高效聚磷菌筛选综述

高效聚磷菌的分离、筛选和效率研究进展摘要：高效聚磷菌的获得是深入把握生物除磷的复杂机制以及优化生物除磷工艺设计的基础。

该文对比分析了近年来对高效聚磷菌的分离筛选与效率等方面的研究进展。

关键词：富营养化；生物除磷；聚磷菌
Research Progress of Isolation.Screening and Efficiency of High-efficient Polyphosphate-accumulating Organisms
Abstract:Acquisition of high－efficient polyphosphate－accumulating organisms (PAOs) could lay foundation for exploring the complex mechanisms of biological phosphorus removal and optimization of its processing design. This article reviews the methods used in the isolation，screening and genetic building of high－efficient PAOs in recent year.
Keywords:eutrophication; biological phosphorus removal; polyphosphate－accumulating organism
我国磷矿资源丰富, 储量约14Gt,仅次于美国、摩洛哥,居世界第三位,是世
界上重要的磷化工产品生产国,年产量近9Mt(以P
2O
5
含量计)[1]。

尽管我国磷矿资
源十分丰富,但大部分属沉积磷块岩矿床,以P
2O
5
计占90%以上,这类矿石品位低,
杂质多,P
2O
5
的含量平均值只有17%-22% ,且80%磷矿含镁量偏高,嵌布粒度细[2]。

在开采利用磷矿山的过程中,会产生大量的废水,但是选矿过程是排放废水的主要环节,这是因为在选磷矿的过程中要求磨矿细度高,药耗大,需要大量的工业清水和产生大量工业废水(尾矿水),而且选磷废水中溶有残留的多种浮选药剂(有机物及无机物)和大量选别后的尾矿固体颗粒悬浮物,是具有一定稳定性的多相分散体系[3],其CODcr 、BOD、SS、P等严重超出国家规定的工业废水排放标准,废水的硬度也较大。

原成都科技大学磷复肥室开发的弱酸脱镁工艺可使矿中MgO
含量降到0.5 %以下, 但该工艺每处理1t磷矿约产生4t含 MgO、CaO、P
2O
5
、SO
3
、
Fe
2O
3
、Al
2
O
3
和F的废水[4]。

水体富营养化是一类世界性的环境污染问题，在我国，处于富营养化状态的
湖泊有80%以上[5]，而73%以上都达到严重污染程度[5].太湖巢湖和滇池等大型水体多年来都处于富营养化状态，造成巨大经济损失的同时也严重影响周边居民的生产与生活对富营养化防治的关键在于除磷，而强化生物除磷(Enhanced Biological Phosphorus Removal，EBPR) 生态效应与经济效益良好，具有效率高减少二次污染等优点，是目前得到广泛研究与发展的除磷方法，它利用具有超量吸磷能力的聚磷菌(Phosphorus Accumulating Organisms，PAOs)来实现对污水中磷的去除。

聚磷菌不是细菌分类学中的概念，只是对具有超量吸磷特征的一类微生物的总称，所谓超量吸磷，是因为指它们可以把多余的磷以多聚磷酸盐的形式储藏在体内，以备在不良环境中提供能量与营养所以有些聚磷菌菌体的磷含量可达干重的10%以上而且，因为在超量吸磷的过程中可以使外界环境中的磷含量明显减少，聚磷菌就成为了污水生物除磷的主要执行者，目前已报道较多的聚磷菌主要分离自活性污泥，包括:不动杆菌(Acinetobacter sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)[7]、假单胞菌(Pseudomonas sp.)[8]克雷伯氏杆菌(Klebsiellasp.)和产碱杆菌(Alcaligenes sp.) 和节杆菌(Arthrobacter sp.)[9]等。

另外，近年来随着分子生态学技术的发展，人们还发现了活性污泥中多种仍未获得纯培养的聚磷菌类群，
Candidatus Accumulibacter是其中得到广泛认可的一个优势种群[10]。

从长远来看，EBPR更加经济，更利于环境保护但是，随着EBPR在污水处理中的应用日益广泛，其运行的不稳定性也随之凸显出来，这种失败是由于对污泥中微生物学的掌握不够，处理过程完全凭经验设计造成的，所以，最理想的状态就是通过分离或者经过人工构建得到高效的聚磷菌株，对其生长与代谢机制进行更为全面的研究，从而设计出运行稳定且除磷效果理想的污水处理工艺，目前所获得的聚磷菌在种类和数量上都远远不能满足理论研究与实际应用的需求因此，本文综合了目前普遍采用的分离筛选以及人工构建高效聚磷菌的方法，并分析了这些方法的特点与不足，以期为获得更丰富的聚磷菌资源，进一步探讨聚磷机制，提高污水除磷效率以及综合防治水体的富营养化奠定基础。

1 高效聚磷菌的分离与筛选
分离与筛选仍然是目前获得高效聚磷菌的主要方法，而且活性污泥是最主要的分离来源，但是对聚磷菌的分离与筛选通常需分成多个步骤，逐步进行筛选与验证根据分离筛选过程中所采用的培养基与筛选方法的不同，可以把目前普遍采用的方法分为以下几类。

1.1 常规分离
1.1.1 一般方法
采用常规的牛肉膏蛋白胨培养基从环境样品中分离菌种，之后将纯化的菌种在缺磷培养基[11]中预培养以释放菌体内的磷，之后再选用富磷培养基好氧培养[12]，充分吸磷(一般为24h)，之后测定并计算菌株的除磷率来确定其聚磷能力当菌株的除磷率达到50%以上时，即认为其是高效菌株之后一般还会对其胞内的多聚磷酸盐颗粒(异染粒)和β－聚羟丁酸(PHB)进行染色[13]，进一步确认其聚磷的能力。

应用这种方法，李博等(2009)[14]从活性污泥中分离筛选出1株高效聚磷菌鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)LB4，其除磷率最高为83.7%;田萍等(2010)[15]从鱼塘底部污泥中分离驯化得到高效聚磷菌株P5，菌体内含有异染颗粒对总磷(PO3－4－P)浓度为10～30g/L的模拟废水的除磷率均可保持在90%以上。

1.1.2 先富集再分离
为了使聚磷菌成为优势种类，在分离过程中逐渐增加培养基中KH
2PO
4
的浓
度或将菌液转移至新的含磷培养基进行富集与驯化，以利于聚磷菌的生长，刘亚男等(2005)[16]通过先富集的方法从活性污泥中首次筛选出聚磷的产碱杆菌(Alcaligenes sp.)PAO1－1，该菌株对普通活性污泥系统具有很好的强化作用，驯化10d后可使除磷率由投菌前的44%提高到90%以上吕志堂等(2009)[17]从白洋淀的底泥样品中分离筛选到3株高效聚磷菌，除磷率均大于78%陈亚松等(2011)[18]从深圳市布吉河底泥中筛选出1株高效聚磷的假单胞菌(Pseudomonas sp. ) 在低磷浓度的富集培养基中(＜10mg/L)培养48h的聚磷率为81.5%。

1.1.3 耐盐及耐低温聚磷菌的筛选
分离耐盐的聚磷菌株时，在分离过程中需引入检测菌株耐盐力的过程，或选择海洋沉积物等盐浓度较高的环境样品张培玉[19]从污泥中筛选出1株肠杆菌属的嗜盐聚磷菌qdp05当盐度为2%时，qdp05对磷的最终去除率为87.8%，该菌株对高盐度废水的除磷处理具有很高的应用价值。

除了高盐度的废水，在冬季等低温环境条件下，起主要作用的中温聚磷菌的生长代谢一般处于抑制状态，失去了聚磷能力，此时，需要耐低温的高效聚磷菌发挥聚磷作用，王春丽等(2007)[20]采用模拟自然降温方式，筛选出在低温(8℃)下仍具有高效能的两株假单胞菌J4与J6，除磷率分别达56%和54%刘艳杰等(2010)[21]从A2/O反应器驯化污泥中筛选到耐低温的3株约氏不动杆菌的聚磷菌株P1、P2、P3，三株菌的最适生长温度均为15℃。

1.2 蓝白斑筛选
常规方法中采用的是微生物分离中常用的类型，一般会分离到大量的菌种，再加上富集和纯化等步骤，工作量很大而蓝白斑筛选法采用YG培养基[22]，碳源较少且磷含量较高。

初筛过程用到限磷MOPS培养基(每升添加0.0174g KH2PO4)[23]与过磷MOPS培养基(每升添加3.46g KH2PO4)，复筛实验则一般采用聚磷培养基[24]进行筛选的过程为，首先采用YG培养基进行分离纯化，利用限磷与过磷MOPS培养基初筛，两种平板上均变为蓝色的菌落即为初筛得到的聚磷菌初筛可以减少复筛步骤中聚磷率测定的菌株数量，有利于工作效率和准确性的提高在复筛过程中，测定菌株的除磷率，其余步骤同常规方法基本一致。

利用蓝白斑筛选法，Morohoshi T等(2003)[22]从活性污泥样品中筛选到高效菌株MY11和K3，这两株菌的聚磷能力分别达到500和100nmol P/mg蛋白Cai TM等( 2005)[25]由分离得到高效菌株GM6，将其接种于南京农业大学校医院的污水处理厂(磷含量约为9.0mg/L) 进行除磷，可将原来30%的除磷率提高到96.8%，使出水磷浓度达到0.2mg/L 连丽丽(2009)[26]从活性污泥和污水中筛选到3株高效聚磷菌，分别属于假单胞菌和脂环酸芽胞杆菌( Alicycliphilus sp. )，在磷含量小于5mg/L条件下，除磷率均大于50%。

除了活性污泥，富营养化水体的沉积物也是分离高效聚磷菌的重要来源吴云( 2008)[23]从富营养化水体沉积物中分离得到6株高效聚磷菌，分别属于约氏不动杆菌( Acinetobacter johnsonii) 和溶血不动杆菌( Acinetobacter haemolyticus)利用这些菌株对采自滇池的富营养化污水(磷浓度为 1.01mg/L) 进行除磷，除磷率均达到94%以上李海峰( 2011)[27]从太湖沉积物中筛选到高效聚磷菌7株，其中施氏假单胞菌( Pseudomonas stutzeri) YG－24适于去除低浓度磷( 1.0 mg/L) ，最大除磷率接近100% 应用该菌株对太湖水与肖家河污水处理厂出水两种实际污水进行除磷，均可使出水总磷浓度保持在0.02mg/L以下，具有良好的应用前景。

1.3 一种高通量筛选高效聚磷菌的新方法
初筛聚磷菌的培养基( PAM) 成分为( g/L)：柠檬酸钠 4.0，NaCl 0.5，(NH4)2SO4 2.5，CaCl2 0.25，MgSO4 0.25，Na2HPO4 12.8，KH2PO4 3，麦芽糖0.01，琼脂20 而在定量筛选时，需要添加0.025g/L甲苯胺蓝－O(培养液命名为PAM －TBO)。

操作步骤为:在96孔板上分别加0.2 L液体PAM和PAM－TBO，每个处理做4次重复然后接种20 L菌液，不接种微生物的处理作为对照，于28℃培养24h，离心，取上清于625nm处测定吸光值凡吸光值明显小于对照体系的菌种即为聚磷菌，且褪色越明显表明菌株聚磷能力越强另外，如果初筛时用肉眼就可判定甲苯胺蓝明显褪色的话，也可以省去比色的步骤。

相比于之前的筛选方法，这种方法更适于大批量筛选环境样品中的聚磷菌且步骤较为简便，覆盖面更广[28]。

2 高效聚磷菌的构建
2.1 人工诱变方法
在从活性污泥或者底泥中分离筛选高效聚磷菌株的基础上，研究人员还尝试对这些菌株进行人工诱变，以利于提高菌株的聚磷能力。

汤桂兰等(2006)[24]采用氮离子注入技术对1株细菌进行辐照诱变处理，之后选育出2株假单胞菌属的高效聚磷菌，结果表明，诱变后的聚磷率为出发菌的1.43～3.89倍除了具有聚磷能力的细菌以外，Watanabe T等(2008)[29]还发现一株phoU基因突变的酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) 聚磷能力是野生型的2倍，所以，他们使用EMS(甲基磺酸乙酯)对2株酵母HansenulaanomalaJ224－1和Hansenula fabianii J640进行诱变，共得到5个目标菌株，并发现突变菌株的聚磷能力是野生型的2.2～3.5倍。

所以，在分离筛选自然环境样品中高效聚磷菌株之外，还可以通过物理或化学诱变的方式来进行定向的选育，这也为高效聚磷菌株的获得提供了新的思路和参考。

3 问题和不足
3.1 分离过程较为繁琐
以上介绍的方法虽然不尽相同，但都不能通过较为简单的步骤完成，菌需要分离纯化初筛和复筛等一系列步骤，过于耗时和繁琐通过对已获得菌株聚磷机理及过程的深入研究，希望最终能找到一种类似于菌落显色或出现透明圈等快速、简便而且可靠的步骤就可以完成的新方法。

3.2 分离微生物的覆盖面较窄
目前所采用的培养基和培养方法只能分离到样品中大概1%的微生物，与应用分子生态学方法研究的结果相比，已获得分离的聚磷菌种类和数量仍可谓是沧海一粟，在活性污泥中发挥重要作用的优势种群如Candidatus Accumulibacter等还很难获得纯培养所以，探讨对环境样品中微生物的有效分离方法是一个永恒的研究课题。

3.3 所构建工程菌的效果还不够稳定
人工构建的工程菌仍然存在质粒容易丢失关键酶蛋白易形成包涵体聚磷效果不够稳定对生长环境适应力较差等问题所以，提高聚磷工程菌的稳定性也是生物除磷的一个重要研究方向。

4 结语与展望
在今后对聚磷菌的分离与筛选研究中，要适当地对培养方法进行改进和改良比如，目前所采用的分离培养基种类比较单一，只能适于分离能够在营养丰富的环境中生长的微生物，可以适当对传统培养基进行梯度稀释或配置营养成分较少的寡营养培养基或者通过改变培养条件等尝试获得未曾分离到的更多的聚磷菌资源，从而能够从生长代谢以及基因水平等方面对聚磷菌的聚磷机理有更清晰的把握。

随着基因工程技术的不断发展，相信会有更多的先进技术被引入到高效聚磷工程菌的构建领域，为工程菌株的稳定性及生物除磷效率的提高奠定基础，进而为更好地进行污水除磷以及水体富营养化的防治。

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