第二节_动物性食品中大肠菌群的检验

第二节 食品中大肠菌群的检验
一、实验目的
1. 了解大肠菌群在食品检验中的意义。
2. 掌握检验的程序和步骤。 3. 通过MPN检索表的检索得出实验结果。
二、基本原理
大肠菌群系指一群在32～37℃下24hr内，能发酵 乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性 无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以 此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具 有广泛的卫生学意义。 食品中大肠杆菌群数是以每100mL（g）检样内大 肠菌群最近似数（MPN）来表示，据此含义，所有 食品卫生标准中所规定的大肠菌群数均应为100mL （g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值，为报 告标准。
②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭 菌生理盐水的试管内，混匀，制成1 ：100的稀释液。
③另取1mL灭菌吸管，按②操作依次做10倍递增稀释液，每
稀释一次，换用一支1 mL灭菌吸管。
2）乳糖发酵实验 接种1mL待检样品于乳糖胆盐 发酵管内。接种3个稀释度，每一 稀释度接种3管，置（36土1)℃
2、伊红美蓝琼脂培养基（EMB）
成分：蛋白胨10g、乳糖10g、K2HPO42g、琼脂17g，
2%伊红Y溶液20mL、0.65%美蓝溶液10mL，蒸馏水 1000mL，pH值7.1 制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中， 校正pH值，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备 用；临用时加入乳糖（115 ℃20min）并加热融化 琼脂，冷至50～55 ℃，加入伊红和美蓝溶液）， 摇匀后倾注平板。
三、检测方法
1、牛天贵主编《食品微生物学实验技术》
实验十二 大肠菌群检验 2、GB 4789.3-2010 《大肠菌群计数》 3、大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法
4、美国FDA标准方法（行业标准采用两步
法）：用于对出口食品中大肠菌群进行检验
一、牛天贵主编《食品微生物学实验技术》 实验十二 大肠菌群检验
管，置（36士1)℃恒温箱内培养（24士2) h，
观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏
染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大
肠菌群阳性。
37℃ 培养48h
37℃培养24h
取产酸产气的发 酵管中培养液在 伊红美兰平板上 进行划线
取有核心和 带金属光泽 的深紫色菌 落进行革兰 氏染色
镜检（革兰氏阴性菌）
2、伊红美蓝琼脂培养基（EMB）
现象及原理
大肠杆菌：菌落深紫色，且有 绿色金属光泽；
产酸能力较弱的几种肠道菌：
也有相应的棕色；
不发酵乳糖的肠道菌：菌落是
无色透明的，比如变形菌属， 胨20g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫
水溶液25mL、蒸馏水1000mL，pH值7.4
表2-3
50
0 0 0 0 0
毫升检样接
种1管、10毫
升、1毫升检 样各接种3管 的大肠杆菌 最近似数检
0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
索表
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二、 GB 4789.3-2010 《大肠菌群计数》
pH7.4±0.1
实验步骤及操作要点：
1）样品的稀释：如第一法 2） 平板计数 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个 无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平 皿作空白对照。 3）及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼 脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培 养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培 养18 h～24 h。
4）平板菌落数的选择
选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的 平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大 肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色， 菌落周围有红色的胆 盐沉淀环，菌落直径 为0.5 mm 或更大。
5）证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典 型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管 内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产 气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告 为大肠菌群阳性。
50ml管阳性数
10ml管阳性数
1ml管阳性数
每100ml的 MPN
0
0 0 0 0 0
0
0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3
0
1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0
0
1 2 1 2 3 2 3 4 3 5 6 1 3 4 6 3 5 7 9 5 7 10 12 8
初发酵
分 离 培 养
复发酵（证实试验）
实验操作步骤：
乳糖发酵试验 样品稀释后， 选择三个稀释 度，每个稀释 度接种三管乳 糖胆盐发酵管。 36±1℃培养 48±2h，观察 是否产气。 分离培养 将产气发酵管 培养物转种于 伊红美蓝琼脂 平板上， 36±1℃培养 18-24h，观察 菌落形态。 证实试验 挑取平板上的 可疑菌落，进 行革兰氏染色 观察。同时接 种乳糖发酵管 36±1℃培养 24±2h，观察 产气情况。
第一法：大肠菌群MPN计数法
第二法：大肠菌群平板计数法
第 一 法 ： 大 肠 菌 群 计 数 法
MPN
需要用到的培养基
（1）LST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨
成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL 5.0g，乳糖5.0g，K2HPO4 2.75g，KH2PO4 2.75g， 月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。 制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发
5）复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取
培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤
（BGLB）管中，36 ℃±1℃培养48 h±2
h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群
阳性管。
6）大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按5）确证的大肠菌群LST阳性管数，检 索MPN表（见附录B），报告每g（mL） 样品中大肠菌群的MPN值。
阳性管 10ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1ml 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 0.1ml 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 3 6 9 3 6 9 12 6 9 12 16 9 13 16 19 4 7 11 15 7 11 15 19 MPN 10ml 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 阳性管 1ml 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 0.1ml 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 11 15 20 24 16 20 24 29 9 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 MPN 10ml 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 阳性管 1ml 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.1ml 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 1100+ MPN
37℃ 培养24h
证实产 气（阳 性）结 果与否
乳糖蛋白胨培养 液
实验报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查
MPN检索表，报告每100mL（或g）大肠菌 群的MPN。 结果表示方法：120MPN/100mL（g） 附表：大肠菌群最大可能数（MPN）检索表
注：
①本表采用3个稀释度：1ML(g)，0.1mL(g）和
硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。 抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰 氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷 基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐
作为抑菌剂。
抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大 肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某 些菌株有时也产生一些抑制作用。
实验步骤及操作要点：
1）无菌取样并制作梯度稀释液；
2）样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分 别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。 3）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得 超过15 min。
4）初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品 匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接 种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管 接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉
温箱内培养（24士2) h。如所有
乳糖胆盐发酵管都不产气，则可
报告为大肠杆菌群阴性，如有产
气者，则按下列程序进行。
3）分离培养
将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝
琼脂平板上，置（36士1)℃恒温箱内培养
18～24 h。取出，观察菌落形态，并做革兰
氏染色和证实试验。
4）证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落 1一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵
6）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4） 中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每 g（mL）样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个
根据证实为 大肠杆菌阳 性的管数， 查MPN表， 报告每 100ml（g） 大肠菌群的 MPN值。