PBE洗细胞一次，再加P BE(0.3ml/1×108细胞)充分混悬细胞后，加入相应二抗包被的超微磁珠，混匀后置8~15° C孵育10~15分钟。

3.将分离柱安装入磁场中，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱。

4.将孵育完的细胞悬液加到分离柱中，自然流尽。

5.以0.5ml的PBE加到分离柱中，自然流尽，洗柱两次。

6.从磁场中取下分离柱，插在试管口，加1-2ml的PBE，用针芯推尽液体，冲出阳性结合的细胞，用培养基洗一次，待用。

注：1.如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。

2.超微磁珠及微小磁场系统适合于少量细胞分离(如106-107)，通常已适用于大多数实验研究；此外各公司尚有大磁珠及大磁场供应，可用于更大量细胞的分选；除分离柱外，也有试管及其它设备用于分选；根据我们应用的经验，分离柱由于提供了较大的接触面，在细胞分选上具有较多优点。

磁场也可以自制，用一般的磁铁即可做成简易磁场，可提供足够的磁力。

3.磁珠分离系统分离的细胞纯度可以达到80~99％，得率在60~90％左右，仅次或相当于流式细胞仪（FACS）的分选效率，与FACS 相比，MACS设备简单，耗时极短，故而应用广泛。