16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

1.适用范围

本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。

本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。

2.方法和原理

16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列。16SrDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

在 16SrRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全

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长序列分成3部分进行测序。

3.设备和材料

1.1器材

移液器（1000μL、200μL、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppend orfMixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti96WellThermalCycl er；凝胶成像仪：VersaDocMP4000；基因分析仪：AB3500、AB3130

1.2试剂

DNA快速提取试剂：PrepManUltra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×TaqBuffer(Mg2+)，dNTPs，d dH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDyeTerminator，5×SequencingBuffer；BigDyeXTerminatorPurificationKit；

1.3耗材

移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管： 1.5mL、200μL；

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MicroAmp TM Optical96-WellReactionPlate；MicroAmp TM OpticalAdhesiveFilm；

1.4引物

16 SrDNA 名称序列

扩增

长度

第1部分

正向引

物27F

5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

500b

p左右反向引

物519R

5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'

第2部分

正向引

物357F

5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'

750b

p左右反向引

物1115R

5'-AGGGTTGCGCTCGTTGC-3'

第3部分

正向引

物926F

5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3'

560b

p左右反向引

物1492R

5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'

其中M=C:A,Y=C:T.K=G:T,R=A:G,S=G:C.W=A:T;all1:1

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4. 操作流程

1.5

核酸提取：

挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepManUltra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL d dH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。提取的DNA 于-20℃保存。

1.6 基因扩增 1.6.1 PCR 反应体系

备注：DNA模板量通常在100ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板使用量。PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却3~5min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。

1.6.2PCR反应条件

1.6.3电泳

称取1g琼脂糖置于100mLTAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60℃左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。

1.7产物纯化

1.7.1每5μLPCR产物加入2μLExoSAP-IT试剂，混匀。

1.7.2放入PCR仪中，37℃温育15min,80℃温育15min。

1.7.3纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。

1.8测序反应

1.8.1测序反应体系

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1.8.2测序反应条件

60℃：4min

4℃：∞

1.8.3测序反应纯化(BigDyeXTerminatorPurificationKit)

5.4.3.1每管加入27μL SAMSolution和6μLBigDyeXTerminatorSolution。

5.4.3.2放在Eppend orfMixMate上2000rpm震荡30min。

5.4.3.3在离心机上以1000×g离心2min。

5.4.3.4每管吸取10μL上清液于96孔板中，放入测序仪中测序。

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