大肠杆菌基因工程PPT课件

色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏
Ptr
Otrp
蛋白复合物的阻遏，转录呈基底除去色氨p
或加3-吲哚丙
状态。在培养系统中去除色氨酸酸
烯酸 （IAA）
或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），
高效转
便可有效地解除阻遏抑制作用。
录
在正常的细菌培养体系中，除去
Ptr
Otrp
色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目
P 乳糖 异丙基-b-D硫代半乳糖苷 （IPTG）
P
基底水平转 录阻遏蛋
白
O
诱 导
高效转 录 O
启动子的可控
启动子
性 乳糖启动子Plac的可控性： cAMP
野生型的Plac上游附近拥
有代谢激活因子（CAP） 结区合，cAMP激活CAP，
C结A合P启动子控制区，进 而进促Plac介导的转录。葡萄 糖代谢使cAMP减少，也
筛选
筛选Apr、Tcs的转化子
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于 转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译 起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA 分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达 数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构 序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即 Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核 糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点， 但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
测
目的基
E A
因
E
启动 子
目的基
E因
E
A 酶切 开
Bal31酶 解
启动子的筛选
启动子
采用鸟枪法战略，将合适大小的
D克N隆A到片启段动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、 g粒a上lT报与告质基因galk的表达产物联合 作可用将，培养基中的半乳糖酵解成红色
素物转质化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌
大肠杆菌基因工程
大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特 征
大肠杆菌表达外源基因的优
全基因组测序，势共有4405个开放型阅读
框基因架克隆表达系统成熟 完繁殖善迅速、培养简单、操作方便、遗传 稳被定美国FDA批准为安全的基因工程受体 生物
大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
培养罐中迅速升温非常困难，因Ptr 此常使用一个双质粒控制系统，p
用色氨酸间接控制目的基因表达
阻遏作
用 cI857
PL
A
色氨
酸
PL
A
目的基 因 B
表 达 B
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过 终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
大肠杆菌表达外源基因的劣 势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工 系内源统性蛋白酶降解空间构象不正确的异源 蛋细胞白周质内含有种类繁多的内毒素
大肠杆菌基因工程
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的 原理
启动 子 终止 子 核糖体结合位点 密码 子 质粒拷贝数
启动子
启动子最佳距离的探
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本 身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基 因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能， 甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基 因编码产物的翻译效率
基因的表达
p
Ptr
Otrp
高效转 录
启动子的可控
启动子
性 l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬遏菌，体很启难动直子接P诱L导受控CI制阻。遏在蛋基白因阻Ptr 工程中常使用温度敏感型的cI突p 变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋 在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
CA
P Pla
葡萄糖代 c
谢
能遏阻Plac介导的转录。因此，
Plac
基因工程中使用的乳糖
高效转 录
O cAMP浓度 降低 基底水平转
录 O
高效转
启子动均为抗葡萄糖代谢阻 遏突的变型，即Plac UV5
录 Plac UV5 O
启动子
启动子的可控 性 色氨酸启动子Ptrp的可控性：
阻遏蛋 白
Biblioteka Baidu
色氨 酸
基底水平转 录
终止子
强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终止子是
来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及
Tcr
T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较
弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子Ap串 pCP
r
联的特殊结构，以增强其转录终止作用
1
终止子也可以象启动子那样，通过特殊的
ori
探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆
受体菌株 含有外源启动子活性的重
组克隆
Ap
r
pKO
1
ori
终止密码
子 gal
K
启动子的构
启动子
建
启动子
-35 区序
PlL
T 列T G A C
Prec
AT T G A T
APtra
AT A G A C
PA trp
TA T G A C
Plac
AT T T A C
Ptac
AT T G A C
Ptac = 3 PtrpA= 11 Plac
-10 区序
G 列A T A C
TT A T A A TT A A T G TT T A A C TT A T A A TT A T A A
T
启动子的可控
启动子
性 乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区 O偶la联c 在一起，在没有诱 导存物在时，整个操纵子处 于底基水平表达；诱导物可 以启使动子Plac介导的转录大 幅提高