单核苷酸多态性及其应用详解演示文稿
浅谈单核苷酸多态性、单倍型及连锁不平衡
浅谈单核苷酸多态性、单倍型及连锁不平衡单核苷酸多态性，单倍型及连锁不平衡是一些基因组学领域中的重要概念。
它们在遗传学、系统发育学、植物学等多个领域都有重要的应用。
本文结合实例，从科学角度讨论单核苷酸多态性、单倍型及连锁不平衡。
一、单核苷酸多态性单核苷酸多态性是指一个特定位点中，有多种可能出现的单核苷酸类型。
一般情况下，在一个特定基因序列位点中，只有一种基因序列类型出现，而单核苷酸多态性是指在同一个序列位点可以出现多种基因序列类型。
单核苷酸多态性的发现，是由于多核苷酸的突变。
在基因组的多核苷酸中，突变的发生十分频繁，因此，同一个序列位点中可能出现多种基因序列类型。
此外，在不同的基因序列变异中，有可能出现多种单核苷酸类型。
举一个实例来说明，在某个植物体细胞中，一个序列位点中有三种基因序列类型（A、T、C），则该位点即为单核苷酸多态性。
研究表明，单核苷酸多态性可以影响基因组的表达，从而对生物功能产生影响。
二、单倍型单倍型是指在一个特定的位点上，一个特定的基因序列（如A、T、C）只出现一次，而另一个基因序列（如A、T、C）并不存在。
在基因组中，单倍型类型是非常普遍的，特别是在低等生物中，如细菌和植物体。
单倍型的作用，主要是在保护基因组的稳定性，保持基因的父代性，并且有助于基因的修复。
在某些特殊的情况下，如当有多个基因突变的发生时，单倍型可以避免突变的严重性。
单倍型也有助于细胞的正常功能，保持基因的进化性。
三、连锁不平衡连锁不平衡是指在父亲染色体和母亲染色体中，有一个染色体比另一个染色体多出一些基因序列，而一些基因序列可能不存在，这样会造成染色体的不平衡状态。
连锁不平衡的发生，主要是由于基因突变和特殊的多倍体细胞状态等原因，如非整倍体多倍体，双胞多倍体等，这些都可能会造成连锁不平衡的产生。
连锁不平衡对生物功能的影响很大，可能会造成生理因素的改变，如某些遗传性疾病的发生率增加，有些基因表达水平的改变，以及免疫系统的改变等等。
植物的单核苷酸多态性及其在作物遗传育种中的应用
植物学通报 2004, 21 (5): 618￣624Chinese Bulletin of Botany植物的单核苷酸多态性及其在作物遗传育种中的应用①１，２，３郝岗平 ２杨 清 １吴忠义 １曹鸣庆 １黄丛林②1(北京农业生物技术研究中心北京 100089) 2(南京农业大学生命科学学院南京 210095)3 (山东泰山医学院泰安 271000)摘要单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是基因组中最常见的遗传多态性，在遗传学研究的许多方面具有重要的作用。
综述了单核苷酸多态性的发现、特点及其应用等方面对植物SNP的研究进展，并展望其在作物遗传育种中的应用前景。
关键词 SNP，遗传标记，关联分析Single Nuleotide Polymorphism (SNP) and its Applicationsin Crop Genetics and Breeding1,2,3HAO Gang-Ping 2YANG Qing 1WU Zhong-Yi 1CAO Ming-Qing 1HUANG Cong-Lin②1(Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing 100089)2(College of Biological Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095 )3(Taishan Medical College of Shandong，Tai’an 271000)Abstract Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are the most frequent variations in the genome of any organism, playing an important role in many aspects of genetics research. In this paper, we reviewed the feature of SNPs，its advantage in genotyping and application in crops breeding . Key words Single nucleotide polymorphism (SNP), Genetic marker, Association analysis随着人类、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa L.)等多种高等生物基因组测序的完成，人们已经开始致力于生物基因组序列差异的发现和研究。
最新单核苷酸多态性SNP概念优点检测方法意义应用课件PPT
方法；第二章 资 格•（四）食品加工经营场所环境、设 备以及食品采购、储存、加工、检 验、运输过程的卫生要求；
• （五）从业人员个人卫生要；（六） 其他与健康相关的食品卫生知识。
第二章 资 格
• 第七条 食品卫生管理员培训分为食 品生产加工、餐饮、食品流通三类。
3.目前几种筛选检测未知或已知SNP多态性的方法 :
1.基于杂交的方法 2.基于酶或PCR的方法 3.以构象为基础的方法 4.直接测序的方法 5.其他方法
3、目前几种筛选检测未知或已知SNP多态性的方
法
1.基于杂交的方法
• 原理:短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂 交时，完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交 复合体稳定性的不同而将SNP 位点检测出来。 （差异越大，检测的特异性就越好）
2)变性梯度凝胶电泳DGGE
3)单链构象多态性SSCP
4)变性高效液相色谱DHPLC
4直接测序:
DNA测序是最容易实施但目前费用仍较昂贵 SNPs检测方法。通过不同个体的同一基因或DNA 片段
的直接测序,然后进行简单的序列比对,SNP变异检 出率可达100%。采用直接测序法,还可以直观地得 到突变碱基的类型及其准确位置等SNPs分型的参 数。随着DNA测序自动化和测序成本的降低,直接测 序法将越来越多地用于未知SNPs的发掘和已SNPs 的检测与分型。
2）.基因芯片技术(Gene chips)
基因芯片是在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)表面集成了 大量的分子识别探针,能够在同一时间内平行分析大量的基因,进行大 信息量的筛选和检测分析
3).探针技术(TaqMan)
4).动态等位基因特异杂交(Dynamic allelespecific hybridization,DASH)
【实用】PCRSSCP检测单核苷酸多态性PPT文档
图1 PCR-SSCP检测人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 （G6PD）基因突变
图2 PCR-SSCP检测人HLA-DRB基因多态性
PCR-SSCP应用
自1986年Kanazawa 等人证明，可以根据DNA 常链在非变性PAGE 的泳动 行为探测点突变以来，经Orita等人的发展与完善，逐渐成为一种成熟的探测点突 变的方法。由于该方法具有快速、简便、灵敏度高及适用于大群体筛选等优点， 因而该技术广泛用于各类群体点突变的检测，包括人类遗传病基因突变的探测、 癌基因或抑癌基因的突变探测等。该方法也大量地用于检测和肿瘤发生有关的基 因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的p53 基因的突变、肺癌的ras基因突变等。PCR-SSCP法除大量地用于基因突变的检 测外，还用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染情况、以及病原体传播途径的 研究中。
胺胺凝凝胶胶中中受受排排阻阻大大小小不不同同，，这这样样就就形形成成了了单单链链构构象象多多态态性性。。 胺凝胶中受排阻大小不同，这样就形成了单链构象多态性。
胺凝胶中受排阻大小不同，这样就形成了单链构象多态性。
（G6PD）基因突变
单链构象多态性检测（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。
பைடு நூலகம்
自1986年Kanazawa 等人证明，可以根据DNA 常链在非变性PAGE 的泳动行为探测点突变以来，经Orita等人的发展与完善，逐渐成为一种成熟的探测点突变的方法。
单链构象多态性检测（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。
胎球蛋白A基因单核苷酸多态性与冠状动脉钙化相关性研究演示课件
04
实验设计与方法
研究对象及样本来源
研究对象
具有冠状动脉钙化症状的患者和健康 人群。
样本来源
从合作医院收集冠状动脉钙化患者和 健康人群的血液样本。
实验试剂与仪器
实验试剂
胎球蛋白A基因特异性引物、dNTPs 、Taq DNA聚合酶等。
实验仪器
PCR仪、实时荧光定量PCR仪、电泳 仪、凝胶成像系统等。
国内外研究现状及发展趋势
要点一
国内外研究现状
要点二
发展趋势
目前，国内外已有大量关于胎球蛋白A基因单核苷酸多态性 与冠状动脉钙化相关性的研究报道。这些研究主要集中在 探讨不同胎球蛋白A基因单核苷酸多态性位点与冠状动脉钙 化程度、心血管疾病发病率和死亡率等方面的关系。然而 ，由于不同研究之间样本量、研究方法和评价标准等方面 存在差异，导致研究结果存在不一致性和争议性。
02
开展多中心、大样本的验证研究：目 前的研究结果仍需要进一步的验证。 未来可以开展多中心、大样本的验证 研究，以确认胎球蛋白A基因单核苷 酸多态性与冠状动脉钙化之间的相关 性，并评估其在不同人群中的适用性 。
03
探索基于遗传信息的个性化诊疗策略 ：随着精准医学的发展，基于遗传信 息的个性化诊疗策略越来越受到关注 。未来的研究可以探索如何利用胎球 蛋白A基因单核苷酸多态性等遗传信 息，为冠状动脉钙化的预测、诊断和 治疗提供个性化的策略。
胎球蛋白A基因单核苷酸多态性分布与特点
胎球蛋白A基因单核苷酸多态性在人群中的分布具有种族和地 域差异性，不同人群中的SNP频率和类型可能存在显著差异 。
胎球蛋白A基因单核苷酸多态性的特点包括：高度稳定性、易 于检测和分析、与疾病表型关联性强等。这些特点使得SNP 成为研究基因与疾病关联性的重要遗传标记。
07 单核苷酸多态性(SNP)实验
单核苷酸多态性（SNP）实验SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。
据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。
实验方法原理：SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。
据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于限制性片段长度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。
SNP是我们考察遗传变异的最小单位,据估计，人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。
一般认为，相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。
于是，我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型（haplotype）。
大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型（每个具有至少5%的频率），它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。
一个染色体区域可以有很多SNP位点，但是我们一旦掌握了这个区域的单体型，就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行基因分型，获取大部分的遗传多态模式。
实验材料：组织样品试剂、试剂盒：液氮、PBS、GA缓冲液、GB缓冲液、蛋白酶K、无水乙醇、蛋白液、漂洗液等仪器、耗材：离心管、离心机、废液收集管、吸附柱、水浴锅、分光光度计、低温冰箱等实验步骤：一、DNA抽提1. 取新鲜肌肉组织约100 mg，PBS漂洗干净，置于1.5 ml离心管中，加入液氮，迅速磨碎。
2. 加200 μl 缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。
加入20 μl 蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，混匀。
3. 加220 μl 缓冲液GB，充分混匀，37℃消化过夜，溶液变清亮。
单核苷酸多态性理论及应用
• To understand the process of dog diversification better, we conducted an extensive genome-wide survey of more than 48,000 single nucleotide polymorphisms in dogs and their wild progenitor, the grey wolf. Here we show that dog breeds share a higher proportion of multi-locus haplotypes unique to grey wolves from the Middle East, indicating that they are a dominant source of genetic diversity for dogs rather than wolves from east Asia, as suggested by mitochondrial DNA sequence data. Furthermore, we find a surprising correspondence between genetic and phenotypic/functional breed groupings but there are exceptions that suggest phenotypic diversification depended in part on the repeated crossing of individuals with novel phenotypes. Our results show that Middle Eastern wolves were a critical source of genome diversity, although interbreeding with local wolf populations clearly occurred elsewhere in the early history of specific lineages. More recently, the evolution of modern dog breeds seems to have been an iterative process that drew on a limited genetic toolkit to create remarkable phenotypic diversity.
单核苷酸多态性及其应用45页
▪ cSNP又可分为2种：
▪ 同义cSNP(synonymous cSNP)： ▪ 非同义cSNP(non-synonymous cSNP)
▪ 同义cSNP：
▪
SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻
译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱
基的含义相同；
▪ 非同义cSNP：
▪ 指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋 白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这 种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。
SNP的检测方法
Taqman法
以荧光共振能量传递(fluorescent resonance energy transfer,FRET)为基础的检测方法。
在PCR反应中，将供者-受者染料对分别结合到Taqman探 针的两端，探针未与目标序列结合时，通过FRET作用使供者 不发荧光；完全互补配对后，由于Taq DNA聚合酶具有5‘核 酸酶的活性，可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果 探针与目标序列中存在错配碱基，就会减少探针与目标序列 结合的紧密程度及Taq DNA聚合酶切割供者的活性，也就影 响了供者的荧光释放量，从而使碱基突变链和正常链得以区 分。
▪
掺入的dNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等，反应时
dATP由deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS)
替代．
▪
因为DNA聚合酶对dATPaS的催化效率比对dATP的催化效
率高，且dATP是萤光素酶的底物，dATPctS不是。
▪
硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，其物质的量和焦磷酸
一致。
▪
ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素
(oxyluclferin)的转化，氧化萤光素发出与ATP含量成正
SNP 单核苷酸多态性
SNPSNP，念法为〔snIp〕，全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。
从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种,即转换和颠换,二者之比为2：1[1] 。
SNP 在CG 序列上出现最为频繁,而且多是C转换为T ,原因是CG中的C 常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。
一般而言,SNP 是指变异频率大于 1 %的单核苷酸变异。
在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×10E6 个。
因此,SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
它是人类可遗传的变异中最常见的一种。
占所有已知多态性的90%以上。
理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。
因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。
这种变异可能是转换(C T，在其互补链上则为G A)，也可能是颠换(C A，G T，C G，A T)。
转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。
Wang等的研究也证明了这一点。
转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。
在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。
总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。
单核苷酸多态性在临床诊断中的应用课件
风险 增加非酒精性脂肪肝风险 增加肝炎病毒感染易感性 减少乙肝病毒感染易感性
临床意义 指导治疗决策和预后评估 相关肝病风险评估 隐藏乙肝感染风险评估
VIII. 单核苷酸多态性在心血管疾病中的 应用
冠心病
单核苷酸多态性在冠心病 易感性、病情评估和预后 评估等方面有重要应用。
高血压
某些单核苷酸多态性可能 影响高血压的发病机制和 药物治疗效果。
药物反应性
某些单核苷酸多态性可 解释个体对药物反应的 差异，有助于个体化的 药物治疗方案设计。
遗传咨询
单核苷酸多态性分析为 遗传咨询提供依据，帮 助个人和家庭了解遗传 疾病的风险和遗传特点。
V. 单核苷酸多态性在肿瘤学中的应用
1
肿瘤风险评估
某些特定单核苷酸多态性与肿瘤的遗传易感性有关，可作为肿瘤风险评估的指标。
根据单核苷酸多态性分析结 果，可以个体化地调整药物 剂量，达到更好的治疗效果。
3 不良反应预测
单核苷酸多态性可帮助预测个体对某些药物不良反应的敏感性，减少 治疗风险。
VII. 单核苷酸多态性在肝脏病学中的应 用
基因型 rs7 3 8 4 0 9 rs6 4 1 7 3 8 rs2 4 7 6 6 0 1
单核苷酸多态性在临床诊 断中的应用课件
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），是基因组中最常见 的变异形式之一，对于临床诊断具有重要意义。
I. 什么是Байду номын сангаас核苷酸多态性
单核苷酸多态性是指基因组中单个核苷酸发生变异的现象，可导致个体之间的遗传差异。
II. 单核苷酸多态性与基因组学
单核苷酸多态性在基因组学研究中扮演着重要角色，帮助我们理解个体差异、进化和疾病风险。
单核苷酸多态性在人类疾病中的作用分析
单核苷酸多态性在人类疾病中的作用分析单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）是指在基因组DNA序列中，单个碱基对（A、T、C、G）的变异。
这种变异在人类基因组中相当普遍，因此成为了进行基因组研究的重要指标。
SNP不仅存在于非编码区域，还存在于编码区域和调控区域，对人类的疾病具有重要的影响。
SNP的基本特征SNP的发生是因为在不断的复制过程中，DNA发生了突变，即把一种碱基替换成另一种。
这种替换会导致碱基序列的改变，从而影响基因的表达。
SNP的变异率约为每1000个核苷酸碱基中就会有一次变异。
SNP的分布不均匀，一般更容易出现在编码区域、非编码区域和调控区域，并且会导致蛋白质结构的改变。
不同的SNP会导致不同的临床表现。
方式表现为，一些SNP能够调控基因表达，一些SNP则直接影响基因的编码，而导致生物学、生理学和代谢上的改变。
SNP在人类疾病中的作用SNP在人类疾病中扮演着非常重要的角色。
目前已经证实SNP与一些遗传性疾病，如糖尿病、心血管疾病、乳腺癌、肺癌等有一定的关系。
1. 糖尿病：SNP在糖尿病中的作用体现在与胰岛素的代谢和分泌过程有关。
例如，TCF7L2基因中的SNP会影响胰岛素分泌的调节，使胰岛素分泌不足，最终导致糖尿病发生。
2. 心血管疾病：SNP在心血管疾病中的作用体现在与脑卒中、冠心病和高血压等有关。
例如，APOE基因的SNP会影响血脂代谢，从而导致心血管疾病的发生。
3. 乳腺癌：SNP在乳腺癌中的作用包括了与肿瘤的发生和进展有关的基因和调控因子。
例如，BRCA1和BRCA2基因的SNP会影响其DNA修复的功能，从而导致乳腺癌的发生。
4. 肺癌：SNP在肺癌中的作用体现在与烟草使用密切相关的代谢酶和某些细胞周期调节基因有关。
例如，CYP1A1基因中的SNP会影响对烟草中有害成分的代谢，从而增加了患肺癌的风险。
SNP的应用前景随着高通量测序技术的发展，基因分析已经成为临床医学中不可缺少的一环。
人类肝癌中单核苷酸多态性的分析与应用
人类肝癌中单核苷酸多态性的分析与应用肝癌是一种常见的恶性肿瘤，其发生率逐年上升，严重威胁着人类的健康和生存。
在研究肝癌的发病机制和预防治疗方法中，单核苷酸多态性成为了一个备受关注的研究方向。
本文着重从单核苷酸多态性的定义、分析及其在肝癌中的应用等方面进行讨论。
一、单核苷酸多态性的定义单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）是指基因组中单一核苷酸的突变或变异。
这种变异可能是单个碱基的突变，也可能是插入、缺失或重复等突变形式。
对于SNP的分析可以通过测序技术进行，其中最常用的是基于芯片的分析方法。
二、SNP在肝癌中的分析方法当前，一些研究者普遍认为SNP与肝癌的发病机制密切相关。
基于这一认识，研究者们在分析SNP与肝癌相关性时采用了多种方法，如关联分析、候选基因分析、基因荟萃分析等。
其中最常见的是关联分析。
1. 关联分析关联分析又称联合分析，是一种常用的SNP分析方法。
它通过对病人和对照组中SNP的频率进行比较，来确定SNP和疾病之间的相关性。
其操作步骤主要包括：设计研究计划、构建试验队列、考察SNP频率、特征选择和研究统计学方法。
2. 候选基因分析候选基因分析是在已知肝癌风险基因的基础上进行的一种SNP分析方法。
在这种分析方法中，研究者们首先识别候选基因，然后通过分析这些基因的SNP变异情况来探索其与肝癌之间的关系。
3. 基因荟萃分析基因荟萃分析是一种综合各类研究数据进行综合分析的方法。
在这种方法中，研究者们通过对多项研究数据进行汇总、比较和分析，来探究SNP与肝癌之间的相关性。
这种方法的优点是可以解决单个研究数据不足的问题，但也有一些限制，如不同研究间数据来源、研究质量不一等。
三、SNP在肝癌中的应用1. 个性化预防SNP分析可以确定一个人患某种疾病的风险。
通过分析一个人的DNA序列中的SNP信息，可以预测其体内的肝癌的可能性，并采取个性化的预防措施。
单核苷酸多态性及其应用详解演示文稿
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▪
焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系
中的酶级联反应:
▪
包括DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶;
▪
反应底物为adenosine 5‘phosphosulfate(APS)和萤
Байду номын сангаас光素。
▪
反应体系还包括待测序的DNA单链和测序引物。
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▪ 在每一轮测序反应中，加入一种dNTP。 ▪ 如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中
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5‘
供者
Taqman 探针
3‘ 受者
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5‘ 供者
Taqman 探针
3‘ 受者
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引物 目标序列
供者 5‘
受者 3‘
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引物
目标序列
供者
5‘
受者 3‘
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SNP的检测方法
分子信标(molecular beacon)法
原理 ：适当大小的有机分子晶体(介质)用接近其吸收光谱 的激光瞬时激发，会发生能量转移及解吸附过程。如将低浓 度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液中并加以干燥，蛋白质 或核酸分子将嵌入到介质晶体中。将该晶体放入质谱仪的真 空小室，用瞬时(纳秒)强激光激发，晶体中的蛋白质或核酸 分子就会解吸附，转变成气相的离子态，此时可通过质谱分 析这些离子。
并释放焦磷酸基团(PPi)。
▪
掺入的dNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等，反应时dATP由
deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS)替代．
单核苷酸多态性理论及应用模板
Taqman技术
• 这种方法也称为核酸外切 酶法(5’-nuclease assay) ,是在PCR过程中 实现等位特异性杂交,而不 需以往等位特异性杂交中 样品PCR后分离及洗涤等步 骤。
11
分子信标技术
• 分子信标是一种新型的发卡结构的 寡核苷酸探针,是在样品PCR过程中 因和样品DNA 杂交后而使自身荧光 构象改变从而实现对SNP的检测。
3
SNP的发展历史
通常，基因组DNA序列存在三种类型的天 然 插变 入• 异或生 这 解：缺命 是 释单失世人的个以界类现核及存早象苷卫在就。酸星着认替D极识N换其到A、丰但重一富 迄复段的 今次核多 仍数苷样 在的酸性 试差的， 图异 。1•9如94今年，，随单着核分苷子酸生多物态学性的（不断Si发ng展le， Nucle来o自tid分e子P水oly平m的o信rp息hi，sm尤s其简是称海SN量P的） 这个术DN语A第序一列次数出据现为在人人们类进分一子步遗认传识杂和志解 上，随释后生L命an多d样er性(1提99供6了)第前一所次未正有式的提机出会。 SNPs为新一代分子标记。1998-2002年 ，每年召开一次“ “SNPs与复杂基因组 ”国际会议，其宗旨是探讨SNPs在复杂 基因组研究中应用的可能性，其内容包括 方法、应用与伦理。
7
常用SNP检测Hale Waihona Puke 术常用SNP检测技术8
常用非凝胶SNP检测技术
1S时.N基代P ，因的二芯分为片型高技技通术术量可时分代为。两凝个胶时时代代，的一主为要凝技胶术 2和.T方a法q包m括a限n制技性术酶切片段长度多态性分析（
RFLP）、寡核苷酸连接分析（OLA）、等位
3基.分因特子异信聚标合技酶术链反应分析（AS2PCR）、单
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SNP的特征
▪ 一个SNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变 化， 作为一种碱基的替换，大多数为转换（C—T， G—A），也可能是颠换。
▪ 具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2／3左右。
▪ 转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而 且在CG序列上出现最为频繁，多是发生C—T的转换， 原因是CG中的C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替 换为胸腺嘧啶。
▪ 该技术分析系统自动化程度高，通量大，速度快，易 于建立标准化操作，适合大规模SNP研究及基因分型。
SNP的检测方法
动态等位基因特异性杂交法(dynamic allele specific hybridization,DASH)
▪
包括DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷
酸酶;
▪ 反应底物为adenosine 5‘phosphosulfate(APS) 和萤光素。
▪ 反应体系还包括待测序的DNA单链和测序引物。
▪ 在每一轮测序反应中，加入一种dNTP。 ▪ 如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到
引物链中并释放焦磷酸基团(PPi)。
▪ SNP大都表现为二等位基因（bialletic)多 态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。
▪ 位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等 位位点被称作单倍型(haplotype)，相邻SNPs的 等位位点倾向于以一个整体遗传给后代.
▪ 根据SNP在基因组中的分布位置可分为:
▪
基因编码区SNP(cSNP)
单核苷酸多态性及其应用 详解演示文稿
优选单核苷酸多态性及其 应用
▪ Single nucleotide polymorphism
▪ SNP的特征
▪
SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，
占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广
泛存在，人类DNA中每300-1000bp就有一个SNP.
▪ 因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个 SNPs。
▪
基因调控区SNP(pSNP)
▪
基因间随机编码区SNP(rSNP)
▪
等三类。
▪ 因为编码区内的变异率占周围序列的 1/5，cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。
▪ cSNP又可分为2种：
▪ 同义cSNP(synonymous cSNP)： ▪ 非同义cSNP(non-synonymous cSNP)
当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性 温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳 迁移率下降，DNA链中有一个碱基改变时，会在不 同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度 而被分离。
SNP的检测方法
Taqman法
以荧光共振能量传递(fluorescent resonance energy transfer,FRET)为基础的检测方法。
在PCR反应中，将供者-受者染料对分别结合到Taqman探 针的两端，探针未与目标序列结合时，通过FRET作用使供者 不发荧光；完全互补配对后，由于Taq DNA聚合酶具有5‘核 酸酶的活性，可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果 探针与目标序列中存在错配碱基，就会减少探针与目标序列 结合的紧密程度及Taq DNA聚合酶切割供者的活性，也就影 响了供者的荧光释放量，从而使碱基突变链和正常链得以区 分。
Taqman 探针
5‘
3‘
供者
受者
Taqman 探针
5‘
3‘
供者
受者
引物 目标序列
供者 5‘
受者 3‘
引物 目标序列
供者 5‘
受者 3‘
SNP的检测方法
分子信标(molecular beacon)法
分子信标是一个U型的单链核苷酸探针（探针序列内 部可有一定程度的互补配对），在探针两端也加上供者受者染料对，U型探针使两染料靠近，通过FRET作用使供 者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后，两染料 分离，使得供者的荧光亮增加，如果目标序列中存在错配 碱基，就会影响探针与其结合，从而影响到供者的荧光亮， 使碱基突变链和正常链得以区分。
SNP的检测方法
单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP)
原理： 单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列
决定的，当某一个碱基发生突变时，便会直 接影响该链的构象，非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳时迁移率会发生改变。
SNP的检测方法
变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理:
▪ 同义cSNP：
▪
SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻
译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱
基的含义相同；
▪ 非同义cSNP：
▪ 指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋 白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这 种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。
▪ 位于基因调控区的SNP则会影响基因表达量 的多少，因此，这两类SNP在功能和疾病发生发 展方面具有更重要的意义。
▪
掺入的dNTP和释放的osine alfa-thio triphosphale(dATPaS)
替代．
▪
因为DNA聚合酶对dATPaS的催化效率比对dATP的催化效
率高，且dATP是萤光素酶的底物，dATPctS不是。
▪
硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，其物质的量和焦磷酸
供者
受者
供者
受者
▪ 焦磷酸测序法
▪ 焦磷酸测序法(pyrosequencing)是一种不依 赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/ 激发/检测体系的序列分析技术，适用于已知序列 的DNA片段进行验证分析，适用于已知SNP的序列 验证及基因分型。
▪ 焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体 系中的酶级联反应:
一致。
▪
ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素
(oxyluclferin)的转化，氧化萤光素发出与ATP含量成正
比的可见光信号。
▪ 光信号由CCD摄像机检测并通过相应的软件得到反映。
▪ 每个峰的高度(光信号）与反应中掺入的核苷酸数成正 比，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，猝灭光信号， 并再生反应体系，加入另一种dNTP进行下一轮反应。随着 以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列信号峰确 定。