实验二 离子交换树脂柱层析分离混合氨基酸

实验二离子交换树脂柱层析分离混合氨基酸

【实验目的】

掌握层析装置的正确使用方法，学会装柱、洗脱、收集等离子交换柱层析技术。了解阳离子交换树脂工作原理。

【实验原理】

离子交换树脂是合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的极性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂按所带的活性基团分强酸、弱酸、强碱和弱碱。

离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。但对于生物大分子物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。故如分离生物大分子可选用以糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。

本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH或离子强度可分别洗脱分离。

【实验材料】

1．实验器材

层析柱（1.5×20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管（20根/组）及试管架；紫外可见分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(苯乙烯磺酸钠型树脂) ，玻璃漏斗、玻棒、水浴锅或（电炉+铝锅+温度计）等。

2．实验试剂

(1)2mol／L HCl 1000 mL

(2)2mol／L NaOH 1000 mL

(3)0.1 mol／L HCl 1000 mL

(4) 0.1 mol／L NaOH 1000 mL

(5)pH4.2的柠檬酸缓冲液：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml 4000mL

(6)pH5的醋酸缓冲液：0.2mol／L NaAc 70ml加0.2mol／L HAc 30ml 100 mL

(7)0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮3000ml

(8) 氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸（均为2mg/ml）各10m1加0.1mol／L HCl 3ml 【实验方法】

1. 树脂的预处理

100ml烧杯中置约20g树脂，新鲜树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。倾倒去除悬浮物。加25ml 2mo1／L HCl至上述树脂中搅拌1h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。加25ml 2mol／L NaOH搅拌1h，倾弃酸液，用蒸馏水充洗涤树脂至中性。最后用pH4.2柠檬酸钠缓冲液浸泡，备用。

2. 装柱

取一根1.5×20cm层析柱，并固定好。放好废液瓶，在层析柱内加入pH4.2柠檬酸缓冲液,至柱体积1/3时，打开开关，赶走接口处及胶管内气泡，关闭开关。用玻棒将树脂充分混匀，缓缓加入层析柱。柱内应无气泡、分层及断裂现象。当树脂沉积离层析柱口约3～5cm 处时，在树脂上端放置一薄层棉花层，并控制流速10～15滴／min。

3、平衡

用pH4.2柠檬酸缓冲液平衡10min，控制流速10～15滴／min。使流出液pH为4.2为

止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。

4. 加样、洗脱及洗脱液收集

打开旋塞使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。用长滴管将25滴氨基酸混合液仔细直接加到树脂顶部（从树脂中间加入），打开出口使其缓慢流入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol／L HCl（用滴管加为好），以10～15滴／min的流速洗脱，收集洗脱液，每管3ml，逐管收存。当收集5根试管后，关闭旋塞，并同时检测（见下面），直到第一个氨基酸被洗脱下来。当HCl液面刚平树脂表面时，用1m1 pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10～15滴／min并注意勿使树脂表面干燥。

在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加1.5ml中性茚三酮溶液，1.5ml pH5醋酸缓冲液，沸水浴中煮10min，如溶液呈紫红色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。直到第二个氨基酸被洗脱下来。

于树脂顶部加入0.1mo1／L NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面继续用0.1mo1／L NaOH洗脱并逐管收集(注意仍然保持流速10～15滴／min)，每管3ml。做洗脱液中氨基酸检验，直到第三个氨基酸被洗脱下来。

最后以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以-，±，+，++．．．表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。

【注意事项】

1. 在树脂的处理过程中，酸碱处理时，树脂必须洗净残留的酸，碱。如用酸处理时，不洗

净就会产生白色沉淀，影响实验结果。

2. 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。

3. 加样的样品直接加在树脂的表面上, 不能沾到管壁上，否则洗脱峰之间的界线不清，而且

拖尾长。

4. 一直保持流速10～15滴／min，并注意勿使树脂表面干燥。

【思考题】

1. 为什么混合氨基酸从磺酸阳离子交换树脂上逐个洗脱下来? 洗脱的顺序是什么？

2. 树脂如何保存?

3. 多糖基离子交换树脂适合于什么物质的分离？