酶联免疫反应

环 境 因 素


通风、采光与防尘。 控制温度及湿度, 环境温度与湿度随地理位 置不同可有很大差异应使用系统空调进行控 温, 并要求控制空气湿度为40%～70%之间 消除噪音与电磁干扰。 稳定水电, 实验过程中应采用蒸馏水(纯水) 或经软化处理的自来水。
六、ELISA应用
ELISA在饲料安全检测中的应用
二、非标记免疫分析： 免疫沉淀实验、免疫浊 度分析技术
一、酶免疫分析：是利用酶的高效催化和放大 作用与特异性免疫反应结合而建立的一种标 记免疫技术。 原理： 用酶标记的抗原（或抗体）用于免疫反 应，并以相应的底物被酶分解的显色反应对 样品中的抗体（或抗原）进行定位的分析和 鉴定。
根据是否需要分离结合与游离的酶标记物可 分为可分为非均相(或异相)酶免疫测定和均 相酶免疫测定两种方法 。 均相酶免疫分析法（homogeneous enzyme immunoassay，HEI）是在检测过程中抗原 抗体反应后，无需分离结合和游离酶标记物， 直接根据反应前后酶活性的改变进行待测物 质的测定的分析方法。 均相酶免疫分析主要有酶扩大免疫测定技术 和克隆酶供体免疫测定两种方法。
酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
双抗体夹心法
竞争法
间接法
ELISA基本实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附 到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶 结合物，使之与固相抗原或抗体发生免 疫反应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的 底物，使发生酶促反应而显色
ELISA既可以测定抗原，也可以测定抗体。 根据测定对象不同，可采用不同的模式，主 要有双抗夹心法、间接法和竞争法等。
一、ELISA简介
二、ELISA原理 三、ELISA分类 四、ELISA相关试剂 五、ELISA影响因素
六、ELISA应用
一、ELISA简介
•1971年瑞典学者 Engvall和Perlmann，荷兰学 者Van Weeman和Schuurs分别报道将免疫技术 发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方 法，称为酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）。 •自上世纪70年代初问世以来， ELISA发展十 分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学 的许多领域。
二、ELISA原理
•ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体 的酶标记。 •结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学 活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性， 又保留酶的活性。 •在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与 固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记 的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。 此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的 比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有 色产物，产物的量与标本中受检物质的 量直接相关，故可根据呈色的深浅进行 定性或定量分析。
均相酶免测定的对象为小分子抗原或半 抗原，主要用于药物测定。可以直接用 于全自动生化分析仪测定。
非均相酶免疫分析法（heterogeneous enzyme immunoassay） 常用的酶免疫分析 法多为非均相法，又可分为液相酶免疫法和 固相酶免疫法两种，以后者最常用，称为酶 联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA是 临床上最常用的免疫分析方法。需经过结合 的标记物和游离的标记物的分离才能测定. 分离的方法主要通过固相载体吸附后清洗未 结合的游离标记物。
酶联免疫反应
概述
免疫分析：是以抗原抗体相互结合的免疫反应 为基础，研究免疫学技术及其在医学领域中 的应用。
免疫分析的分类 根据分析过程中是否需要标记物可分为两类 一、标记免疫分析：根据标记物的种类可分为 1、酶免疫分析 2、放射免疫分析 3、发光免疫分析 4、荧光免疫分析 5、金（银）免疫标记分析
酶的底物
1、HRP 的底物 HRP 催化过氧化物的氧化反应，常用的供氢体有邻苯 二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS 。 TMB 经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。 TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，无致癌性等优点。 酶反应用HCl或H2SO4 终止后，TMB 产物由蓝色呈黄 色，可在比色计中定量， 2、 AP 的底物 AP 为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯（p‐NPP） 作为底物。 产物为黄色的对硝基酚，用NaOH终止酶反应后，黄色 可稳定一时间。 NBT/BCIP，紫色反应，水冲洗终止反应。
实验原理或操作方法 钩状效应（HOOK效应）及交叉反应 现象 颜色终止条件

ELISA实验终止剂选用引起的持续发展的颜色加深 影响了阴性和弱阳性样品及定量检测样品的结果, 特别在大批样品需较长时间进行读数时, 这种潜在 的颜色逐渐加深现象成为结果影响的重要因素。

ELISA的洗板过程
洗液冲力过大会造成酶结合物丢失, 本底偏浅, 吸光 度值偏低, 且洗板后残留液规定一般不超过2ul。
②酶标记的抗原或 抗体（标记物）
③酶作用的底物（显色剂）
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）
加样本
振荡、洗板
入酶标记得抗原
酶 标 记 物
轻链 螯合剂
辣根 过氧 化物 酶
V
重链
振荡、洗板
加入底物显色液
三、ELISA分类
免疫标记技术
放射物标记技术 酶标技术 免疫荧光技术 其他标记技术
酶联免疫吸附技术
ELISA在疾病诊断中的作用
ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒 ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用 检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2 ）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体
ELISA法检测幽门螺杆菌抗体
固相抗原或抗体
1、固相载体的性状 固相载体在ELISA 测定过程中作为吸附剂和容器，不 参与化学反应。 ELISA 载体的形状主要有：膜（NC膜、PVDF膜、尼 龙膜）、微量滴定板（96孔板）、小珠和小试管，以 微量滴定板（96孔板）最为常用。 良好的ELISA 用96孔板应该是吸附性能好，空白值低， 孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。 2、包被用抗原 用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗 原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 3、包被条件
酶标记的抗原或抗体（结合物）
1、酶 用于ELISA 的酶应符合以下要求： （1）纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质 稳定，来源丰富，价格不贵； （2）制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催 化能力； （3）在受检标本中不存在相同的酶； （4）相应底物易于制备和保存，价格低廉； （5）有色产物易于测定，光吸收高。 常用的酶为辣根过氧化物（horseradish peroxidase， HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosohatase，AP）。

实验中对照的设置
阳性对照 阴性对照 空白对照 临界标准品
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ELISA试剂
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附 剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中）， 参考标准品和控制血清（定量测定中）； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
五、ELISA影响因素
试剂因素 标本因素 实验原理或操作方法 环境因素

试 剂 因 素 抗原抗体的纯度 标准品定值的准确性 抗体的亲和力、滴度和特异性 标记物的比活性或免疫活性
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标 本 因 素



内源性物质常见的有: 类风湿因子（RF）、嗜异性抗 体（Id）、补体、人抗动物抗体（HAAA）、药物及 其导致的代谢产物和交叉反应物质等。 外源性物质主要为：标本溶血、标本细菌污染、标本 储存时间过长、标本凝集不全和采血管中含有添加剂 等。 自身免疫产品：胆红素浓度小于0.05mg/mL的黄疸， 血红蛋白浓度小于5.0mg/mL的溶血和甘油三酯浓度 小于25.0mg/mL的脂血对检测结果没有影响。
饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏 菌 ）
ELISA用于农药残留的检测
甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析
农药的检测
主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 河豚毒素 苯并芘