聚谷氨酸

非 L-Glu 依赖型
这类菌种主要有B.subtilis5E、B. subtilisvar. polyglutamicum 、 B. licheni-formisA35 、 B.subtilis TAM-
01 和 Madla 和 Prasertsan 等[9]从
温泉中筛选出的B.thrmotolerant WD90.KT12.KF.41等
产γ -PGA的菌株
能发酵生产 γ - 聚谷氨酸的菌种较多，有地衣杆菌、枯草 芽孢杆菌等菌种，而以枯草芽孢杆菌发酵生产γ -PGA的研究 居多。 根据细胞生长的营养要求是否需要 L- 谷氨酸可以把 γ PGA产生菌分为两大类
L-Glu 依赖型
这类菌种主要有 B.anthracis、B. subtilisMR-141 、 B. licheniformisATCC9945 、 B. licheniformisATCC9945a、B. subtilis IFO3335、 B. subtilisF-2-
培养基
初筛培养基及斜面保存培养基（LB）：胰蛋白胨10g/L，酵母提取 物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH至7.2 , 121℃ 蒸汽灭菌20min. 液体种子培养基：LB培养基中加入1g/L的葡萄糖 基本发酵培养基：柠檬酸10g/L，L-Glu 15g/L，NH4Cl 4g/L， K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeCl3·6H2O 0.02g/L，CaCl2·2H2O 0.2g/L，去离子水配制后，用NaOH调pH至 7.5,121℃ 20min。
菌种的筛选
实验材料：土壤 初筛

纳豆
豆腐乳
豆豉
取实验材料2g于10mL无菌水的试管中，用橡胶塞封口，振荡2min,再静 置30min；

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水浴锅100℃煮沸5min；
冷却后，取上清液 1mL，浓度梯度稀释，分别取0.2mL稀释液涂布于初 筛培养基平板上； 37℃培养24h观察结果，在初筛培养基上挑选呈粘液状能拉丝的单菌落， 将筛选出的单菌落经划线分纯后分别编号，并进行3代传代培养； 最后于枯草芽孢杆菌转接于 LB斜面，再经培养有保存于冰箱中（4℃）。
② B. subtilis IFO3335 发酵生产 γ -聚谷氨酸
B. subtilis IFO3335 是从一种传统的日本食品“纳豆”中 分离出来的，是一种 L-Glu依赖型菌株。外源的L-Glu仅仅 是作为γ-PGA合成酶的激活剂，而用于合成 γ-PGA 的谷氨 酸则是 TCA 循环的中间代谢物。利用这种细菌发酵生产 γ-PGA，产量随培养条件的不同而不同，其范围为20～50 g/L。典型的培养基组成为：L-Glu 30 g/L，柠檬酸 20 g/L， 硫酸铵 5 g/L，培养周期96 h。这个菌株以外源的L-Glu 作 为合成 γ-PGA 的激活剂，而合成 γ-PGA 的主要前体来源 于 TCA 循环，因此，可以尝试直接加入 TCA 循环中间代 谢物，考察 γ-PGA 的产量，选出最佳前体添加物，以进 一步提高产量。
γ -PGA的特性
对人体和环境无毒可生物降解 ，生态友好型
易交联形成后期拥有卓越性 能的水凝胶
A
B
水溶性，可得到无味清洁透明 的溶液 C
可制成钠，钙，镁，氢型
D
γ -PGA的应用
食品方面
增加抗冻性，食品冷藏 增加抗溶性 增加钙及其他矿物质吸收 抗氧化
01 02
农业方面
作为植物增产营养素 超强亲水性与保水能力， 可作为肥料增效剂，并增 加植物抗病能力 平衡土壤酸碱度 可结合沉淀有毒重金属
16SrDNA序列的测定和系统发育树的建立 细菌菌株基因组 DNA 的提取：用 基因组 DNA 提 纯试剂盒提取 16S rRNA 基因 序列的 PCR 反 应 16S rRNA 基因 序列测定 同源性分析，系 统发育树的建立




③ B.subtilis ZJU-7 发酵生产 γ -聚谷氨酸
B.subtilis ZJU-7 是从中国传统食品豆腐乳中分离出来的， 是一种 L-Glu 依赖型菌株，发酵生产γ-PGA 时必须加入外 源谷氨酸。其最适碳源和氮源分别是蔗糖和胰蛋白胨，在 含有60 g/L蔗糖、60 g/L胰蛋白胨和80 g/L L-Glu的培养液 中37 ℃培养24 h 后，γ-PGA 的产量为 54.4 g/L。这是目 前（2008年）报道过的最高产量。然而，考虑到工业化生 产，营养成本较高，生产成本也随之提高。因此，利用农 副产品或者含有 L-Glu的各种废料生产 γ-PGA，降低其生 产成本后，有望工业化。
聚谷氨酸的发酵生产和分离提取
的工艺研究
课题背景及目的意义 菌种的分离与发酵 产物的提取与鉴定 菌种的鉴定
目 录
CONTENTS
01
PART ONE
课题背景及目的意义
聚谷氨酸的发现，结构特性及其应用
聚谷氨酸（γ -PGA）简介
poly-γ -glutamic acid
γ -PGA最早发现于1937年，研究人员在炭 疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）的细胞 荚膜以及糖化菌（Bacillus mesentericus） 的细胞荚膜中发现 γ -PGA 。之后在枯草芽 孢杆菌（Bacillus subtilis )以及纳豆杆菌 （Bacillus natto )中也发现了γ -PGA。
土壤级聚谷氨酸
γ -PGA聚谷氨酸是一种特殊的阴离子自然
聚物，是L-Glu和D-Glu以α - 氨基 和γ 羧基之间经酰胺键的形式 缩合而成的高分 子聚合物。 γ -PGA 的分子量一般在 50kDa 到 2000kDa （ 100~1000kDa ）。其保湿 锁水功效是透明质酸的500倍
聚 谷 氨 酸 水 胶
采用 SDS-PAGE变性电泳检测到 B53产生的聚谷氨酸的分 子质量 570～669 ku,呈多分子质量分子聚集体形式 ,并非由 单一分子质量组成(图 3)
04
PART FOUR
菌种鉴定
菌体形态，16SrDNA序列的测定及系 统发育树的建立
主要从以下几个方面 ① 菌落：颜色，形状，表面是否光 滑，边缘是否平整； ② 菌体：大小，有无鞭毛芽孢荚膜 等结构； ③ 革兰氏染色
03
PART THREE
产物的提取与鉴定
γ -PGA的提取及鉴定
复筛菌株的发酵液经离心除菌后,取上清液 ,加入4 倍于上清液体积 的乙醇 ,搅动后于 6 000r/ min离心20min , 收集沉淀物。沉淀物用 适量去离子水溶解 ,加入 4 倍于其体积的乙醇沉淀 ,此沉淀物用pH 6.98 的磷酸氢二钠 磷酸二氢钾缓冲液溶解后 ,加入 5 倍于其体积、 预冷的丙酮 ,6000 r/ min 离心20min 。将沉淀物倒入截留分子质 量 8～12 ku 的透析袋透析 40 min ,换水 2～3 次 ,冷冻干燥得检测 样品。
对B53纯化产物常规盐酸水解后 ,再经处 理进行液相色谱分析(图 2) 。其中左侧第 1 个峰为内标物即牛磺酸(出峰时间 5.74 min) ; 第 3 个为溶剂峰即FMOC(出峰时 间 27.26 min) ,可见此聚合物的水解产物 只含有 1 种氨基酸; 第 2 个峰(出峰时间 9.74min) 与谷氨酸的出峰时间相同 ,推断 此水解物为谷氨酸。
紫外扫描光谱分析 （200～600 nm 扫描）
产物成分分析
HPLC分析 HPLC分析
SDS-PAGE测定分子量
提取 8 株目标菌株的摇瓶发酵产物 , 进行紫外扫描 ,发现B53菌株的发酵 产物最大吸收波长为 212nm ,并且 只有 1 个峰 (图 1) ,与聚谷氨酸的典 型紫外吸收波长非常接近(214 nm) , 于是确定B53菌株为下一步研究的 出发菌株。该物质在260～280 nm 没有吸收峰 ,表明其没有典型的肽链 结构。
4 等。
①B. licheniformis9945a 发酵生产 γ -聚谷氨酸
1942 年发现 B. licheniformis9945a 能够生产γ-PGA，接 着相关培养基设计和发酵条件优化的研究相继展开。研究 表明，盐浓度、L-Glu、甘油和柠檬酸是生产 γ-PGA 的主 要影响因素，Mn2+和 Ca2+对γ-PGA的产生也有显著影响。 最优培养基组成如下：柠檬酸 12 g/L ，甘油 80 g/L ， NH4Cl 7 g/L，MgSO4 0.5g/L，FeCl3 0.04 g/L，K2HPO4 0.5 g/L ， pH=7.4 。 2 ～ 3 天培养后， γ -PGA 的产量为 15g/L。B. licheniformis9945a 在此培养条件下，产量较低， 可能是由于没有找到最适的碳氮源、生长因子等。在随后 的研究中，产量高于15 g/L。


菌种的筛选
复筛 制备液体种子培养基并灭菌，分别从保藏的新鲜斜面上取一至两环 菌接入种子培养基（50mL/150mL锥形瓶），37℃、150r/min 24h。 按2%的接种量，分别将种子液接到装有120ml灭菌基本发酵培养基中， 37℃ 150r/min 96h. 菌种保存方法 短期 LB培养基斜面，4℃保存3个月转一次 长期 0.5mL 菌悬液（>108 个 /mL）与0.5mL 40%灭菌甘油混匀 80℃，可保存2年。
医药方面
03 04
保健品添加剂，促进钙 质吸收 具有良好的生物亲和性 和生物降解性，可用作药物 载体
其他方面
污水处理，如重金属 吸收剂或螯合剂 卫生用品，婴儿尿布 及妇女卫生巾等 保湿作用，用于化妆 品
02
PART TWO
菌种的分离与发酵
产γ -PGA的菌株，菌种的筛选，培养基