生物技术课件课后思考题整理

1.基因（gene）: DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质最小功能单位。基因组（geneome）: 一个生物体的全部基因序列。基因表达（gene expression）遗传信息转录和翻译的过程。

2.基因工程（gene engineering）:运用限制酶、连接酶等将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA，再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。(重组转化体阳性克隆)

3.基因工程理论基础：（1）Avery等的肺炎球菌转化试验证明了生物的遗传物质是DNA；（2）Watson和Crick发现了DNA分子双螺旋结构及DNA半保留复制机理；3）Crick确立了遗传中心法则，即生物体中遗传信息是按DNA→RNA→蛋白质方向进行传递。

技术基础：限制酶；DNA连接酶；基因载体

4. 限制性内切核酸酶：简称限制酶，指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶。Ⅱ型限制酶的作用方式：双链平齐末端；单链黏性末端；单链黏性末端；限制酶的主要用途：构建基因文库；建立DNA 分子的限制酶图谱；用限制酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA；

DNA甲基化酶：简称甲基化酶，指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶。

5. DNA聚合酶：依赖于DNA的DNA聚合酶；依赖于RNA的DNA聚合酶（即逆转录酶）；末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）。

⑴大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）：具有三种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物；②5’→3’外切核酸酶活性，从5’端既降解双链DNA，也降解RNA-DNA杂交体中的RNA链（RNA酶H活性）；③3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。主要用于：①以切刻平移法标记DNA；

②对DNA分子的3’突出尾进行末端标记。

⑵大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）：5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物；3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。

⑶Taq DNA聚合酶：具有一种活性：5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA 为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。主要用于：①对DNA进行测序；②通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增。

⑷逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）：具有两种活性：①5’→3’DNA 聚合酶活性，以RNA或者DNA为模板，以带3’自由羟基的RNA或DNA 片段为引物;②RNA酶H活性，即5’→3’外切核糖核酸酶活性，特异地降解RNA-DNA杂交体中的RNA。逆转录酶无3’→5’外切核酸酶活性，即无校对功能，其催化的聚合反应容易出错。

⑸末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）：具有一种活性：即末端转移酶活性，在二价阳离子存在下，其催化dNTP加于DNA分子的3’-羟基端。主要用于：①给载体DNA或cDNA加上互补的同聚尾; ②以32P标记的一种dNTP或一种rNTP来标记DNA片段的3’端。

6.质粒（plasmid）：指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能自我复制的遗传物质。质粒DNA的提取：对数晚期。质粒的分类：①严紧型复制控制质粒:与宿主染色体复制同步，并与宿主蛋白质合成有关，而与DNA聚合酶Ⅰ活性无关。如果宿主蛋白质合成终止，质粒与宿主染色体复制也停止。每个宿主细胞中只能达到1至数个拷贝。②松弛型复制控制质粒:与宿主染色体复制不同步，其与DNA聚合酶Ⅰ活性有关，而与蛋白质合成无关。当宿主蛋白质合成终止时，质粒仍可复制。每个宿主细胞中的质粒拷贝数可达10～200个。③质粒pBR322：优点：分子质量小；具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记；较高的拷贝数。④pUC质粒载体：优点：分子质量更小、拷贝数更高；适用于组织化学方法检测重组体；有多克隆区位点。

7. DNA检测－凝胶电泳：在生理条件下，核酸分子之间糖－磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态。当核酸分子被放置在电场中时，它们会向正电极方向迁移。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，它们能以同样的速度向正电极方向移动，即电泳的迁移率，取决于核酸分子自身的大小和构型。

琼脂糖凝胶电泳特点：（1）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，当其加热到沸点冷却凝固会形成良好的电泳介质，其密度由琼脂糖的浓度决定；（2）经过化学修饰的低熔点（LMP）的琼脂糖，在结构上比较脆弱，低温下熔化，可用于DNA片段的制备电泳。LMP可不经过电洗脱或破碎凝胶，用来回收DNA 分子；（3）无毒，凝胶过程中不需要催化剂、加速剂，不会发生自由基聚合；（4）分辨率: 0.2～50kb。

8. 多聚酶链式反应（PCR）技术：基本原理：在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，利用DNA聚合酶催化合成反应，体外扩增特异DNA片段；能够指导特定DNA序列的合成；使特定DNA区段得到了迅速大量的扩增。

每个循环包括3步：变性，通过加热至一定温度使双链DNA两链间的氢键断裂，DNA双链离解形成两条DNA单链；复性（退火），当反应体系温度突然降低时，由于模板DNA分子的结构比引物DNA分子复杂得多，而且在反应体系中引物的量大大多于模板，因此引物和与其互补的模板配对形成局部杂交双链，而变性后离解形成的两条模板DNA单链之间互补配对的机会则较少；延伸，在4种脱氧核糖核苷三磷酸底物、Mg2+等存在的条件下，Taq DNA聚合酶以模板－引物杂交体分别为模板和引物催化DNA链沿5’→3’方向合成延伸。每个循环的扩增产物作为下一循环的模板。

PCR的操作体系和反应条件：①反应条件：94℃变性30s；55℃复性30s；70～72℃延伸30～60s。一共进行30轮左右的循环。②模板：待测的核苷酸（DNA或RNA）分子；双链DNA可直接用于反应，而RNA则需要用反转录酶反转录成为cDNA，然后用作聚合酶反应的模板。③DNA聚合酶：最初采用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段或T4 DNA聚合酶催化。由于每轮反应需要三个温度点，因此采用耐热TaqDNA聚合酶。④一对引物。人工合成的、长度通常为20～24个核苷酸。⑤四种三磷酸脱氧核苷（即dNTP），是合成DNA所需的原料。⑥适当的缓冲液体系。用于PCR的标准缓冲液内一般含：50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl（pH8.3，室温）、 1.5mmol/L MgCl2。

9.已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列，基因的制备方法主要分为两大类：一类是基因化学合成法（主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸酰胺法等。磷酸二酯法是最初发明的化学合成基因的方法，而固相亚磷酸酰胺法是目前绝大部分DNA自动合成仪所使用的方法），一类是基因生物制备法。一般又可将基因生物制备法分为基因组文库法（基因工程中，将某种生物全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因组遗传信息的材料，称为基因组文库）、cDNA文库法（指汇集以某种生物体成熟mRNA为模板逆转录而成cDNA序列的重组DNA群体。在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。）和PCR法（一般经典的PCR法可用于已知核苷酸序列核酸片段的特异扩增；而一些改进的PCR法可用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特异扩增）等。

10. 目的基因和载体的连接分为黏性末端连接、平末端连接、人工接头连接和同聚物加尾连接。

11.根据受体生物，一般可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法和动物细胞转化法。转化（transformation）：将重组质粒导入受体细胞，使受体菌遗传性状发生改变的方法。转染（transfection）: 将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法。

12. 重组转化体的筛选：（一）利用表型特征进行筛选：表型：指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。利用载体提供的表型特征进行筛选：（1）抗药性标记基因插入失活筛选法；（2）β－半乳糖苷酶显色反应筛选法。（二）利用噬菌斑的形成进行筛选：（1）以λ噬菌体载体与外源DNA 构建的重组体筛选主要依赖于重组体的大小及形成噬菌斑的能力；（2）重组体DNA只有在为野生型λ噬菌体DNA的75%～105%的长度时，才能在培养平板上形成清晰的噬菌斑，而载体DNA自身不会包装成活的噬菌体颗粒。

13. 基因工程的大肠杆菌载体有哪些，各有什么特点？

载体（vector）的特点：①携带外源基因进入受体细胞的运载工具。②能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性。③易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。

④DNA序列中有适当的限制酶位点，最好是单一酶切位点，并位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA 的复制。⑤具有能够观察到的表型特征，在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。

14.查阅资料，综述基因工程技术在食品工业中的应用？

一、利用基因工程改造食品微生物：（一）改良微生物菌种，此外，食品生产中所应用的食品添加剂或加工助剂也可以采用基因工程菌发酵生产而得到；（二）改良乳酸菌遗传特性：抗药基因，风味物质基因，产酶基因，耐氧相关基因，产细菌素基因；（三）酶制剂的生产：转基因微生物生产酶的优点：产量高、品质均一、稳定性好、价格低等。在食品加工过程中，通过添加一些酶类，可以改善产品的色泽、风味和质构；

二、利用基因工程改善食品原料的品质：（一）改良动物食品性状；（二）改造植物性食品原料：1、提高植物性食品氨基酸含量；2、增加食品的甜味；

3、改造油料作物；

4、改良植物食品的蛋白质品质；

5、改善园艺产品的采后品质；

三、利用基因工程改进食品生产工艺：（一）利用DNA重组技术改进果糖和乙醇生产方法：1、利用微生物培养技术，大量生产所需的酶；2、利用α-淀粉酶的高温突变体进行“高温”生产；3、改变编码α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的基因，使它们具有同样的最适温度和最适pH值，使液化、糖化在同一条件下进行，减少生产步骤，降低生产成本； 4、利用DNA重组技术获得能够直接分解粗淀粉的酶；5、寻找或人工“创造”一种分泌葡萄糖淀粉酶发酵微生物；（二）改良啤酒大麦的加工工艺；（三）改良小麦种子贮藏蛋白的烘烤特性；（四）改善牛乳加工特性；

四、利用基因工程生产食品添加剂及功能性食品：（一）生产氨基酸（二）生产黄原胶（三）超氧化物歧化酶(SOD)的基因工程。

1.酶工程:利用酶、菌体细胞具有的特异催化功能，或对酶结构进行修饰改造，并借助于生物反应器和工艺优化过程，有效地发挥酶的催化特性来生产人类所需产品的技术。它包括酶、细胞固定化技术、酶化学修饰技术和酶反应器设计等。酶分类:：氧化还原酶；转移酶；水解酶；裂合酶；异构酶；连接酶（合成酶）。

2. 提取和纯化方法：（一）根据酶分子溶解度不同的方法：包括盐析沉淀法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，复合沉淀法；（二）根据酶分子大小和形状不同的方法：包括离心分离法，体积排阻法，透析，超滤；（三）根据酶分子电荷性质的方法：包括离子交换层析，电泳分离，等电聚焦电泳（四）根据酶分子专一性结合的分离方法：包括亲和层析，免疫吸附层析。

3. 酶活力是酶催化反应的能力，用酶活单位表示；在酶的纯化过程中常表示酶的回收率。比活力：每毫克酶蛋白具有的酶活力单位数。一般情况下，酶的比活力随酶的纯度的提高而提高。酶的纯度也可用酶的比活力来衡量。4．酶的固定化方法：Ⅰ吸附法：（1）物理吸附法；优点：具有不破坏酶活性中心和酶高级结构变化少，若能找到适当的载体，这是简单的好方法。缺点：酶与载体结合力弱、酶易脱落等；（2）离子吸附法，优点：操作简单，处理条件温和，能得到酶活回收率较高的固定化酶。缺点：酶与载体的结合力较弱，当离子强度高、缓冲液种类或pH值发生变化时，酶容易脱落。Ⅱ化学结合法：（1）共价结合法，特点：反应条件苛刻，操作复杂，容易使酶的高级结构发生变化而破坏活性中心，操作时需注意。（2）共价交联法，特点：反应条件比较激烈，固定化酶的活力回收率较低，但尽量降低交联剂浓度和缩短反应时间，会有助于固定化酶比活力的提高。Ⅲ.包埋法：可分为凝胶网格型和微囊型，优点：一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起结合反应，较少改变酶的高级结构，酶活力的回收率较高。缺点：仅适用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子物质才能扩散进入高分子凝胶的网格，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变和酶活力的降低。（1）凝胶网格型，缺点：凝胶孔径不规则，有一部分大于平均孔径，时间稍长时，酶容易泄漏。常与交联法结合达到加固的目的。（2）微囊型，缺点：反应条件要求高，制备成本高。

5. 固定化酶（细胞）的性质：①酶活力的变化，②酶稳定性的变化，③最适pH值的变化，④最适温度的变化，⑤动力学常数的变化。

固定化酶（细胞）的评价指标：①相对酶活力：具有相同重量酶蛋白的固定化酶与游离酶活力的比值。它与载体结构、颗粒大小、底物相对分子质量及酶的结合效率有关。相对酶活力低于75%的固定化酶，一般无实际应用价值。

②酶的活力回收率：固定化酶的总活力与用于固定化的酶总活力的百分比。一般情况下，活力回收率应小于l。

6. 酶工程在食品工业中的应用：（一）淀粉糖加工：1.α-淀粉酶（EC3.2.1.1）；淀粉内切酶，能随机水解直链或支链淀粉分子α-1,4-糖苷键生成不同长度的寡糖，液化淀粉速度快，最终产物为α-极限糊精和少量的葡萄糖及麦芽糖。

2.β-淀粉酶（EC

3.2.1.2）；一种淀粉外切酶，在淀粉链非还原性末端水解α