免疫细胞的分离及保存技术
免疫细胞的分离技术
免疫细胞的分离技术概述免疫细胞分离技术是生物医学领域中的一项基础技术，它通过对免疫细胞的表面标记进行特异性识别，从而将不同类型的细胞进行有效的分离。
免疫细胞的分离技术在很多疾病的检测、治疗和研究中起着至关重要的作用，如肿瘤学、免疫学、细胞学等领域。
原理免疫细胞的分离技术主要是基于免疫受体（antigen）和特异性抗体之间的作用机制，该过程通常包括三个步骤：细胞表面标记的贴附、特异性抗体的结合和分离。
细胞表面标记的贴附细胞表面标记是指细胞表面上的蛋白或其他化合物，它们能够被抗体所识别。
免疫细胞分离技术中常用的细胞表面标记主要有细胞抗原（cell surface antigen）、细胞特异性蛋白质（cell type-specific protein）等。
特异性抗体的结合特异性抗体是指能够特异性识别并结合到目标物质的抗体。
在免疫细胞分离技术中，特异性抗体与目标细胞表面标记结合后，形成免疫复合物（immunocomplex），从而可以将目标细胞分离出来。
分离在特异性抗体与细胞表面标记结合后，需要利用某种手段将免疫复合物与其他细胞类型分离开来。
目前典型的分离方法包括磁珠分离（magnetic bead separation）、离心分离（centrifugal separation）等。
方法免疫细胞分离技术的具体实施方法可以按照以下步骤进行。
材料准备免疫细胞分离技术需要准备一系列实验材料和试剂，如细胞培养液、特异性抗体、免疫磁珠、离心管、离心机等。
细胞处理将需要分离的细胞进行初步处理，如清洗、培养等。
在细胞处理过程中，需要特别注意避免细胞受到损伤。
抗体结合将特异性抗体与细胞混合，让其发生结合反应。
这一步骤可以在离心管中进行，也可以在培养皿中进行。
分离步骤根据具体的分离方法，选择合适的步骤进行分离，如磁珠分离、离心分离等。
细胞复苏将分离出的细胞进行复苏处理，如使用培养液进行复苏，使其恢复生长和增殖的能力。
应用范围免疫细胞分离技术可以应用于各个领域的研究和应用，涉及以下方面：肿瘤学通过分离出不同类型的癌细胞，可以研究其生长、转化和浸润等机制，并用于肿瘤的诊断和治疗。
免疫细胞的分离和保存技术
第二节 淋巴细胞及其亚群的分离 1、纯淋巴细胞群的采集
原理：利用单核细胞在37℃和Ca 离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、 塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝 胶的特性，据此建立许多从单个核细 胞中除去单核细胞的方法，以获得高 纯度的淋巴细胞群。
(1)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本 法分离的淋巴细胞群中B细胞有所 损失。
第 免疫细胞的分 二 离和保存技术
十
章
何
印
蕾
概述
临床上的各种类型的免疫缺陷、自身
免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞 或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用 体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋 巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所 显示的功能的强弱进行检测，是判断机体 细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临 床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情 变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等 方面均有重要意义。
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、 巴 CD25等 细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、 CD22、CD29等
(1)E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加 入分层液→T细胞形成E花环而沉 于管底→悬液中为B细胞。 （2）尼龙毛分离法 方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤 维管→洗脱下来的是T细胞
胞，是一种单次密度梯度离心分离法。 其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll ) 其密度为1.020。可将血液分成四层， 从上到下依次是：血浆、单个核细胞、 粒细胞和红细胞。
2、Percoll分层液 是一种连续密度梯度离心分离法， 其主要成分为：硅胶颗粒，其原液 密度为：1.135。可将血液分成四层， 从上到下依次是：死亡细胞和血小 板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞 和红细胞。
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术免疫学研究是现代生物医学领域的一个重要分支，它研究的是人类和动物身体对各种病原微生物、异物和肿瘤细胞的防御反应。
在免疫系统中，免疫细胞是起关键作用的细胞类型。
它们能够识别和灭杀感染体和变异细胞，调节和模拟免疫反应，从而维持机体的免疫平衡。
因此，为了更好地研究免疫学的各个方面，对免疫细胞进行有效的分离和纯化是非常重要的。
免疫细胞的分离和纯化技术主要有以下几种：一、梯度离心分离法梯度离心分离法是采用密度梯度离心分离免疫细胞的方法。
具体步骤是将单个样品分离成不同的浓度梯度，并将样品均匀地添加在内层管子上，然后进行离心分离。
通过分析分离后的离心上清液中各种细胞类型的分布情况，可得到高纯度的特定免疫细胞。
该方法具有简单、快速、操作简单等优点。
二、单克隆抗体柱纯化法单克隆抗体柱纯化法是使用和特定抗体相结合的高亲和性蛋白质固相柱进行免疫细胞分离和纯化的方法。
该方法是将单个样品进行混合，将混合物通过配对的特定抗体柱，将目标细胞捕获和结合。
然后用缓冲液除去不结合的细胞，然后逐步提高pH、浓度等条件进行脱附和纯化。
该方法可以获得高纯度特定细胞的纯度，但需要对抗体进行结合实验，需要一些特殊的仪器和设备。
三、磁珠分离法磁珠分离法是将磁性珠子通过表面结合蛋白并与目标细胞结合的方法实现免疫细胞的分离和纯化的方法。
目前，该方法是免疫学研究分离和纯化细胞的主要方法之一。
该方法具有结合力强、纯度高、高通量、实时观察和可重复等特点。
然而，现有产品价格较高，因此利用磁珠结合留存的免疫抗体分子，促进自主磁珠制备已成为热门技术研究领域。
四、流式细胞术流式细胞术是一种使用单胞悬液通过免疫表型分析和单细胞相关性分析的方法。
该技术是通过将免疫细胞进行标记，然后将其通过流式细胞术仪器进行检测和分析，以实现细胞分离和分析的方法。
流式细胞术是高分析刻度，可以分析更多的样品、更少的细胞、更少的步骤，同时也能够研究细胞的表面和内部组成，测定分析数据的精确性高，检测的速度快等多种优点。
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。
有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。
分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。
一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。
本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
免疫细胞存储流程
免疫细胞存储是将人体免疫细胞进行冷冻保存，以备将来治疗或研究之用。
以下是一般免疫细胞存储的流程：
1.采集免疫细胞：采集免疫细胞通常通过外周血采集，可通过静脉采血或分离淋巴细胞等方式来获取免疫细胞。
2.预处理：采集的免疫细胞一般需要经过预处理步骤，包括红细胞裂解、细胞浓缩、细胞筛选等操作，以获得纯净的目标免疫细胞。
3.冷冻适应处理：将免疫细胞进行冷冻适应处理，通过逐步降温和以特定保护剂调配的冷冻液体，以使细胞逐渐适应低温环境，减少细胞受冷冻损伤的风险。
4.冷冻保存：将冷冻适应处理后的免疫细胞分装入小容器（常见为液氮冻存管），使用专业冷冻机器或液氮冷冻贮存系统迅速冷冻至极低温（通常为液氮温度-196°C），并在液氮贮存罐中储存。
5.质量控制和记录：在储存免疫细胞的过程中，必须进行质量控制和记录。
包括细胞的数量、存储温度、储存时间、质量确认等数据的记录。
6.申请和提取：在需要使用存储的免疫细胞进行治疗或研究时，申请方将提交相应的申请并获得授权后，可提取对应的存储细胞进行使用。
需要注意的是，免疫细胞的存储和提取过程必须遵循相应的法律法规和伦理原则，确保免疫细胞的合法性、安全性和隐私保护。
同时，冷冻细胞的储存和质量控制需要符合一定的标准和规范，以保证细胞的有效性和可用性。
免疫细胞存储的操作流程
免疫细胞存储的操作流程引言：免疫细胞存储是一种重要的生物医学技术，它可以帮助人们保存和利用免疫细胞以进行免疫治疗。
本文将介绍免疫细胞存储的操作流程，包括细胞采集、处理、贮存和使用等环节。
一、细胞采集1. 选择合适的采集源：免疫细胞可以从多个来源采集，包括外周血、骨髓、脐血等。
根据具体需求，选择合适的采集源很关键。
2. 采集方法：根据采集源的不同，采用相应的采集方法。
例如，外周血可以通过静脉抽血，骨髓可以通过穿刺抽取，脐血可以通过脐带剪断后采集。
3. 采集样本处理：采集的细胞样本需要尽快处理，以避免细胞失活或受污染。
通常，采集后的样本会被送往实验室进行下一步处理。
二、细胞处理1. 细胞分离：采集到的样本中可能存在其他细胞或物质，需要进行细胞分离。
可以通过离心、流式细胞术等方法将目标细胞分离出来。
2. 细胞富集：为了提高目标细胞的纯度和浓度，可以采用细胞富集技术，如磁珠富集、流式细胞术等。
3. 细胞检测：对处理后的细胞进行质量控制，确保细胞的存活率和纯度达到要求。
可以使用细胞计数仪、细胞培养等方法进行检测。
三、细胞贮存1. 冷冻保存：为了延长细胞的存活时间，通常会选择冷冻保存。
将处理后的细胞用特定的冷冻液冷冻保存，以确保细胞在低温下保持稳定。
2. 冷冻管标识：为了方便细胞的识别和管理，冷冻管需要进行标识。
可以使用标签或条码等方式标记细胞的相关信息，如样本编号、采集日期等。
3. 贮存条件：细胞贮存需要在恒定的温度和湿度条件下进行，通常选择液氮罐或液氮制冷器进行贮存。
同时，注意避免细胞受到震动或其他不良环境因素的影响。
四、细胞使用1. 细胞解冻：在使用前，需要将冷冻的细胞解冻。
解冻的过程需要控制温度和时间，以避免细胞受损。
2. 细胞培养：解冻后的细胞需要进行培养，以促进其生长和增殖。
通常使用适当的培养基和条件进行培养。
3. 细胞应用：培养后的细胞可以用于免疫治疗、疫苗制备等领域。
根据具体需求，细胞可以进行进一步的处理和应用。
免疫细胞存储流程
免疫细胞存储流程免疫细胞存储是一项重要的医学技术，它可以有效地保存人体免疫系统中的重要细胞，用于治疗各种疾病。
这些免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等，它们在抵抗感染、抑制肿瘤生长和维持免疫平衡等方面起着重要的作用。
下面将介绍免疫细胞存储的流程。
第一步：捐献免疫细胞免疫细胞的捐献可以通过多种途径进行，包括自体捐献和同种异体捐献。
自体捐献是指从患者自身身体中提取免疫细胞，通常通过采集患者的血液样本或骨髓样本来获得。
同种异体捐献是指从其他健康的捐献者身上获取免疫细胞，捐献者和接受者在HLA（人类白细胞抗原）匹配度方面需要具备较高的相似性。
第二步：免疫细胞处理一旦免疫细胞捐献完成，就需要对捐献的细胞进行处理。
首先，对捐献的细胞进行分离和纯化，以去除其他不需要的细胞成分。
这通常使用离心、负选择和阳选择等技术来实现。
其次，对纯化后的细胞进行处理，包括细胞培养、扩增和激活等步骤。
这些处理能够增加细胞的数量，并激活细胞的免疫活性。
第三步：细胞存储经过处理后的免疫细胞需要进行存储，以保证其质量和活性。
细胞存储通常采用液氮冷冻的方法，这种方法可以在极低的温度下将细胞冷冻保存，以延长其存储时间。
在存储过程中，细胞会被放置在专门设计的冷冻容器中，并加入特定的保护剂，以防止细胞受到冻结损伤。
第四步：细胞质量检测为了确保存储的免疫细胞质量良好，需要进行质量检测。
质量检测通常包括细胞活性检测、细胞数量测定、细胞表型分析等。
细胞活性检测可以通过细胞增殖、细胞杀伤和细胞分泌等实验来评估细胞的功能性。
细胞数量测定可以通过细胞计数器或显微镜等设备进行。
细胞表型分析可以通过流式细胞仪来评估细胞表面标记物的表达情况。
第五步：细胞分发和应用经过质量检测后，存储的免疫细胞可以根据需要进行分发和应用。
根据不同的临床需求，免疫细胞可以用于细胞治疗、细胞免疫疗法或免疫细胞疫苗等。
细胞分发和应用需要严格的操作规范和标准化流程，以确保治疗的安全性和有效性。
免疫细胞的分离和保存技术
(1)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本 法分离的淋巴细胞群中B细胞有所 损失。 (2)吸附柱过滤法 将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗 脱下来的主要是淋巴细胞
(3)磁铁吸引法 利用单核细胞具有吞噬的特性， 在悬液中加入羰基铁颗粒，待单核 细胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞 吸至管底，上层液中含较纯的淋巴 细胞群。
2、细胞活力的检测
常用方法是台盼蓝染色法。这种 染料不能透过活细胞正常完整的细胞 膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细 胞膜通透性增高，可使染料进入细胞 而使细胞着色（蓝色）。
1、自然沉降法 外周血， 抗凝，静置约一小时血液 分为三层，上层为血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞 层上面的灰白层为WBC，轻轻吸取此层即可得到富含 WBC悬液，低渗破坏RBC，洗涤即可。
2、聚合物加速沉淀法
常利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖 酐等，将红细胞快速沉降，从而分离出白 细胞。本法的细胞获得率比自然沉降法高。
2、Percoll分层液 是一种连续密度梯度离心分离法， 其主要成分为：硅胶颗粒，其原液密度为：1.135。 可将血液分成四层，从上到下依次是：死亡细胞和 血小板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞和红细胞。
第二节 淋巴细胞及其亚群的分离 1、纯淋巴细胞群的采集 原理：利用单核细胞在37℃和Ca 离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、 塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝 胶的特性，据此建立许多从单个核细 胞中除去单核细胞的方法，以获得高 纯度的淋巴细胞群。
二、外周血单个核细胞的分离 人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075~1.090 血小板：1.030~1.035 单个核细胞包括：淋巴细胞和单核细胞。
分离血细胞常用的分离剂为：Ficoll和Percoll分 离剂 1、 Ficoll分层液 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是 一种单次密度梯度离心分离法。其主要成分为 聚蔗糖(商品名为Ficoll )其密度为1.020。 可将血液分成四层，从上到下依次是：血浆、 单个核细胞、粒细胞和红细胞。
免疫细胞分离及检测技术
第十三章免疫细胞分离及检测技术本章考点1.免疫细胞的分离2.淋巴细胞表面标志的检测3.淋巴细胞功能检测技术4.免疫细胞检测的临床意义第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。
因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。
2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种（1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。
操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。
血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。
唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。
其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
见下图。
图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。
图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷二、淋巴细胞的分离1.纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
食品免疫学 免疫细胞分离和检测技术
丝裂原 抗原
信号转导 DNA复制 基因转录 蛋白合成
形态改变
丝裂原：Con A, PWM, PHA ，佛波脂(TPA)
刺激物 抗原：结核菌素，纯蛋白衍生物, 细菌毒素
超抗原：金黄色葡萄球菌肠毒素
淋巴细胞转化的检测方法
PHA刺激管cpm 均 刺激指数(SI)= 空值白对照管cpm 均值
2.T细胞分泌的细胞因子检测 ELISA 试剂盒,放免试剂盒
3.51Cr释放实验（检测CTL功能）
原理：用Na251CrO4标记靶细胞（如肿瘤细胞），将CTL与 标记的靶细胞共同孵育，靶细胞被杀伤后， Na251CrO4释 放，检测培养上清液中γ射线的强度，反应CTL的功能。
免疫细胞分离和 功能检测
第一节 免疫细胞分离技术
免疫细胞种类
淋巴细胞 :T细胞 B细胞 NK 细胞
单核-吞噬细胞 (树突细胞) 其他细胞 :中性粒细胞
嗜酸性粒细胞 嗜碱性粒细胞 肥大细胞
淋巴细胞 嗜酸性粒细胞
中性粒细胞 嗜碱性粒细胞
外周血中免疫细胞 单核细胞
红细胞 血小板
一、外周血单个核细胞分离 二、淋巴细胞的分离 三、T细胞和B细胞的分离 四、T细胞亚群的分离
采用聚苯乙烯等高分子材料包裹三氧化二铁等金属铁颗粒 形成微球体，微球体表面与抗原、抗体和核酸等生物大分 子结合后，即成为兼有免疫配基和磁性的免疫磁株。
免疫磁株与细胞结合后可采用以下两种方法分离细胞
①磁力架法 ②流式细胞分选法
➢分离细胞的保存与活力测定
1.分离细胞的保存
对保存液的要求：等渗，具pH 缓冲作用，并对细胞无毒性 （Hanks、Tc-199、RPMI 1640 ）。如需短期保存，置4℃ 放置较好，可减低细胞代谢活动。如需长期保存，应放入液氮 罐中在深低温(-196℃)条件下保存细胞。
《免疫细胞存储》课件
目录
• 免疫细胞存储概述 • 免疫细胞的种类与功能 • 免疫细胞存储的方法与流程 • 免疫细胞存储的应用与前景 • 免疫细胞存储的挑战与解决方案 • 实际案例分享
01
免疫细胞存储概述
免疫细胞存储的定义
免疫细胞存储是指将人体内的免疫细 胞，通过特定的技术手段，进行分离 、检测、培养、扩增和储存等一系列 操作，以便在将来需要时进行使用。
再生医学是指利用生物学和工程 学原理来修复、替代或再生人体
组织和器官的技术。
免疫细胞存储可以为再生医学和 组织工程提供高质量的细胞来源
，促进组织再生和修复。
存储的免疫细胞可以与干细胞等 其他类型的细胞共同培养和应用
，促进组织再生和功能恢复。
新药研发与疫苗制备
新药研发和疫苗制备是预防和治疗疾病的重要手段。
免疫细胞存储可以为新药研发和疫苗制备提供实验材料和研究对象，加速新药研发和疫苗制 备的进程。
存储的免疫细胞可以用于研究免疫细胞的生理和药理特性，以及筛选和评估新药和疫苗的效 果和安全性。
05
免疫细胞存储的挑战与解决方案
免疫细胞的活性保持
1 2 3
低温环境
维持免疫细胞活性需要低温环境，一般在-180℃ 左右的液氮中存储，以降低细胞代谢率，延长细 胞存活时间。
封闭式存储
采用封闭式存储容器，避免与外界接触，降低交叉感染的风险。
定期检测
在存储过程中定期对免疫细胞进行检测，及时发现和处理污染源。
提高存储效率与降低成本
优化存储容器设计
通过改进存储容器的设计，提高细胞的装载密度，从而提高存储效 率。
自动化操作
采用自动化技术进行免疫细胞的分离、检测、补充等操作，降低人 工操作的误差和成本。
免疫细胞分离技术
免疫细胞分离技术免疫细胞分离技术是一种重要的生物学和医学研究工具，广泛应用于生物样本中细胞的分离和纯化。
通过利用细胞表面的特异性标记，免疫细胞分离技术可以实现对不同类型细胞的高灵敏度、高特异性的分离。
在免疫学研究领域，免疫细胞分离技术被广泛应用于研究免疫细胞的功能和相互作用，对于深入理解免疫系统的机制具有重要意义。
免疫细胞分离技术的基本原理是利用抗体与特定细胞表面标记结合的高度特异性，通过各种分离方法将该细胞与其他非特异性细胞分离开来。
免疫细胞分离技术通常包括两个关键步骤：抗体与目标细胞的特异性结合和分离纯化。
在抗体结合的过程中，通过将抗体与目标细胞共孵育，使抗体与目标细胞表面标记结合形成抗原-抗体复合物。
而在分离纯化的过程中，可以通过多种方法将抗原-抗体复合物与其他非特异性细胞分离开来，如磁性珠分离、流式细胞仪分离等。
免疫细胞分离技术的关键是选择合适的特异性抗体。
抗体是由机体免疫系统产生的一种高度特异性的蛋白质，具有与目标抗原结合的能力。
在选择抗体时，需要考虑以下几个因素：第一，抗体的特异性；第二，抗体的亲和力和亲和常数；第三，抗体的结合位点；第四，抗体的格式和标记。
合理选择和设计抗体可以提高免疫细胞分离技术的效率和准确性。
在免疫细胞分离技术中，常用的方法之一是磁性珠分离法。
该方法利用表面覆有特定抗体的磁性珠与目标细胞结合，通过磁外场将目标细胞分离出来。
磁性珠分离法具有分离效率高、操作简便、适用范围广等优点，被广泛用于体外培养细胞、临床诊断和基础研究等领域。
另一种常用的免疫细胞分离技术是流式细胞仪分离法。
流式细胞仪是一种高速流动和高灵敏度激光共聚焦技术，可以对单个细胞进行多参数检测和鉴定。
在流式细胞仪分离中，通过合适的荧光染料或荧光标记抗体，结合流式细胞仪对细胞进行定量、快速分析和筛选。
流式细胞仪分离技术具有分离速度快、高通量、对样本体积要求小等优点，广泛应用于细胞表型分析和免疫学研究。
除了磁性珠分离法和流式细胞仪分离法，还有其他依赖于抗体与抗原结合的分离方法，如免疫磁珠分离法、免疫离心法、免疫亲和层析法等。
免疫细胞储存注意事项
免疫细胞储存注意事项免疫细胞储存是一项重要的医学技术，可以用于治疗各种免疫相关疾病。
在进行免疫细胞储存时，有一些注意事项需要遵守，以确保免疫细胞的质量和有效性。
本文将介绍免疫细胞储存的注意事项，帮助大家了解如何正确进行免疫细胞储存。
选择合适的免疫细胞来源非常重要。
常见的免疫细胞来源包括自体外周血、自体骨髓、脐带血等。
在选择免疫细胞来源时，需要考虑细胞数量、质量和适应病情的能力。
同时，要确保细胞来源的合法性和安全性，避免使用非法来源或未经授权的免疫细胞。
免疫细胞采集和处理过程需要严格遵守规范操作程序。
采集前，应对采集器械进行消毒和验证，确保无菌状态。
采集过程中，要遵守无菌操作规范，避免污染。
采集后，要立即将免疫细胞送至实验室进行处理，避免细胞质量的损失。
第三，免疫细胞的储存条件也需要特别注意。
一般来说，免疫细胞应在低温下存储，以确保其长期保存的有效性。
常见的储存温度为-196摄氏度，使用液氮罐进行冷冻保存。
在储存过程中，要确保储存容器的密封性和温度稳定性，避免细胞质量的损失。
免疫细胞的储存时间也需要注意。
不同类型的免疫细胞在储存过程中的耐受性不同，有些细胞可以长期保存，而有些可能只能保存数天。
因此，在储存前要了解免疫细胞的特性和耐受性，避免储存时间过长导致细胞功能的下降。
在进行免疫细胞储存时，要确保储存记录的准确性和完整性。
储存记录应包括细胞来源、采集和处理过程、储存条件等信息，以便日后查询和使用。
同时，要建立健全的储存管理制度，定期检查储存设备和细胞质量，确保储存的可靠性和稳定性。
免疫细胞储存过程中的风险也需要关注。
尽管免疫细胞储存是一项成熟的技术，但仍存在一定的风险。
在进行免疫细胞储存前，要对可能的风险进行评估和管理，确保储存过程的安全性和可控性。
免疫细胞储存是一项重要的技术，可以为免疫相关疾病的治疗提供有效手段。
在进行免疫细胞储存时，需要注意免疫细胞来源的选择、采集和处理过程的规范操作、储存条件的控制、储存时间的限制、储存记录的准确性和完整性，以及可能存在的风险。
免疫细胞分离技术(终)
尼龙毛分离法
• 原理：本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼 龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。 • 操作方法：取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺 纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管 （饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个 核细胞悬液加入柱内，放37℃温箱静置1～2h。用 预温的含10％～20％小牛血清培养液灌洗，洗脱 液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管 内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤 压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。 • 优点：如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞 纯度可达80％。
Percoll 分层液法
• Percoll分离液法是一种连续密度梯度离心分 离法。 • Percoll 是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理 的硅胶颗粒，对细胞无毒性。Percoll 液经高 速离心后可形成一个连续的密度梯度，不 同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区 带，从而将密度不等的细胞分离纯化。
• 操作：在单个核细胞悬液中加直径为3μm的 羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动， 待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁 铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋 巴细胞。
2013-5-23
（三）淋巴细胞亚群的分离
• 原则：根据相应细胞的特性和不同的标志 加以选择性纯化； • 阳性选择法：凡根据细胞的特性和标志选 择纯化所需细胞的方法；
分离过程
• （1）分层液置试管底层 • （2）肝素抗凝全血以Hanks 液或PBS 液作适 当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两 者形成一个清晰的界面 • （3）水平式离心 • （4）不同层次的液体和细胞带 • （5）吸取单个核细胞层
Ficoll 分层液法
• 分离成品：淋巴细胞 单核细胞 • 分离纯度：95%左右，其中淋巴细胞约占 90%~95%
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。
有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。
分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。
一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。
本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。
（一）Ficoll分层液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。
聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。
高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L 的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。
国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。
分离人外周淋巴细胞以密度为 1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076～1.090之间。
而不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为1.090。
分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。
水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（图20-1）。
红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。
血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
（二）Percoll分层液法这是一种连续密度梯度离心分离法。
Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。
利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。
用Percoll原液(密度1.135)与约等量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合，高速离心后，使分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上，低速离心后，便得四个细胞层。
表层为死细胞残片和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单个核细胞(75％)，下层富含淋巴细胞(98％)(图-2)。
该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各较好的方法，但操作流程较长，手续较多。
图-2 连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图三、淋巴细胞及其亚群的分离为研究免疫细胞的功能，常需高纯度的淋巴细胞或其亚群，分离方法介绍如下。
（一）、纯淋巴细胞群的采集通常利用单核细胞在37℃和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞悬液中去除单核细胞的方法，藉以获得高纯度的淋巴细胞群。
（1）粘附贴壁法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。
因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。
（2）吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。
此法简单易行，对细胞极少损害。
（3）磁铁吸引法利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3μm 的羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。
（二）、淋巴细胞亚群的分离分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫检验的基本技术。
其原则是根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。
凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法；而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞是为阴性选择。
常用以下几种方法：（1）E花环沉降法本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。
浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。
（2）尼龙毛分离法本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。
操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置1～2h。
用预温的含10％～20％小牛血清培养液灌洗，洗脱液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。
再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B 细胞。
如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞纯度可达80％。
（3）亲和板结合分离法利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取（图-3）。
同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。
淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。
如要分离CD4+或CD8+细胞，则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。
用抗Ig抗体则可分离B细胞。
同样，用活化的C3包被，可分离出有C3受体的细胞。
图-3 亲和分离法图解（4）荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS）主要由4部分组成：①细胞流动系统及气压流速控制系统，②激光系统，③检测与讯号处理系统，④细胞分选系统。
其主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。
当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴（40000个/s），每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。
如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、B细胞要其亚群），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管（图-4）。
用FACS分离细胞准确快速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行，但仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段。
图-4 荧光激活细胞分离仪简图四、吞噬细胞的分离和收集人外周血中单核－巨噬细胞可通过Pecoll密度梯度分离法获取，但数量较少，用血量多。
用斑蝥敷贴法可从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞，不需作进一步体外分离，细胞量损失较少。
该法是用滤纸蘸取10％中药斑蝥酒精浸出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4～5h后皮肤局部充血，48h后局部形成水疱，吸取疱中的组织液，内含巨噬细胞。
但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染，应慎用。
欲获取小鼠、大鼠、豚鼠等小动物的巨噬细胞，可经腹腔内注入少许石蜡油，3～4天后冲洗出腹腔渗出液，所得细胞悬液中70％～80％为巨噬细胞。
五、淋巴细胞的保存和活力测定（一）、分离细胞的保存在某些情况下，分离所得细胞需要加以保存，否则活力迅速下降，甚至死亡。
（1）短期保存技术将分离到的细胞用适量含10％～20％灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。
所用培养液要求等渗，具缓冲作用，并对细胞无毒性。
通常置4℃保存较好，可减低细胞代谢活动。
要注意不要迅速改变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克。
（2）长期冷冻保存技术利用液氮深低温（－196℃）环境保存细胞，是当前世界上通用的细胞长期保存技术。
其原理在于深低温环境可中断细胞的代谢，但在降温过程由于冰晶的形成和渗透压的改变均可导致细胞的损伤和部分死亡，所以在冷冻过程中一定要加用冷冻保护剂，常用的保护剂为二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。
冷冻时的降温速度和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很大影响。
条件合适时，冻存细胞一旦复苏，恢复37℃培养，其形态和代谢活动均可恢复正常。