大肠杆菌基因工程PPT课件
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基因工程ppt课件
提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与: cDNA合成法
+ 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补 的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
+ 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解， 使之变成单链的的基因主要是指___编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因_
请举出三个以上的例子
供体生物细胞
2、获人工化学合成
限制酶
取出 DNA 用限制酶剪 去与模板互补的DNA双链） 重复循环
16
实际具体过程
17
PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料
模板DNA；DNA引物；四种脱氧 核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）
• 方式：以_指__数__方式扩增，
PCR扩增仪
即_2_n__（n为扩增循环的次数）
18
1、概念：
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
1
2. 基因工程最基本的工具 ──限制性内切酶
以大肠杆菌中的一种叫做EcoRІ的限制酶为例：
限制酶
结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细
27
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
一定大小的DNA片段
将DNA片段与: cDNA合成法
+ 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补 的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
+ 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解， 使之变成单链的的基因主要是指___编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因_
请举出三个以上的例子
供体生物细胞
2、获人工化学合成
限制酶
取出 DNA 用限制酶剪 去与模板互补的DNA双链） 重复循环
16
实际具体过程
17
PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料
模板DNA；DNA引物；四种脱氧 核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）
• 方式：以_指__数__方式扩增，
PCR扩增仪
即_2_n__（n为扩增循环的次数）
18
1、概念：
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
1
2. 基因工程最基本的工具 ──限制性内切酶
以大肠杆菌中的一种叫做EcoRІ的限制酶为例：
限制酶
结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细
27
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
基因工程-32大肠杆菌克隆载体课件
这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。
第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。
而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把 菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种 抗生素培养基平板。
一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322
当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选 择pBR327。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•12
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体•13来自pUC8—乳糖选择质粒
pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，
只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一
的限制性酶切位点。
到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl， 它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。
M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶
切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一 个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成
GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变
是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆 载体。
用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨 苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ
等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会 导致四环素抗性基因失活。
这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的 DNA片段的导入。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•6
第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数
EcoRI的黏性末端。 多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位
点上，形成了一个更加复杂的载体，即 M13mp7。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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第三章大肠杆菌基因工程-1
Plac -lacI 调控模式的问题与策略
问题1： 葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏， 不便于发酵培养基设计 对策： 采用突变型Plac UV5（不受葡萄糖阻遏）
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活蛋白（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 Plac O cAMP 高效转录
目的基因
cI857 PL B
吲哚丙烯酸，IAA）。
T7启动子 ——来自T7噬菌体的异源启动子
T7启动子——最成功的启动子
*只有T7 RNA 聚合酶才能识别 T7 启动子 * T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合
酶的快 5 倍
*由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要将外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌。 *通过调控T7 RNA 聚合酶 的表达间接调控外源基因的表达 *以 Novagen 公司的 pET 系统为杰出代表。
P
O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控 lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 高效转录 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O 基底水平转录 阻遏蛋白
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
启动子的筛选
采用鸟枪法策略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 宿主细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Apr pKO1 galK
粒上报告基因galk的表达产物联合作用，
基因工程05幻灯片
⒉ 表达形式
直接转录并翻译出目的基因ORF对应的氨基酸序列，即 表达出完整的目的蛋白。
目的基因以融合蛋白的形式进行表达。
pKK223-3
终止子： 5SrRNA 区域（rrnB 操纵子区域），rrnBT 和 rrnBT2 终止子（ 防止通读）。
受 lac 阻抑物调控， 1-5mM IPTG 诱导。 可直接表达任何含 RBS 和 ATG 的基因，若无 RBS，其
当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序 列组成的融合蛋白。?
GST是来源于血吸虫的小分子酶（26kDa），在E.coli易
表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有 很强的结合能力。利用这些性质可用来分离纯化表达的 目的蛋白。
图5-4 GST融合表达载体pGEX图谱
分离纯化表达的目的蛋白
几丁质结合域
多克隆位点 克隆、表达
几丁质
内含肽1 目的蛋白 过柱、洗涤
pH7，室温，自然水解
洗脱 目的蛋白
产物纯化
在pTWIN1中，当外源目的基因插入多克隆位点并带有自 身的翻译终止密码子时，可表达出目的蛋白N末端带有 CBD和intein1的融合蛋白（图5-6）。
表达该融合蛋白的细胞抽提物流过几丁质树脂层析柱时， 融合蛋白就被吸附在树脂上，通过洗涤可将其他蛋白去 除。
启动子；噬菌体的PL启动子。(注意：表示方法）
⑵ 终止子
转录会受到模板RNA序列结构的影响，当遇到颈环 结构时转录便会停止，或遇到ρ因子介导的终止信 号转录也会停止。
⑶ 核糖体结合位点
转录出来的mRNA可在宿主细胞的翻译机器作用下翻 译出目的蛋白。
细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效的核糖体结 合位点以及其中的Shine-Dalgarno序列（SD序列）， 从而启动邻近其下游的翻译起始密码子的蛋白质翻 译。
第十四章：大肠杆菌基因工程
①启动子本身的序列，尤其是-10区 和-35区的碱基组成及彼此间的距 离
②启动子与外源基因转录起始位点 之间的距离
2.启动子最佳作用距离的探测
其中目的基因表达量最高的克隆即具有最 佳的启动子作用距离。
若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNA，有 必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。
3.启动子的筛选 ①鸟枪法克隆 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA 片段克隆到启动子探针质粒pKO1上， 受 体 细 胞 染 色 体 DNA 上 的 galE 、 galT 与质粒报告基因galK的表达产物联合 作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解 成红色素物质。
②色氨酸启动子Ptrp的可控性
Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏， 转录呈基底状态，在培养系统中去除色 氨酸或加入3-吲哚丙烯酸（IAA）可有 效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨 酸很难，基因工程通过添加IAA诱导Ptrp 介导的目的基因的表达。
③λ噬菌体启动子PλL的可控性
PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因 工 程 中 常 使 用 温 度 敏 感 型 的 cI 突 变 基 因
活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然
处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温
度进行诱导表达。
二．终止子
外源基因在强启动子的控制下表达， 易发生转录过头现象，即RNA聚合酶 滑过终止子结构继续转录质粒上邻 近的DNA序列，形成长短不一的mRNA 混合物。
1.过长转录物的产生在很大程度上会 影响外源基因的表达，原因如下：
③滤膜结合法分离
原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测 DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温 和漂洗薄膜，除去未结合RNA聚合酶的双链DNA片段，然后 再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下。一般来说， 这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性 （即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通 常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。
②启动子与外源基因转录起始位点 之间的距离
2.启动子最佳作用距离的探测
其中目的基因表达量最高的克隆即具有最 佳的启动子作用距离。
若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNA，有 必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。
3.启动子的筛选 ①鸟枪法克隆 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA 片段克隆到启动子探针质粒pKO1上， 受 体 细 胞 染 色 体 DNA 上 的 galE 、 galT 与质粒报告基因galK的表达产物联合 作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解 成红色素物质。
②色氨酸启动子Ptrp的可控性
Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏， 转录呈基底状态，在培养系统中去除色 氨酸或加入3-吲哚丙烯酸（IAA）可有 效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨 酸很难，基因工程通过添加IAA诱导Ptrp 介导的目的基因的表达。
③λ噬菌体启动子PλL的可控性
PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因 工 程 中 常 使 用 温 度 敏 感 型 的 cI 突 变 基 因
活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然
处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温
度进行诱导表达。
二．终止子
外源基因在强启动子的控制下表达， 易发生转录过头现象，即RNA聚合酶 滑过终止子结构继续转录质粒上邻 近的DNA序列，形成长短不一的mRNA 混合物。
1.过长转录物的产生在很大程度上会 影响外源基因的表达，原因如下：
③滤膜结合法分离
原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测 DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温 和漂洗薄膜，除去未结合RNA聚合酶的双链DNA片段，然后 再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下。一般来说， 这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性 （即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通 常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。
大肠杆菌基因工程 (2)
大肠杆菌基因工程引言大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，它可以在动植物肠道中找到。
由于其生长快速、易于培养和转化，大肠杆菌成为了基因工程研究中最重要的模式生物之一。
大肠杆菌基因工程是通过改变大肠杆菌的遗传特征，实现对其功能的改造和优化，从而达到生产特定产物或解决特定问题的目的。
大肠杆菌基因工程的原理基因传递与插入大肠杆菌基因工程的核心在于将目标基因导入到大肠杆菌中。
目前常用的方法有以下几种：1.转化(transformation)：通过将外源DNA直接导入大肠杆菌细胞内，使其在细胞内复制和表达。
2.电转化(electroporation)：利用强电场将质粒DNA引入细胞内，使其与大肠杆菌细胞内的DNA重组。
3.病毒介导的转染(viral-mediated transduction)：使用病毒载体将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
4.转座子介导的DNA转移(transposon-mediated DNAtransfer)：利用转座子将目标基因插入到大肠杆菌染色体的特定位点上。
基因表达与调控在大肠杆菌基因工程中，外源基因导入之后需要进行表达和调控，以产生所需的受体蛋白或产物。
常用的表达系统包括启动子-启动子区域-编码序列-终止子的结构。
其中，启动子可以选择适当的促进剂或抑制剂进行调节，以控制基因的表达水平和时机。
应用案例生物医药领域在生物医药领域，大肠杆菌基因工程被广泛应用于生产重组蛋白药物。
通过引入外源基因，大肠杆菌可以高效地合成重组蛋白，并通过分离和纯化得到高纯度的药物。
例如，利用大肠杆菌表达系统，可以生产出重组人胰岛素、生长激素等重要药物。
环境治理领域大肠杆菌基因工程还可以应用于环境治理领域。
例如，通过改造大肠杆菌的基因组，使其具有降解有机污染物的能力，可以用于处理工业废水和土壤污染。
此外，大肠杆菌的工程还可以用于制造生物能源，例如利用大肠杆菌产生生物柴油或生物氢。
基因工程3大肠杆菌表达系统
前言
01
02
最佳的基因表达体系： 目的基因的表达产量高; 表达产物稳定; 生物活性高; 表达产物容易分离纯化。
第一节基因的表达系统与表达策略
容易获得较高浓度的细胞；
01
能利用易得廉价原料；
02
不致病、不产生内毒素；
03
发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；
04
容易进行代谢调控；
05
容易进行DNA重组技术操作；
06
产物的产量、产率高，
07
产物容易提取纯化。
08
适合目的基因表达的宿主细胞的要求:
宿主细胞的选择
01
原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等；
02
真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
宿主细胞分为两大类：
真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
让外源蛋白质定位在周质或胞外表达； 使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株； 将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长； 使目标基因以融合蛋白形式表达； 置换多肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点； 对目标蛋白质作疏水性修饰。 为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：
常用的大肠杆菌表达载体
01
最常用的：噬菌体的PL启动子，大肠杆菌的Lac启动子、Trp启动子，以及pBR322质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。
03
迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。
01
02
最佳的基因表达体系： 目的基因的表达产量高; 表达产物稳定; 生物活性高; 表达产物容易分离纯化。
第一节基因的表达系统与表达策略
容易获得较高浓度的细胞；
01
能利用易得廉价原料；
02
不致病、不产生内毒素；
03
发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；
04
容易进行代谢调控；
05
容易进行DNA重组技术操作；
06
产物的产量、产率高，
07
产物容易提取纯化。
08
适合目的基因表达的宿主细胞的要求:
宿主细胞的选择
01
原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等；
02
真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
宿主细胞分为两大类：
真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
让外源蛋白质定位在周质或胞外表达； 使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株； 将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长； 使目标基因以融合蛋白形式表达； 置换多肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点； 对目标蛋白质作疏水性修饰。 为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：
常用的大肠杆菌表达载体
01
最常用的：噬菌体的PL启动子，大肠杆菌的Lac启动子、Trp启动子，以及pBR322质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。
03
迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。
分子生物学原理--基因工程ppt课件
分子生物学原理
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步
噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染色 体重组，成为细菌染色体的一部分。
• 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。
• 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将 细菌涨破。
第十四章 基因重组与基因工程
10/28/2024
分子生物学原理
基因重组：genomic recombination 重组DNA：recombinant DNA
10/28/2024
分子生物学原理
第一节、自然界的基因重组
• 转化：transformation • 整合：integration • 转导：transduction • 转位：transposition
10/28/2024
分子生物学原理
转位
• 转位：一个或一组基因从一处转到基因 组的另一个位置。
• 这些游动的基因称为转位子(transposon)。
10/28/2024
分子生物学原理
转 位
10/28/2024
分子生物学原理
第二节、基因工程
• 基因工程：是用分离纯化或人工合成的 DNA在体外与载体DNA结合，成为重组 DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重 组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩 增，成为克隆。也叫基因克隆或重组 DNA技术。
切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目 的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。
10/28/2024
分子生物学原理
DNA重组体的筛选与鉴定
•灭 活法筛 选重组 体。
大肠杆菌.ppt
大肠杆菌可以透过 接合作用传递遗传 物质。
五、抗原及血清型
（一）抗原 O抗原，即菌体抗原，为细胞壁脂多糖。该抗原刺激 机体主要产生IgM类抗体。 H抗原， 即鞭毛抗原 ，H抗原主要刺激机体产生IgG 类抗体，与其他肠道菌基本无交叉反应。 K抗原，即荚膜抗原，位于O抗原外层，为多糖。具 有K抗原的菌株不能被其相应的抗O血清所凝集叫 “O不凝集性”。 据耐热性不同，K抗原又分为：L、A和B 三型。
超过56种 100种以上
170多种
（二）血清型 可用O:K:H排列表示其血清型。如：O8:K23:H19， 表示该菌具有O抗原8，K抗原23，H抗原为19。 致人畜腹泻的产肠毒素大肠杆菌，除含K抗原外， 还可含有蛋白质性粘附素抗原。对粘附素抗原应并 列写于多糖K抗原之后。如：O8:K87，K88:H19 中 K88即为粘附素抗原。
大肠杆菌
大肠杆菌的历史
肠杆菌科,为革兰氏阴性杆菌。根据生化反应、血清 学试验、DNA同源性研究，肠杆菌科至少包括44个 菌属，170个以上的菌种。 埃希菌属（Escherichia）中最重要的是大肠埃希菌 (E. coli) ，常称为大肠杆菌。 大肠杆菌广泛分布于自然界，包括腐生菌、寄生菌 和人及动物的病原菌。多数是人和动物肠道正常菌 群的重要成员。 20世纪中叶，认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对 人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常 引起严重腹泻和败血症。
病料
腹泻或水肿病例 败血症病例
常采集粪便或肠粘膜刮取物 麦康凯或伊红美兰琼脂平板划线
常采集血液及其病变组织 血琼脂或麦康凯琼脂平板划线
挑取疑似大肠杆菌菌落5～10个分别在琼脂平板进行纯培养 革兰染色镜检 革兰氏染色阴性 接种TSI琼脂培养基
基因工程简介PPT课件
• 细胞染色体外能自主复制的小型环状 DNA分子；
• 质粒是基因工程中最常用的运载体； • 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； • 质粒的存在对宿主细胞无影响； • 质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
.
15
（三）、基因工程操作的步骤
提取 目的 基因
目的基 因与运 载体结 合
将目的 基因导 入受体 细胞
目的基 因地检 测和表 达
.
•用与提取目的基
因相同的限制
酶切割质粒使之 出现一个切口， 将目的基因插入 切口处，让目的 基因的黏性末端 与切口上的黏性 末端互补配对后， 在DNA连接酶的 作用下连接形成 重组DNA分子 （重组质粒）
20
3、将目的基因导入受体细胞（并扩增）
• 基因工程中常用的受体细胞：
• 导入受体细胞常用的方法：
功能受损。
1971年，美国科学家在体外做了试验， 用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患 者的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞 能够利用半乳糖了。这表明，用基因替换的 方法治疗这种遗传病是可能的。
.
4
（一）、基因工程概念
——定向改造生物的新技术
别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程
结果
基因拼接技术 或DNA重组技术 生物外
将目的基因导 入受体细胞
• 目的基因的扩增
将受体细胞 进行扩增
.
21
4、目的基因的检测和表达：
• 为什么要检测？ • 检测方法？
.
22
表达：受体细胞表现出特定的性状。
例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。
• 质粒是基因工程中最常用的运载体； • 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； • 质粒的存在对宿主细胞无影响； • 质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
.
15
（三）、基因工程操作的步骤
提取 目的 基因
目的基 因与运 载体结 合
将目的 基因导 入受体 细胞
目的基 因地检 测和表 达
.
•用与提取目的基
因相同的限制
酶切割质粒使之 出现一个切口， 将目的基因插入 切口处，让目的 基因的黏性末端 与切口上的黏性 末端互补配对后， 在DNA连接酶的 作用下连接形成 重组DNA分子 （重组质粒）
20
3、将目的基因导入受体细胞（并扩增）
• 基因工程中常用的受体细胞：
• 导入受体细胞常用的方法：
功能受损。
1971年，美国科学家在体外做了试验， 用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患 者的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞 能够利用半乳糖了。这表明，用基因替换的 方法治疗这种遗传病是可能的。
.
4
（一）、基因工程概念
——定向改造生物的新技术
别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程
结果
基因拼接技术 或DNA重组技术 生物外
将目的基因导 入受体细胞
• 目的基因的扩增
将受体细胞 进行扩增
.
21
4、目的基因的检测和表达：
• 为什么要检测？ • 检测方法？
.
22
表达：受体细胞表现出特定的性状。
例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。
大肠杆菌PPT医学课件
5、大肠杆菌的致病物质
2.黏附素：能使细菌紧密黏着在泌尿道和肠道的细胞上， 避免因排尿时尿液的冲刷和肠道的蠕动作用而被排除。 大肠杆菌粘附素的特点是具有高特异性。 3.外毒素：大肠杆菌能产多种的外毒素，包括：志贺毒 素〡和〢；耐热肠毒素〡和〢；不耐热肠毒素〡和〢。 此外，溶血素A在尿路致病性大肠杆菌所致疾病中有重 要作用。
2、大肠杆菌的常见种类
根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其 中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿 腹泻和成人肋膜炎。 大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导 就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格采 用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细 菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。
5.其他：脂胞壁多糖的类脂A具有毒性，O特异多糖有抵抗 宿主防御屏障的作用。大肠杆菌的K抗原有吞噬作用。
5、大肠杆菌的致病物质
大肠杆菌O157:H7是大肠杆菌的其中一个类型，该种病 菌常见于牛只等温血动物的肠内。这一型的大肠杆菌 会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠管出现严重症 状，如带血腹泻。 美国在1982、1984、1993年曾三次发生O157:H7的爆发 性流行；日本曾在1996年爆发过一次波及9000多人的 大流行。O157:H7感染后的主要症状正是出血性腹泻， 严重者可伴发溶血尿毒综合征（HUS），危及生命。由 于O157:H7危害较大，且可经食物和饮用水在人群中广 泛传播。此次在德国肆虐的O104也是一种EHEC，感染 症状类似O157:H7，且毒力更为猛烈。
该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟 或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水 中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。 胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链 霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质 粒转移而获得的。
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过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本 身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基 因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能， 甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基 因编码产物的翻译效率
大肠杆菌基因工程
大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特 征
大肠杆菌表达外源基因的优
全基因组测序，势共有4405个开放型阅读
框基因架克隆表达系统成熟 完繁殖善迅速、培养简单、操作方便、遗传 稳被定美国FDA批准为安全的基因工程受体 生物
大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏
Ptr
Otrp
蛋白复合物的阻遏，转录呈基底除去色氨p
或加3-吲哚丙
状态。在培养系统中去除色氨酸酸
烯酸 （IAA）
或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），
高效转
便可有效地解除阻遏抑制作用。
录
在正常的细菌培养体系中，除去
Ptr
Otrp
色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目
受体菌株 含有外源启动子活性的重
组克隆
Ap
r
pKO
1
ori
终止密码
子 gal
K
启动子的构
启动子
建
启动子
-35 区序
PlL
T 列T G A C
Prec
AT T G A T
APtra
AT A G A C
PA trp
TA T G A C
Plac
AT T T A C
Ptac
AT T G A C
Ptac = 3 PtrpA= 11 Plac
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即 Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核 糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点， 但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
终止子
强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终止子是
来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及
Tcr
T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较
弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子Ap串 pCP
r
联的特殊结构，以增强其转录终止作用
1
终止子也可以象启动子那样，通过特殊的
ori
探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆
测
目的基
E A
因
E
启动 子
目的基
E因
E
A 酶切 开
Bal31酶 解
启动子的筛选
启动子
采用鸟枪法战略，将合适大小的
D克N隆A到片启段动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、 g粒a上lT报与告质基因galk的表达产物联合 作可用将，培养基中的半乳糖酵解成红色
素物转质化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌
基因的表达
p
Ptr
Otrp
高效转 录
启动子的可控
启动子
性 l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬遏菌，体很启难动直子接P诱L导受控CI制阻。遏在蛋基白因阻Ptr 工程中常使用温度敏感型的cI突p 变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋 在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌
大肠杆菌表达外源基因的劣 势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工 系内源统性蛋白酶降解空间构象不正确的异源 蛋细胞白周质内含有种类繁多的内毒素
大肠杆菌基因工程
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的 原理
启动 子 终止 子 核糖体结合位点 密码 子 质粒拷贝数
启动子
启动子最佳距离的探
筛选
筛选Apr、Tcs的转化子
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于 转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译 起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA 分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达 数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构 序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
培养罐中迅速升温非常困难，因Ptr 此常使用一个双质粒控制系统，p
用色氨酸间接控制目的基因表达
阻遏作
用 cI857
PL
A
色氨
酸
PL
Aபைடு நூலகம்
目的基 因 B
表 达 B
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过 终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
P 乳糖 异丙基-b-D硫代半乳糖苷 （IPTG）
P
基底水平转 录阻遏蛋
白
O
诱 导
高效转 录 O
启动子的可控
启动子
性 乳糖启动子Plac的可控性： cAMP
野生型的Plac上游附近拥
有代谢激活因子（CAP） 结区合，cAMP激活CAP，
C结A合P启动子控制区，进 而进促Plac介导的转录。葡萄 糖代谢使cAMP减少，也
CA
P Pla
葡萄糖代 c
谢
能遏阻Plac介导的转录。因此，
Plac
基因工程中使用的乳糖
高效转 录
O cAMP浓度 降低 基底水平转
录 O
高效转
启子动均为抗葡萄糖代谢阻 遏突的变型，即Plac UV5
录 Plac UV5 O
启动子
启动子的可控 性 色氨酸启动子Ptrp的可控性：
阻遏蛋 白
色氨 酸
基底水平转 录
-10 区序
G 列A T A C
TT A T A A TT A A T G TT T A A C TT A T A A TT A T A A
T
启动子的可控
启动子
性 乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区 O偶la联c 在一起，在没有诱 导存物在时，整个操纵子处 于底基水平表达；诱导物可 以启使动子Plac介导的转录大 幅提高
大肠杆菌基因工程
大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特 征
大肠杆菌表达外源基因的优
全基因组测序，势共有4405个开放型阅读
框基因架克隆表达系统成熟 完繁殖善迅速、培养简单、操作方便、遗传 稳被定美国FDA批准为安全的基因工程受体 生物
大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏
Ptr
Otrp
蛋白复合物的阻遏，转录呈基底除去色氨p
或加3-吲哚丙
状态。在培养系统中去除色氨酸酸
烯酸 （IAA）
或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），
高效转
便可有效地解除阻遏抑制作用。
录
在正常的细菌培养体系中，除去
Ptr
Otrp
色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目
受体菌株 含有外源启动子活性的重
组克隆
Ap
r
pKO
1
ori
终止密码
子 gal
K
启动子的构
启动子
建
启动子
-35 区序
PlL
T 列T G A C
Prec
AT T G A T
APtra
AT A G A C
PA trp
TA T G A C
Plac
AT T T A C
Ptac
AT T G A C
Ptac = 3 PtrpA= 11 Plac
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即 Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核 糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点， 但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
终止子
强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终止子是
来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及
Tcr
T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较
弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子Ap串 pCP
r
联的特殊结构，以增强其转录终止作用
1
终止子也可以象启动子那样，通过特殊的
ori
探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆
测
目的基
E A
因
E
启动 子
目的基
E因
E
A 酶切 开
Bal31酶 解
启动子的筛选
启动子
采用鸟枪法战略，将合适大小的
D克N隆A到片启段动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、 g粒a上lT报与告质基因galk的表达产物联合 作可用将，培养基中的半乳糖酵解成红色
素物转质化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌
基因的表达
p
Ptr
Otrp
高效转 录
启动子的可控
启动子
性 l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬遏菌，体很启难动直子接P诱L导受控CI制阻。遏在蛋基白因阻Ptr 工程中常使用温度敏感型的cI突p 变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋 在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌
大肠杆菌表达外源基因的劣 势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工 系内源统性蛋白酶降解空间构象不正确的异源 蛋细胞白周质内含有种类繁多的内毒素
大肠杆菌基因工程
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的 原理
启动 子 终止 子 核糖体结合位点 密码 子 质粒拷贝数
启动子
启动子最佳距离的探
筛选
筛选Apr、Tcs的转化子
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于 转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译 起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA 分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达 数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构 序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
培养罐中迅速升温非常困难，因Ptr 此常使用一个双质粒控制系统，p
用色氨酸间接控制目的基因表达
阻遏作
用 cI857
PL
A
色氨
酸
PL
Aபைடு நூலகம்
目的基 因 B
表 达 B
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过 终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
P 乳糖 异丙基-b-D硫代半乳糖苷 （IPTG）
P
基底水平转 录阻遏蛋
白
O
诱 导
高效转 录 O
启动子的可控
启动子
性 乳糖启动子Plac的可控性： cAMP
野生型的Plac上游附近拥
有代谢激活因子（CAP） 结区合，cAMP激活CAP，
C结A合P启动子控制区，进 而进促Plac介导的转录。葡萄 糖代谢使cAMP减少，也
CA
P Pla
葡萄糖代 c
谢
能遏阻Plac介导的转录。因此，
Plac
基因工程中使用的乳糖
高效转 录
O cAMP浓度 降低 基底水平转
录 O
高效转
启子动均为抗葡萄糖代谢阻 遏突的变型，即Plac UV5
录 Plac UV5 O
启动子
启动子的可控 性 色氨酸启动子Ptrp的可控性：
阻遏蛋 白
色氨 酸
基底水平转 录
-10 区序
G 列A T A C
TT A T A A TT A A T G TT T A A C TT A T A A TT A T A A
T
启动子的可控
启动子
性 乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区 O偶la联c 在一起，在没有诱 导存物在时，整个操纵子处 于底基水平表达；诱导物可 以启使动子Plac介导的转录大 幅提高