39. 保护氨基酸检验指导书

保护氨基酸检验指导书发放号：

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1. 检验流程

1.1 成品置于待测区

1.2 检验员取样

1.3 成品检测(外观、纯度、质谱、旋光、熔点、澄清度等)

1.4 备注：

A. 产品粉碎并包装置于待测区后，取样检测出的数据写入检验报告。

B. 研发部提供的生产过程中的图谱 (MS、HPLC) ，可做参考，有权进行复查。

2 检验项目

2.1 外观：目测法（须为白色或类白色粉末或结晶性类白色粉末）

2.2 光学纯度的测定

2.2.1 仪器和试剂

液相色谱仪、输液泵、检测器、色谱柱、记录装置、进样阀、微量注射器、超声波发生器、蒸馏水、乙晴、三氟乙酸

2.2.2 分析步骤

A. 称取一定量的样品溶于10ml容量瓶中，直至完全溶解，然后将其过滤。

B. 用微量注射器吸取一定量试样溶液进入色谱系统，利用梯度洗脱使样品达到分离。

C. 各组分经过紫外检测器，通过色谱工作站记录各组分的紫外吸收、并转换为电信号。

D. 在线色谱工作站记录各组分的各项参数，如保留时间、峰高、峰面积，通过面积归一法计算出各组分的百分含量。

2.2.3 注意事项

A. 氨基酸样品分析必须打空白，谱图中不允许出现未积分的小杂峰，若是空白中有的，必须以基线相减的方式处理掉；如果处理不掉，必须进行复测。

B. 基线尽量保持一条直线。

C. 谱图中不允许出现负峰。

2.2.4 要求及规定

A. 氨基酸样品分析必须打空白，谱图中不允许出现未积分的小杂峰，若是空白中有的，必须以基线相减的方式处理掉；如果处理不掉，必须进行复测。

B. 基线尽量保持一条直线。

C. 谱图中不允许出现负峰。

D. 尽量安排同一产品的测试使用同一分析条件，这样可加强可比性。

E. 比较数据的重复性时，安排统一产品测试的时间不要间隔很久。

F . 若单项杂质在1%±0.05%，复测确定数据的重复性。

G. 若同一批次产品分包装送样检测，混合样数据应在各分包装测试数据的范围内。例如：分包装测试的数据分别为：98.5%、98.6%、98.7%，若混合样数据不在98.5%-98.7%范围内，则复测确定数据的重复性。

2.3 旋光的测定

2.3.1 仪器和试剂

旋光仪、25ml容量瓶、电子天平、DMF、NaOH、AcOH、EtOAc、MeOH、EtOH、HCl、CHCl3等。

2.3.2 分析步骤

A. 称取一定量样品，用相应溶剂溶于25ml容量瓶中至完全溶解。

B. 旋光仪开机预热20分钟。

C. 旋光仪校零，用溶剂清洗旋光测定管3-5次，装入溶剂，置于旋光仪箱内。

D. 校零,取出旋光管，记录空白值。

E. 用配好的溶液润洗旋光管3-5次，再加入溶液。

F. 再次置于旋光仪同一位置上，读数，取平均值。

2.3.3 注意事项

A. 溶液或溶剂加入旋光管内读数时，管内不能有气泡。

B. 测同种样品时旋光管应放置在同一位置上。

2.3.4测量示值误差：±（0.01°+测量值×0.05%）

2.4 熔点的测定

2.4.1仪器和试剂：数字熔点仪、玻璃毛细管

2.4.2 分析步骤

A. 用玻璃毛细管取样，（颗粒状固体稍加研磨后装管）自由落体法敲击样品，使之填装结实，样品高度一般为3mm。

B. 调预制温度（低于样品熔点10度），稳定到达时，把填装好的样置入仪器，按“升温”键。

C. 测试结束，屏幕自动显示初熔值和终熔值。

d. 一次填装多根毛细管，分别测定，废弃最大值和最小值后取平均值。

2.4.3 注意事项

A. 同一批号样品取样高度应一致，以确保测量结果的一致性。

B. 设定起始温度切勿超过仪器使用范围（<300℃）。

C. 线性升温速率不同，测定结果也不一致。一般速率越大，读数值越高。

D. 测定较高熔点样品后再测较低熔点样品。

2.4.4 测量示值误差

A. 小于200度范围内，±0.5℃。

B. 200℃～300℃范围内，±0.8℃。

2.5 水份的测定

2.5.1 仪器和试剂：KF-1B水份测定仪、卡尔费休试剂、烧杯、微量进样器、无水甲醇、蒸馏水

2.5.2 分析步骤

A. 在贮液瓶中倒入适量卡尔费休试剂。

B. 加入无水乙醇（分析纯）于反应瓶中，至淹没电极裸露端。

C. 开启电源，调节搅拌器转速，仪器进入滴定状态。

D. 滴定结束后用微量进样器取蒸馏水10ul进行标定卡尔费休试剂，并输入所消耗的试剂量。（卡氏试剂标定做2次平行样后取平均值）

E. 把称好的样品滴定并输入所消耗的试剂量和样品重量。

F. 读取“百分含量”试剂。

2.5.3 注意事项

A. 卡尔费休试剂具有腐蚀性，操作时应在通风的环境中进行。

B. 废液应做有害物质处理。

C. 测定酮类或醛类样品时，需要专用试剂。

D. 定期保养仪器

2.6 澄清度的测定

2.6.1 仪器和试剂

试管、量筒、溶剂（一般为N,N-二甲基甲酰胺）、电子天平、称量纸、小勺

2.6.2 分析步骤

A. 称取0.3克样品，置于试管中。

B. 用量筒移取2ml溶剂加入试管中。

C. 摇均使之充分溶解，静置观察是否澄清，无黑点，无絮状物。

2.6.3 注意事项

A. 样品溶解时，不能进行加热及其他外力加速其溶解。

B. 试管壁应洗干净，以免混淆视觉。

C. 澄清是指能使光线能很好通过。

2.6.4 要求及规定

A. 溶液透明能透光。

B. 不要用强酸和强碱测试。不能借助加热以及超声波。

C. 尽量首选DMF试做澄清度。

D. 在澄清度测试的溶液中（一般为2ml）发现少于等于6颗小杂点（包括：小黑点、小黄点、类似滤毛的毛状物）可以判定为合格产品。如果重复3次测试，情况都在上述范围内，产品判定为合格产品。并在检验报告备注栏中写明实际的测试情况。

2.7 分子量的测定

2.7.1 仪器和试剂：LC-20AD泵、DGU-20A3在线真空脱气机、CTO-10Avp柱温箱、甲醇（分析醇）、乙

晴(色谱纯)、蒸馏水、DMF等

2.7.2 分析步骤

A. 先把样品溶解，须离心分层，取上层清液，稀释。

B. 打开色谱工作站，进入操作界面后，打开CDL，BLOCK加热块进行预热，待温度到达设定的温度，然后打开氮气，高电压。

C. 编辑序列表，设定LC部分的参数及MS部分的参数，选择使用Tuning文件里的Esi文件或Apci文件，若样品为合成的保护氨基酸，还需选择扫描Positive或Negative

D. LC部分的参数设定好之后即可激活仪器，激活后待LC和MS处于进样等待状态，点击Strt键后即可进样。

E. 若样品需作LC-MS，则需改变管路，接上色谱柱，平衡后手动进样进入色谱系统。

F. 处理MS图谱时，选择TIC图谱中的某一点，观察该点分子量是否与样品理论分子量一致，若不一致，则选取另外的点观察。点选择之后，应对TIC图谱中的分子离子峰积分，再减去空白溶剂中的杂质。

G. 图谱积分好后，进入Report，编辑报告，报告中的PDA谱与MS图尽量做到简洁，尽可能的减少图谱中的杂质峰。

H. 关机。先关闭LC部分。关闭时，先关周边设施，然后系统控制器，最后关电脑。

2.7.3 注意事项

A. 每天做样后，须用异丙醇清洗Probe及相关部件。

B. Rotary Pump的换油周期是3000Hr。

C. 重新启动真空时，至少24Hr之后再进行分析。

D. 室内温度保持在18～28℃，湿度在40～70。

E. LC用水必须新鲜。

F. 自动进样器的清洗液原则上和流动相一致。

2.8 对应异构体光学纯度的测定

2.8.1 仪器和试剂：10ml容量瓶、超声波、色谱柱：ChirobioticT、ChirobioticR和Daicel IC、微量进样器、