红曲酯化酶促反应及其代谢产物特征

红曲酯化酶促反应及其代谢产物特征
陈帅;郑佳;刘琨毅;彭昱雯;黄钧;易彬;赵金松;周荣清
【摘要】The research on kinetics and metabolism of esterification catalyzed by Monascus esterifying enzymes were carried out with hexanoie acid and ethanol as substrates. The results showed that the consumption
of hexanoie acid subsequently grew steadily after the initial stage from 0 - 8h in which it increased rapidly along with the reaction time,and then reached a balance after 24 h. Inhibition was noted by excessive ethanol,
but relieved partially when concentration of hexanoic acid increased. Among 15.81 -142.31 mmol/L of hexanoic acid concentration,single sub- strate reaction was identified by positive linear relation between initial velocity and concentration of hexanoie acid. The crude Monascus esterifying preparation contained various enzymes so that the empirical model could only be estab- lished according to experiment results, which could better express the kinetics characteristic of the reaction catalyzed by the crude enzyme. Ethyl hexanoate was the main product, followed by ethyl caprylate,ethyl lionleate,ethyl oleate, ethyl palmitate and phenylacetaldehyde. The results of OAV analysis indicated that esterification catalyzed by crude Monascus esterifying preparation was appropriate for improving the quality of Chinese liquor and other products.%以己酸和乙醇为底物，研究了红曲霉粗酶催化反应的动力学规律及其
影响条件。

研究结果表明，己酸的消耗量在0～8h内迅速上升，随后则缓慢上升，反应24h后，趋于平衡。

过量的乙醇对反应有抑制作用，但随着已酸浓度的提高
被部分解除。

当己酸浓度在15．81—142．31mmol／L，反应初速率与其浓度呈现良好的正相关性，可视为单底物反应。

红曲霉粗酶含多种酶类，酶促酯化反应机理颇为复杂，其动力学关系受多种条件控制，依据试验结果建立的经验数学模型能较好地表征其粗酶酶促反应动力学特征，催化形成的主要产物为已酸乙酯，其次为辛酸乙酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯、棕榈酸乙酯和苯乙醛，其OVA分析的结果表明，该类酶促反应的产物适合白酒等产品风格的改善。

【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2012(038)002
【总页数】5页(P47-51)
【关键词】酶促酯化反应;动力学模型;复合酶;己酸乙酯
【作者】陈帅;郑佳;刘琨毅;彭昱雯;黄钧;易彬;赵金松;周荣清
【作者单位】四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;国家固态酿造工程技术研究中心,四川泸州646000;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065;四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都610065／四川大学轻纺与食品学院,四川成都610065／国家固态酿造工程技术研究中心,四川泸州646000
【正文语种】中文
【中图分类】TQ463.2
红曲霉属于真菌界、子囊菌门、真子囊菌纲、散子囊菌目、红曲菌科、红曲菌属［1］，因其在生长代谢过程中能产生各种生理活性物质，比如Monacolin K ［2］、红曲色素［3］、酯化酶［4］等，已被广泛应用于食品、医药等众多领域［5］。

以糙米为原料，接种红曲霉后发酵而制成的红曲作为增色增香剂已广泛应用于诸如香肠、酿酒、食醋等食品生产。

迄今，国内外的研究主要集中在聚酮类次级代谢产物上，例如李雪梅等［6］阐述了红曲色素、Monacolins类化合物等代谢物的分离、化学结构及生物活性等方面的研究概况;Mukherjee等［3］分离纯化出一种新型的具有食用及医用价值的红曲色素;Hajjaj等［7］通过对红曲色素代谢动力学的研究认为其代谢受一种在厌氧环境下大量积累的未知化合物的抑制。

红曲霉酯化酶在白酒酿造中具有重要的作用［8－9］，主要作为增香剂提高白酒中的主体呈香呈味物质进而改善白酒品质，但对作用机理及代谢产物形成特点的报道甚少，例如王牛牛等［10］通过响应面法优化得到了红曲酯化酶催化合成乳酸乙酯的最佳催化条件;任道群等［11］对红曲霉的4种代谢产物进行了定量分析。

本论文描述了红曲粗酶催化的己酸和乙醇的酶促动力规律和反应条件的影响，并建立了相应的动力学模型，应用气-质联用(GC-MS)定量地检测了反应产物的形成特征，其研究结果对红曲酯化酶在白酒酿造过程中的应用具有理论指导意义。

1.1 材料与仪器
1.1.1 微生物菌株
红曲霉:AS 3.972，购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.1.2 主要试剂及仪器
正己酸、无水乙醇、NaOH、无水乙醚、无水Na2SO4(分析纯);定量标准品:2-辛醇、辛酸，购自Aladdin公司;糙米，购自本地农贸市场。

PHS-3C精密酸度仪，上海大浦仪器厂;78-1磁力搅拌器，江苏省金坛市医疗仪器厂;DHP-9162电热恒温培养箱，上海一恒医疗器械厂;Trace GC Ultra DSQⅡ气
相质谱联用仪，美国Thermo Fisher公司。

1.2 培养基
1.2.1 麦芽汁培养基
麦芽糖度10°Brix，琼脂2%。

1.2.2 种子培养
500 mL三角瓶中装入25 g蒸至无白心的糙米，用10 mL 3%的醋酸液洗脱斜面
培养基上的菌丝，接入1 mL菌悬液，于(32±0.2)℃培养。

以上培养基均在121℃下灭菌20 min备用。

1.3 实验方法
1.3.1 红曲霉酯化酶的制备
式中:m为红曲质量，g;C1为NaOH浓度，mol/L;V2为NaOH消耗体积;C2为
H2SO4浓度，mol/L;V2为H2SO4消耗体积，mL;V总为馏出液总体积，mL。

1.3.4 反应底物己酸的消耗动力学
取3个250 mL锥形瓶，分别加入5 g红曲粉(酯化力为42.38 mg/g)、1 mL正
己酸和99 mL 10%、20%、40%乙醇溶液密封后，置于(32±0.2)℃，间隙取样测定其反应液中己酸的残留量。

反应初速率测定:测定反应1 h、2 h、4 h时的己酸
消耗速率，通过线性拟合建立动力学方程。

1.3.5 反应产物组分测定
参考文献［14］所述方法，取50 mL反应终了样品置于250 mL具塞圆底烧瓶中，加入50 mL无水乙醚及定量标准品(2-辛醇、辛酸)，调节pH值至10～12，反复振荡20 min，静置，经分液漏斗分液得到有机相，重复提取2次，合并有机相命名为extraction 1;将50 mL无水乙醚加入到水相中，调节pH值至1～2，反复振荡20 min，静置，经分液漏斗分液得到有机相，重复提取2次，合并有机相命名
为extraction 2。

向2种收集液中分别加入5 g无水NaSO4过夜，过滤，在冰浴中经氮气吹扫仪浓缩至0.5 mL。

随后采用配备有 TR-5MS(30.0m ×320 μm
×0.25 μm)的Trace GC Ultra DSQⅡ气相质谱联用仪定量检测其组分。

操作条件:进样口温度:250℃;升温程序:40℃保持5 min，以5℃/min升温至200℃，保持5 min;质谱条件:离子源温度:250℃;电离方式:EI;电子强度:70 eV;扫描范围:35～
400amu。

1.4 数据处理
利用Origin 7.5对红曲酶促酯化反应的动力学模型、影响条件以及代谢产物特征
进行分析;利用SPSS 17.0对反应初速率r与己酸初始浓度c的关系曲线进行显著
性分析。

2.1 反应底物己酸的消耗动力学
在过量乙醇存在的条件下，红曲霉酯化酶(酯化力为42.38 mg/g)催化的1%(V/V，下同)己酸的消耗动力学如图1所示。

己酸浓度保持不变，乙醇浓度从10%增加到40%，96h内的变化趋势是类似的。

在0～8h的初始阶段，随着反应时间的增加，反应中的己酸含量迅速降低。

反应进行到8h时，己酸的含量从79.06 mmol/L分别降低到58.89、61.95、72.27 mmol/L。

继续进行酶促反应，到24h时分别降
至60.61、61.57、71.89 mmol/L。

然而再增加反应时间，反应液中己酸浓度基
本保持稳定，反应进行到96h，己酸的含量分别是57.17、59.85、72.08
mmol/L。

试验结果表明，在乙醇过量的条件下，己酸主要是在0～8h的反应阶
段被转换，且受乙醇浓度的影响较大。

乙醇浓度越高，被消耗的己酸则越少。

当乙醇浓度从10%增加到40%，乙醇和己酸的酯化反应可能从酶促转换为非酶促反应，高浓度的乙醇导致蛋白质变性是导致己酸消耗速率降低的主要因素，因为蛋白质变性致使酯化酶活力降低［15］。

此外，乙醇在水溶液中的高溶解性质，过量的酰
基受体与酶形成的可逆结合物难以转换为产物也是致使其酶促反应速率降低的原因
［16］。

分别使反应液中的乙醇浓度为10%和30%，改变己酸浓度使其浓度分别为0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%，添加酯化酶(酯化力为42.38mg/g)密封后，置于(32±0.2)℃的条件反应，测定其消耗速率，以lg1/r对lg1/c作图(图2)，线性回
归得10%(A)乙醇浓度时，己酸初始浓度与初始消耗速率的经验方程
为:lg=1.35×lg－0.22(R2=0.997 7，P=0.019＜0.05)，而在30%(B)乙醇浓度的
反应体系中，己酸初始浓度与初始消耗速率的回归方程
为:lg=1.07×lg+0.52(R2=0.990 0，P=0.007 ＜0.01)，其反应方程反映乙醇浓度增加，体系中非酶促反应作用增加(截距从－0.22增加到0.52)。

比较10%和30%乙醇浓度反应体系，己酸浓度对反应速率的影响表明(图3)，增加己酸浓度，反应
速率均增大，前者随其浓度增大而线性增大且增幅较大，但后者因乙醇抑制酶促反应而增幅减小，提高反应初始阶段的己酸浓度，增大了醇酸转换为酯的非酶促反应速率，所以表观反应初始速率升高，与已报道的研究结果是相吻合的［17－18］。

然而大幅提高己酸浓度，虽然可使非酶促反应速率提高，但反应体系pH过低，抑制了酶促反应速率，从而使表观反应速率降低。

所以基于红曲粗酯化酶催化的乙醇与己酸的酯化反应条件待进一步优化。

2.2 基于GC-MS的红曲酯化酶酶促反应代谢产物的定量分析
1%己酸和10%乙醇经红曲酯化酶在(32±0.2℃催化下分别反应1 h、24 h和96 h，经LLE-GCMS检出的反应物总离子流图(TIC)分别如图4中a(1 h)、c(24 h)、
e(96 h)所示，而 b、d、f则是其相同条件下的非酶促反应的总离子流图。

与非酶促反应的结果比较(表1)，酯化酶显著地提高了乙醇和己酸转化成酯类物质
的效率。

在不同酶促反应物中检出的酯类组分中，苯甲酸乙酯和辛酸乙酯两种馏分比非酶促反应分别降解23.56%～85.52%和2.27% ～76.52%，检出其余9种酯
类馏分均有所提高。

在观察的酶促反应过程中(0～96 h)，己酸甲酯、己酸、棕榈
酸、亚油酸和油酸的乙酯均呈现先递增后递减的变化规律，且较非酶促反应分别提高了2.30～3.16倍、12.51～23.64倍、6.41～71.37倍、2.25～44.43倍和
6.58～139.14倍。

肉豆蔻酸乙酯和5-甲基-十七烷酸乙酯在反应初始阶段(1 h)含量较高［(1.80±0.37)mg/L和(8.11±1.46 mg/L)］，延长反应时间(96 h)，前者基本稳定(1.11±0.18 mg/L)，而后者降低幅度较大［(6.60±1.35)mg/L，降幅18.62%］。

醋酸丁酯经过较长时间的酶促反应仅有少量增加［0～
(0.50±0.06)mg/L］。

在检出的4种醛类组分中，3-呋喃甲醛呈单调增、苯乙醛呈非单调增的变化规律，而葵醛、十一醛是呈单调减的变化规律。

检出的2个酮类组分则均呈减少的趋势。

棕榈酸则呈单调减、苯乙醇呈单调增的变化规律。

不同反应时间所检出的酶促反应产物的组成特点表明，酶促反应主要是催化脂肪酸和乙醇的酯化反应，其产物以乙酯衍生物为主，其中己酸乙酯的比例较大，其代谢产物呈现多样性，而非仅催化己酸乙酯的形成［11］。

经24h酶促催化，己酸乙酯的含量达到(624.40±7.00)mg/L，但在催化 96 h后则降至
(367.70±22.10)mg/L。

实验结果揭示，基于红曲酯化酶催化的己酸与乙醇的酯化反应是可逆的，随着催化时间的延长，其产物己酸乙酯被水解，此外在其复合酶的作用下朝着生成其他产物的方向进行，导致代谢产物呈现多样性。

检出的酶促催化产物多为浓香型白酒的呈香、呈味组分，所以应用红曲霉酯化酶强化酯化作用有益产品质量的提高。

2.3 红曲代谢产物的OAV分析［19－21］
通常采用气味活度值(OAV，也称香味强度，等于挥发组分的浓度/阈值)评价风味组分对样品风味的贡献度。

OAV＜1，说明该挥发组分对总体风味无实际作用，而OAV＞1，则直接影响其总体风味，且在一定范围内，OAV与该物质对总体风味的贡献度呈正相关关系。

对酶促酯化反应检出的11种特征性香味组分进行OAV分析的结果表明(图5)，己
酸乙酯(阈值5ug/L)的OAV值最大(＞70 000)，其次分别是辛酸乙酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯、棕榈酸乙酯和苯乙醛，这佐证了应用红曲霉酯化酶强化酯化作用有益产品质量提高的合理性。

值得注意的是，虽然酶促催化作用大幅提高了棕榈酸乙酯的含量［(29.06±3.22)mg/L)，但其阈值较高(14 000 μg/L)］，所以总体对浓
香型白酒的风格影响不显著，辛酸乙酯的含量增幅低(0.27±0.03)～
(1.35±0.13)mg/L，但其阈值较低(2 μg/L)，OAV较大，所以对白酒风格影响仅
次于己酸乙酯，应通过酶促催化条件的优化，控制该组分的含量及与己酸乙酯的比例，以确保催化产物在提高浓香型白酒风味上的有效性。

(1)红曲霉酯化酶催化乙醇和己酸的酯化反应，主要产物是有机酸的乙酯衍生物，
己酸乙酯是比例最大的酯类组分，产物多样性与催化条件有关。

各种组分的含量也随时间的变化呈现多样性的变化规律。

底物乙醇和己酸均对酶促反应速率存在抑制，在一定浓度范围，可以通过适当提高其中一种底物解除另一种底物的抑制作用，尤其是乙醇过量时，初速率仅取决于己酸浓度，与其浓度之间呈现良好的正相关性，其表观反应速率呈一级反应。

在0～24 h以酯化反应为主，在24～96 h，仅有少量酯类组分形成，多数酯类组分被水解而被转化为其它衍生物，导致反应产物呈现多样性。

(2)LLE/GC-MS已检出的酶促代谢产物的定量分析及OAV分析结果表明，形成的产物中己酸乙酯对风味贡献最大，其次为辛酸乙酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯、棕榈酸乙酯和苯乙醛。

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【相关文献】
1.3.2 酯化反应液中己酸含量的测定
酸碱滴定法［12］。

1.3.3 红曲酯化力的测定
参考红曲酯化力测定方法［13］。

250 mL圆底烧瓶中，加入5 g红曲粉，99 mL体积分数为20%的乙醇，1 mL正己酸，(32±0.2)℃酯化100 h。

酯化结束后，加入蒸馏水50 mL，缓火蒸馏出
100 mL馏出液。

取50 mL馏出液于250 mL三角瓶中，用0.1 mol/L NaOH(C1:0.1 mol/L)中和后再加入25 mL 0.1 mol/L NaOH(C1:0.1 mol/L)，冷凝回流皂化30 min，皂化结束后立即冷却，用H2SO4溶液(C1:0.05 mol/L)滴定至pH 7.0。

计算公式:。