形态学实验技术

1.脱水:所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡或者火胶棉的渗入，这一过程称为脱水。

2 透明：为了使石蜡浸入到组织块内，必须经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质，这个过程称透明。

在制片过程中有两次透明，第一次是脱水后组织块的透明（目的是便于透蜡包埋），第二次是指染色后切片的透明（目的是有利于光线通过，便于显微镜观察）。

3.特殊染色：为了显示与确定组织或细胞中正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等，需要分别选用相应的显示这些成份的染色方法进行染色，包括胶原纤维染色（Masson等）、网状纤维染色、弹力纤维染色、肌肉组织染色（磷钨酸）、苏木素、脂肪染色（苏丹III）、糖原染色、粘液染色等。

4、AB-PAS：阿利辛蓝过碘酸Schiff染色法，特殊染色的一种，其结果是中性粘液物质呈红色，酸性粘液物质呈蓝色，中性和酸性粘液的混合物呈紫红色.
5、HE染色：在组织制片技术中，常规制片最广泛应用的是苏木素—伊红染色，又称HE染色。

染色方法: a.切片脱蜡至水，入苏木素液5分钟b.水洗，分化，蓝化。

c.入伊红液数秒，水洗，脱水透明封固 d.结果：细胞核蓝色，其他红色。

6、分化：在退行性染色中，需要某些特定的溶液将附着组织细胞上多余的染色剂脱去，从而使目的物与周围组织形成鲜明对比，同时使目的物本身的色泽也深浅适宜。

这种选择的去除多于染色剂的过程，称为分化。

7、原位杂交：是核酸分子杂交的一部分，是将组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。

它是用标记了的已知序列的核苷酸片段作为探针（probe），通过杂交直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬
片上检测和定位某一特定的靶DNA或RNA的存在。

8、基因芯片：基因芯片又称DNA芯片(DNAcMp)，是指固着在固相载体上的高密度的DNA 微点阵。

具体地说就是将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地排列在如硅片、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上，这就是基因芯片。

9、流式细胞术：流式细胞术是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术，是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。

它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数;与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

10、图像的定量分析：指用量化的方法一数字的表达形式对图像中各种结构信息的定量描述及在此基础上对图像含义所做的定量分析、推理、判断和概括。

通常所说的图像分析特别是计算机图像分析一般指的都是图像定量分析.
11、几何校正：几何校正是将一标准尺度输入计算机图像分析系统，计算机根据该尺度就可确定出该标准尺度输入的条件下有关图像的尺度单位，及图像中每一像素所代表的实际尺寸，这一过程通常称为标定。

简答
1、组织固定的目的和意义目的：1）能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。

（2）保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内的组织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。

（3）使组织硬化，便于切块。

（4）对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。

（5）保存好大体标本。

（6）
可增强染色的作用。

意义：所谓固定就是使要观察的组织结构尽量接近于它生前的正常状态。

因为机体死后血液循环停止，细胞逐渐死亡，如不立即处理，则细胞内的酶会使蛋白质分解为氨基酸渗细胞，使细胞溶解破坏，组织变型，在无冷藏的条件下，可因为病原微生物的繁殖而腐败，组织结构破坏，不利于形态学的观察。

2、色素的分类
人为性色素及沉着物：甲醛色素、汞沉着、铬沉着以及苏木素沉着物。

病理性色素及沉着物：
1、外源性：硅、石棉、铅、碳末、银、铜等
内源性：（1）血源性色素：血红蛋白、含铁血黄素、胆色素、疟色素。

非血源性色素：黑色素、脂褐素、肾上腺色素、嗜铬细胞色素。

3、HE染色的染色方法染色方法: 一、脱蜡至水二、染色1、苏木素染5min2、水洗1min3、75%盐酸乙醇分化3os自来水冲洗4伊红染色1min
三、脱水透明和封片
4、简述原位杂交实验的实验步骤由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但其基本操作流程和应用原则大致相同。

大致可分为：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理：洗涤④显示（visual－ization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。

5、试述流式细胞术样本制备的基本原则。

1.用于FCM的样本是单细胞悬液 ;2.使各种体液和悬浮细胞样本新鲜 ;3.针对不同的细胞样本进行适当的洗涤，酶消化或EDTA处理；4.新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化
法、机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液。

5、单细胞悬液的细胞数应不少于100万。

6、简述原位杂交技术的原理及应用。

原理：用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再用与标记物对应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在核酸原有位置进行细胞内定位。

应用：(1) 病原体的检测：病毒：HPV(16，18)──宫颈癌；EBV──鼻咽癌,结外NK/T 细胞淋巴瘤, HL；HBV──肝癌、肝炎；HIV──AIDS病等
（2）肿瘤基因检测：癌基因的染色体定位，癌基因mRNA检测──癌基因活化
7、免疫组化染色过程中为什么要进行抗原修复？常用的抗原修复方法哪些？因为部分抗原在甲醛固定过程中发生蛋白之间的交联及醛基的封闭作用而遮蔽抗原决定簇，使免疫组化标记敏感性明显降低。

通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露。

抗原修复方法有：化学方法：酶消化方法，常用有胰蛋白酶及胃蛋白酶；物理方法：热引导抗原决定簇修复，常用有单纯加热、微波处理和高压加热。

8、简述DNA倍体分析原理。

DNA倍体分析是在对DNA行特异性染色的基础上借助流式细胞仪或图像分析仪、显微光度计测试胞核单色光光吸收程度进行的。

其基本原理是基于比色分析中的朗伯比尔定律，即吸光度A与溶液中物质的浓度C和溶液层厚度B的乘积成正比。

DNA倍体分析是以正常二倍体细胞DNA含量光标准衡量受检细胞中DNA含量的倍体改变，通常用DNA指数来反应DNA含量的相对改变，并用于对DNA倍体分析的判断。

9基因芯片的特点是什么？优点：体积小，信息量大，能高效，快速和低
消耗地进行各种原位组织学的研究和观察，并有较好的内对照及实验条件的可比性。

高通量；大样本：；省时迅速：简便经济：结果可靠，用途广泛。

10高尔基复合体超微结构有哪些成份构成？其有何意义？由三种成分组成即扁平囊泡、小囊泡和大囊泡。

扁平囊泡是高尔基复合体的主体，有人称之为高尔基囊泡，它是由3～8个扁平囊泡平行排列组成，其间有电子致密度高的物质。

扁平囊泡呈弓形，凸面称为形成面或未成熟面，凹面称为分泌面或成熟面。

形成面的囊泡较薄，近似内质网膜。

小囊泡数量较多，散布于扁平囊泡周围，与扁平囊泡融合而起到蛋白质运输作用。

大囊泡多见于扁平囊泡扩大的末端，或见于分泌面，所以也称之为分泌泡或浓缩泡，常见于形成高尔基复合体的功能：形成和包装分泌物、蛋白质和脂类的糖基化；蛋白质的加工改造，膜的转化。

11简述免疫组化在病理诊断和研究中的作用。

1.确定细胞类型； 2.辨认细胞产物； 3.了解分化程度 4.鉴定病变性质；5.发现微小病灶； 6.探讨肿瘤起源或分化表型；7.确定肿瘤分期；8.指导治疗和预后； 9.辅助疾病诊断和分类； 10.寻找感染病因
12简述几种图像分割方法的优缺点图像分割的方法有色彩分割、灰度分割、和手工分割。

（1）色彩分割：就是通过指定特定的颜色，并将该颜色的图像结构提取出来。

这种分割方法对于具有特殊颜色结构的图像具有良好的分割效果。

在巴氏染色中，胞浆一般呈绿色，角化上皮细胞浆呈桔黄色，核呈紫蓝色，因此，用色彩分割法提取胞核或角化上皮胞浆等结构既准确又方便。

（2）灰度分割：是根据所设定的灰度阈值进行图像分割。

由于不同的图像结构往往具有相同的灰度，这就给分割带来了很大困难，常常将一些不
必要的图像结构一同分割出来。

因此单纯的灰度分割往往不能满足要求，常常要结合手工分割来进行图像分割。

（3）手工分割：就是通过手工方法借助鼠标器通过勾描感兴趣的特定结构来实现图像的分割，它在图像分割中起重要作用。

在灰度分割中，只要相邻结构的灰度相同或相近，就难以分割，就有必要借助手工分割。

手工分割同样可以和色彩分割相结合，弥补色彩分割时的不足。