Western Blot 结果条带全面分析
western-blot实验时，胶片上条带很弱是什么原因？
western-blot实验时，胶片上条带很弱是什么原因？
条带弱的原因可能有以下几个方面：
①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。
可适当加大蛋白上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整，如Enlight-plus。
②. 蛋白没有充分转移到膜上。
转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。
③. 抗体效价不高，用量不足，孵育时间太短，或抗体反复使用保存不当而失活。
可考虑更换效价更高的抗体，或提高抗体稀释度，延长抗体孵育时间；若怀疑抗体失活，可用斑点杂交实验确定抗体活性。
④. 曝光时间太短。
可适当延长曝光时间。
western blot操作技巧及常见问题分析
Western Blot 操作技巧及常见问题分析汉恒生物提供病毒包装服务你的Western Blot结果是否出现过非特异性条带？条带变窄变宽了？条带哭了条带笑了？信号太弱了？等情况，所以现在需要提升一下你的Western Blot结果的颜值了！如何使电泳条带漂亮些？电泳注意事项●为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳●如用预染Marker，当要分辨的蛋白到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，结束电泳●电泳用恒压模式能保持蛋白质恒定的电泳迁移率，而电压先低后高可使样品更好的进入凝胶。
实际电压可根据时间安排调节，电压高时电泳发热大，电压低于50V时小蛋白容易弥散，凝胶分辨率会下降。
影响跑胶的质量，有以下因素：●胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。
倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，水或饱和正丁醇隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶，使胶不均匀。
●聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。
建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
●电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。
电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。
●样品，在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素，可以克服由于样品溶解不佳引起的纹理和拖尾现象。
●减少上样量可以避免由于加样量太多引起蛋白带过宽或与邻近泳道的蛋白带相连。
WB常见问题分析高背景原因解决办法蛋白浓度过高降低抗体浓度膜的污染使用干净镊子；戴手套操作；换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润；孵育时使用脱色摇床；避免膜重叠，互相覆盖；小心操作，勿毁损膜漂洗不完全增加漂洗时间和缓冲液体积封闭液不适合比较尝试不同封闭液封闭不完全延长封闭时间（可4℃过夜）抗体浓度过高优化降低一抗、二抗浓度曝光时间过长缩短曝光时间缓冲液污染使用新配制缓冲液信号弱或无信号原因解决办法抗原量不足增加上样量，使用阳性对照；减少漂洗，可将TBST改为TBS蛋白质在储存过程中降解重新制备样品转膜不完全转膜后确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、保证电极正确装配、控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间。
Western blot 条带判定和图片处理标准流程
Western条带判定的标准流程
1、确认目的蛋白的理论分子量
2、通过Uniprot，确认蛋白是否有信号肽，酶切位点，异构体，糖基化修饰位点（一个糖
基化修饰能增加5KDa左右），磷酸化几乎不影响分子量大小。
3、进行肽链氨基酸的分子量判定：
计算出未修饰的全长肽链的分子量（uniport中的有），即理论分子量
计算分子中修饰基团的分子量。
目的蛋白实际分子量=异构体理论分子量-信号肽+糖基化位点数*5KDa，得到一个最大的分子量。
6、最后一步，将实验误差10%考虑进去，即得到一个蛋白的分子量对应的位置范围。
例如实际分子量为50kda，这目的蛋白实际分子量在45-55kda之间，均可接受。
7、最终每个指标的目的蛋白大小参考abcam、cst、novus、abcam4个公司做的实际分子量大小，如无较大出入则可，和别家公司有较大出入，则需进一步验证自己做出来的条带是否正确，通过阴性，阳性对照，KO实验，证明自己做的条带是真实的，即可上传官网。
1.在image lab中将原始图片调对比度，和亮度后，使图片背景干净，条带清晰，有微弱泳道痕迹即可，导出图片
2放入ppt中，剪切成大小合适，字体均用Arial 11号，黑色，短线均用0.6cm，黑色图片边框0.75磅，黑色，图片高度，宽度以目的条带为核心，上下无杂带尽量保留全maker。
3.图片另存为jep格式，A2016对应的货号为K0002354P,图片命名为K002354P-EIF5A-1/1000.。
western-blot条带分析及解决方法
持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。
如果没有背景则就是原因3的现象。
在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。
如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。
其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。
如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。
如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。
但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。
原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。
主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。
westernblot曝光得到的图片，到底是要分析灰度值还是密度值？
westernblot曝光得到的图片，到底是要分析灰度值还是密度值？展开引用13579yyy1一般WB的分析都是测量积分光密度，也就是IOD。
这个值一般IOD=area xdensity(mean)......一、利用ImagJ对WB条带进行灰度分析1、File——》open 打开WB片子2、把图片转化成灰度图片 image——》type——》8-bit3、消除背景影响process——》subtract background 选择50基本可以4、设置定量参数analyze——》set measurements，点击面积，平均密度和灰度值及Integrated Density5、设置单位 analyze——》set scale ，在“unit of length”的方框里输入“pixels”6、把图片转换成亮带，Edit——》invert7、选择Freehand Selection，尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值8、复制数据IntDen进行分析二、利用ImagJ对WB条带进行密度分析1、File——》open 打开WB片子2、如条带不正，需修正image——》transform——》rotate 调节angle值，直到条带水平为止3、选中矩形选项，圈中第一个条带，然后 analyze——》gels——》select first lane（快捷键ctrl+1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，analyze——》gels——》select second lane （快捷键 ctrl+2），最后analyze——》gels——》plot lanes4、选中直线工具，将开口的波峰关闭5、选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值6、以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值为相对密度这是我在网上查到的，用ImagJ分析WB条带的方法到底要选第一种呢？还是第二种呢？。
Western Blot(WB)分析法
Western Blot（WB）分析法实验目的检测目的蛋白的表达情况。
实验原理Western Blot（WB）采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，例如硝酸纤维素薄膜（NC膜），固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验步骤（一）蛋白胶的配制根据相关蛋白胶配制的说明书及目的蛋白的大小配制相适应浓度的分离胶和浓缩胶。
（二）跑胶浓缩胶的电压为80 V，分离胶的电压为120 V。
跑完胶后可根据原核或真核表达来选择是否进行染色，原核表达量高，可通过考马斯亮蓝染色观察表达情况，真核不易看出。
（三）转膜1. 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，本实验室采用电泳印迹法。
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。
两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。
前者操作容易，转移效率高，但转移时间长；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。
2. 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western Blot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western Blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC 膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
western-blot实验报告
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
免疫印迹实验报告——wester-blot
Western blot实验报告摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法方法：western blot结果：见后文结论：western blot能很好地分离蛋白关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白Western blot test reportAbstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transferResults: see belowKey words: Western blot、separate、mouse tissues、protein前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项 -回复
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项-回复西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项引言：蛋白质是细胞功能的重要组成部分，对于研究蛋白质的表达和功能非常关键。
西方博LOT（Western blot）是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于分析特定蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质的大小和相对丰度以及判断蛋白质的分子量。
本文将介绍西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项。
一、实验结论：1. 确定目标蛋白质的存在与否：在Western blot实验中，通过探针的特异性结合，可以确定目标蛋白质在待检样品中的存在与否。
如果探针与待检样品中的蛋白质结合，会出现特异的蛋白质带，从而可以确定目标蛋白质的存在。
2. 确定目标蛋白质的大小和相对丰度：通过Western blot实验的结果，可以确定目标蛋白质的大小和相对丰度。
在蛋白质电泳分离后，较大的蛋白质会相对较靠近电极负极，较小的蛋白质会相对较靠近电极正极。
通过与已知分子量蛋白质标准曲线的对比，可以确定待检样品中目标蛋白质的分子量。
3. 分析蛋白质的表达水平：通过Western blot实验的结果，可以分析目标蛋白质在不同样品中的表达水平。
通过比较待检样品中蛋白质带的强度，可以初步判断蛋白质的相对表达量。
进一步，可以使用图像分析软件对蛋白质带的强度进行定量分析，获得更精确的表达量数据。
二、实验注意事项：1. 样品处理：西方博LOT实验的样品处理是关键的一步。
样品的存储和处理方式可能会对实验结果产生影响。
为了保持蛋白质的完整性和稳定性，样品应尽快冷冻保存，并在实验前严格遵循相关处理方法。
2. 磷酸盐缓冲液的配制和pH调整：磷酸盐缓冲液是Western blot实验中的关键试剂，用于制备电泳缓冲液、转膜缓冲液和洗涤缓冲液。
正确配制磷酸盐缓冲液的浓度和pH值是确保实验的准确性和稳定性的重要因素。
3. 蛋白质的电泳分离和转膜：蛋白质的电泳分离要求严格的电泳条件。
完整word版,Western-Blotting实验报告
Western Blotting本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。
Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
它通常分为两种方法：Western Blotting 方法一: 直接法方法二: 间接法优点： 1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带1. 免特异性不受标记影响2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3. 多种标记的二抗可供选择4. 可选择不同的Marker缺点： 1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便1. 交叉反应引起的非特异性条带2. 额外的二抗孵育以及条件优化同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
western-blot条带分析及解决方法模板
*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。
这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。
如果没有背景则就是原因3的现象。
在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。
如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。
也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。
还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。
其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。
如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。
如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。
但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。
原因1和3若如是则解决也是一样的。
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。
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Western Blot
凝胶成分
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液
荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。
Western Blot
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇 的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它 可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级 和三级结构。
强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫 键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形 成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷 的蛋白质-SDS复合物。
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒 （2）平均1g 蛋白质结合 1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分 子量的大小成正比
Western Blot
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电
1M Tris-HCl(pH6.8)
1M DTT SDS
甘油 溴酚蓝 总体积
10 ml
20 ml 4g
20 ml 0.2 g 100ml
DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。
按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～ 50μg。
干货▎ImageJ分析WesternBlot蛋白条带灰度值
干货▎ImageJ分析WesternBlot蛋白条带灰度值聊点学术，一键关注“你已经是个成熟的条带了，要学会自己分析！”“连Western blot都没学好，又让我学Image J，我......”This is the dividing line.Image J分析蛋白条带灰度值首先解释一下，为什么要分析灰度值？灰度的概念是使用黑色调表示物体，即用黑色为基准色，不同的饱和度的黑色来显示图像。
采用ECL发光时，蛋白条带发出的荧光会曝光在胶片上，留下的黑色条带。
然而胶片扫描后为蓝色背景、黑色条带，这并不是单纯的黑灰白颜色。
因此，我们首先得在Photoshop 中将整张图片去色，使彩色图片变成黑白图片，形成近灰色背景、黑色条带的图片类型。
此时，条带的深浅和面积综合代表着蛋白的量。
灰度值分析自然就成为我们的首选。
延伸说一下，免疫组织化学染色(IHC)结果本身为近白色背景、棕黄色阳性表达，这时我们就不能直接用灰度反映阳性表达强弱了，而是积分吸光度，也就是咱们常说的平均光密度(IOD)。
如果你真的想用灰度计算IHC结果，显然你需要将图片转为灰度图再计算。
此处不表。
分析图文步骤如下：Image J软件界面↓1. 图片转换为黑白图：首先使用Photoshop打开胶片扫描图片，点击“图像>调整>去色”，将彩色图片转化为黑白图片，并使用裁剪工具将目标条带裁剪至合适大小后另存图片。
2.打开Image J软件：2.1.打开图片文件：File>Open；将图片转化为8bit类型：Image>Type>8-bit。
(此步骤的目的是为了将图片的每个像素用8bit表示，这样的话，整个图片的灰度将分为256个级别，即黑、灰、白的像素模式；若保留原始的16bit格式或RGB格式，图片灰度级别会呈指数增长，并有其它颜色混入，造成计算误差。
)2.2.将整张图片背景灰度均一化，消除图片背景影响：Process>Subtract Background，默认数值为50即可。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项西方博(Western blot) 是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质样品经过电泳分离并转移到膜上，再使用特异性抗体检测蛋白质的表达水平。
以下是西方博检测蛋白质表达实验的结论和注意事项。
结论：1. 蛋白质的分子量：西方博通过与已知分子量的标准品比较，可以确定待测蛋白质的精确分子量。
根据蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以使用特定的分子量标准品绘制标准曲线，并在曲线上确定待测蛋白质的分子量。
2. 蛋白质的表达水平：西方博使用特异性抗体来检测特定蛋白质的表达水平。
利用特异性抗体与目标蛋白质的特定区域结合，然后使用辅助抗体标记抗体，并通过光学或化学方法检测抗体标记物的表达水平。
比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平可以确定其相对表达量。
注意事项：1. 样品的提取和准备：蛋白质的准备和提取是西方博实验的首要步骤。
样品应该被充分破碎，并使用适当的提取缓冲液来维持蛋白质的稳定性。
注意，使用不同类型的组织或细胞时，提取条件和方法可能有所不同。
2. 蛋白质的电泳分离：西方博通常使用SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 来进行蛋白质的分离。
凝胶的浓度和隔离电泳条件应选择适当，以分离不同分子量的蛋白质。
3. 转膜：将电泳分离的蛋白质转移到膜上是西方博的关键步骤之一。
选用合适的膜（如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素膜），并选择适当的电泳缓冲液进行转膜。
确保蛋白质能够均匀地转移到膜上。
4. 抗体的选择和试验条件：特异性抗体的选择和充分优化是确保实验准确性的关键因素。
保证抗体的特异性和亲和性，并验证抗体的工作浓度。
此外，充分优化抗体和探针的试验条件，包括反应温度、时间和抗体浓度等。
5. 成像和分析：西方博实验完成后，使用适当的成像方法（如化学发光或荧光成像）检测抗体标记物的表达水平。
使用适当的成像系统记录图像，确保信号处于线性范围内。
使用图像分析软件进行定量分析，比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平。
如何用Imagelab分析WesternBlot条带
如何用Imagelab分析WesternBlot条带豆子老师完全放开了，今天写的帖子是手把手系列的，她十分适合做教导主任。
技能需要一个个掌握，等到大部分技能都写完，我们会尝试如何把生信和实验结合起来，从无到有，提出科研假说，设计课题，完成课题，发表文章，申请基金，拿到基金探索新的课题，形成科研的闭环。
这周我们来探讨一下Image lab，Image lab也很好用，但是操作比image J操作复杂一些，更致命的一点就是Image lab只能识别自己曝光的图，也就是scn格式的图，tif格式并不能识别，而我们Western的曝光仪器并不是，所以我用的相对比较少，只是以前觉得所有的软件都是有用的，看见别人用，都觉得好就都下载了下来。
所以这次的图也是别人赞助的，感谢YY的友情赞助。
方法一：1.首先打开你要分析的数据，一般是scn这个格式才能打开，也就是说用这个软件曝光的才能用这个软件来统计。
这个是从别人那里拷来的图，非常感谢支持YY的支持。
2.选择左侧的体积工具，选择矩形3.用鼠标圈中你分析的条带U14.然后复制这个矩形，粘贴八个，我这里就粘贴5个了，只是举个例子，操作都是一样的5.分别圈住所有的条带6.然后点一下分析表，就出现了下面的表格。
7.然后选择表格上面最右侧的按钮，导成Excel文件8.一般背景深的话，选调整体积徒手圈也可以，但是手太抖，我每次都画不好。
这样可以知道大概的趋势。
也可以选择哪一个泳道的条带为1，双击该矩形，会出现“体积类型”、“数量”、“参考体积”等选项，打勾“参考体积”，确定。
9.然后点击“分析表”，各种定量结果会显示出来。
同样选择从左数第四个按钮“将分析表导出至文件”，选择相对定量。
方法二：1.首先打开Image lab，打开一张Image lab电泳图片。
点击泳道和条带，找到泳道下手动功能，输入泳道号，我们一共有8个条带，输入82.在“所有泳道”功能下面可以选择调整泳道框的大小。
Western_Blot详解及问题分析
Western BlotFra bibliotekSDS：
阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线 性化。
Western Blot
Western Blot
Staking gel Separating gel
注意事项： 1.抗原样品与缓冲液混合水浴加热时不要进水！最好采用空气浴； 2.电泳Buffer最好不要重复利用，因为样品比较珍贵，而电泳液相对廉价； 3.Buffer一定要漫过梳子孔，否则就会发现蛋白跑不动； 4.电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度， 慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白。
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒
（2）平均1g 蛋白质结合
1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分
子量的大小成正比
Western Blot
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电 荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。
Western Blot
Western Blot 流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜 •封闭 •一抗杂交 •二抗杂交 •底物显色
Western Blot
蛋白样品的提取
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白
水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系 统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质 最常用的溶剂 。
WesternBlot结果条带分析
Western Blot结果条带全面分析1.空白原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。
如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。
另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
2.高背景原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。
解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
3.非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗4.条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。
解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡5.出现黑点和黑斑原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合解决办法：封闭结束之后要洗。
6.条带拖尾原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。
7. 出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。
8.某个条带变形原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。
另外配胶用的水，SDS，Tris 缓冲液要注意不要有杂质。
9. 条带呈哑铃状原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用10.最边缘条带弯曲原因：电泳电流不均一解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔其他问题（1）蛋白分子量偏高或者偏低。
可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。
（2）蛋白质降解。
蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
（3）所有条带连成一片没有间隔。
原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。
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Western Blot 结果条带全面分析
Q1. 啥也没有
[原因]：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
[解决办法]：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
[经验]：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。
如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。
另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。
Q2. 高背景
[原因]：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够
[解决办法]：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
[经验]：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。
其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。
Q3. 非特异性条带
[原因]：一抗非特异性与蛋白结合
[解决办法]：更换一抗
[经验]：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。
如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。
当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。
Q4. 条带中出现边缘规则的白圈
[原因]：电转中膜和胶之间存在气泡。
[解决办法]：转膜前去掉膜和胶之间的气泡
[经验]：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。
然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。
注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。
Q5. 条带中间出现白色（反白）
[原因]：中心部位高浓度HRP把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了[解决办法]：降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度。
[经验]：如果你足够迅速，可以在中间部位底物消耗之前就把X光片给定影出来，但是时间很难把握，建议还是从降低蛋白量，降低一抗二抗浓度入手。
Q6. 出现黑点和黑斑
[原因]：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合
[解决办法]：封闭牛奶一定要纯，封闭结束之后要洗
[经验]：我们常常是等到要封闭的时候发现没有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的时候往往不管是否已经完全溶解，如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上，会导致很多不溶性颗粒附着在膜上，这就会导致发光时候膜上的黑点。
所以牛奶溶解之后，最好静止一下，然后轻轻地吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束之后一定要洗三遍之后再加一抗。
Q7. 条带拖尾
[原因]：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长
[解决办法]：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。
[经验]：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。
一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。
最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。
另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议5min*5次，不要但是洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了，你又不是拿刀在上面刮，真正的抗原抗体的结合是通过这种方式洗不掉的。
Q8. 出现重影
[原因]：荧光强度比较高，在压片时，放好之后不小心又轻微移动了一段距离
[解决办法]：X光片放上去之后，就不要动了，即使放歪了也没关系。
[经验]：有的时候出现重新刚好在上下位置，并且重影会相对弱一些，不要误以为抗体识别了该蛋白的另外一种异构形式。
Q9. 出现非均一性背景
[原因]：膜可能曾经干过
[解决办法]：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干
[经验]：在封闭的时候，洗一抗，洗二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。
注意与高背景区别。
Q10. 某个条带变形
[原因]：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒
[解决办法]：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。
[经验]：很多实验室中使用的不是最新的设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年之后，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。
另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。
Q11. 条带呈哑铃状
[原因]：配置胶有问题
[解决办法]：把胶配好，不合格的胶坚决不用
[经验]：出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一，不知道大家有没有出现如下的配胶情况，下图中示意拔完梳子之后的结果，如果你拔完梳子之后出现图中下面部分的样子，多半会出现哑铃状。
另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。
Q12. 最边缘条带弯曲
[原因]：电泳电流不均一
[解决办法]：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔
[经验]：一般我们使用的是10孔的的胶，如果你上样刚好10个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。
另外上样最好在胶的中间，这样电场均一。
Q13. 电泳过程中出现现象及问题
（1）整个条带呈“ ︶” 状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。
（2）整个条带呈“ ︵”：凝胶左右两头没有凝固好
（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。
（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒
（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。
（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。
Q14. 其他问题
（1）蛋白分子量偏高或者偏低。
可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD 的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。
（2）蛋白质降解。
蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
（3）所有条带连成一片没有间隔。
原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。