小麦玉米杂交诱导单倍体研究进展

小麦×玉米远缘杂交诱导小麦单倍体的研究进展

前言

运用传统的育种方式对小麦品种进行基因改良，按照小麦品种选育的常规育种程序，一般需要5-8年才能筛选出纯合的系(种)形成农艺性状相对整齐一致的稳定群体。再进行多点试验评估育种材料的适应性和商业价值，造成育种周期长、资源消耗大、延误品种的培育的严重后果[1]，且自交后的纯合品系仍包含一些杂合基因的缺陷。若引入远缘种质，由于杂F2及后代疯狂分离，使品种纯化需要更长的时间[2]。近年来随着分子生物学技术的发展及单倍体育种等手段极大提高了育种的精确性和育种效率。为了解决育种周期长的突出问题，小麦遗传育种工作者利用小麦与玉米杂交后，杂合子代体细胞中父方染色体消失[3]，获得大量的小麦单倍体植株，再进而经过染色体加倍。通常双单倍体在一个世代中就可以得到完全纯合的重组体[4]。利用小麦单倍体的加倍创建纯合双单倍体(Double haploid，DH)系，对缩短小麦育种年限，加快育种进程，提高选择效率及遗传研究等具有重要意义[5]。由于单倍体育种手段尚不成熟，国内外经常出现小麦远缘杂交单倍体胚、单倍体苗的产生频率以及染色体加倍效率不稳定，加倍单倍体植株成功率相对较低的报道[6]。国内外科学家正致力于小麦×玉米远缘杂交单倍体诱导育种技术的研究和完善，希望在较短的时间周期内培育出优质、高产、广适的小麦品种。

1 小麦单倍体产生和鉴别

1.1 小麦×玉米杂交系产生

单倍体培养途径如花药/花粉粒培养、子房/胚珠培养、远缘杂交单倍体诱导已逐渐进入品种改良迅速发展时期。目前已有200多种植物通过花粉/花药培养获得了单倍体植株，其中以茄科和禾本科居多[7]许多禾本科作物通过花粉/花药培养诱导植株再生已经获得成功，如水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦和高粱。大麦、玉米、水稻和小麦通过培养子房和胚珠使单倍体再生[8]的研究也有了很大的发展。但上述两种方法应用于普通小麦时出现成苗率低和大量白化苗的现象。

1964年，Guha和Maheshwari从曼陀罗花粉中第一次培育出单倍体植株。1975年Barelay[9]用普通小麦与球茎大麦杂交获得了高频率的小麦单倍体，但后来的研究表明由于小麦5B染色体长臂上的Kr1基因和5A染色体长臂上的Kr2基因阻止小麦与异源植物交配，造成普通小麦与球茎大麦之间的杂交存在不亲和性[10]。Zenkteler[11]最早报道了六倍体普通小麦与玉米之间的远缘杂交。1986年Laurie等[12]利用小麦×玉米成功诱导出小麦单倍体植株，并通过细胞学观察证实了小麦×玉米得到的幼胚是单倍体胚，小麦授玉米花粉1d后的杂种胚存在21条体积较

大的小麦染色体和l0条体积较小的玉米染色体，授粉3-6d的杂种胚中仅有2l条小麦染色体和微核。在最初的3次细胞分裂中，来自父本玉米的染色体被完全排除掉，形成了仅有21条母本小麦染色体的单倍体胚。利用小麦品种间代换系进行进一步比较，小麦×玉米的受精频率不受小麦所携带的Kr1和Kr2基因的影响，Kr基因在小麦与玉米杂交中是不敏感的。Zhang J 等[13]比较分析了小麦×玉米杂交与自花授粉的小麦植株的胚胎石蜡切片发现胚乳极核留在细胞质中没有发育到细胞阶段,便逐渐退化。Mochida等[14]观察证实了小麦杂交24-28h后受精卵细胞分裂后玉米的染色体迅速消失的情况。

1.2小麦单倍体的方法和鉴别

小麦单倍体主要有三种方法：花药培养法、球茎大麦法和玉米杂交法。花药培养法因受小麦基因型限制导致成苗率较低，以及因产生大量白化苗而限制了应用。球茎大麦法中位于小麦5B、5A染色体上的Kr基因对小麦基因型存在明显的选择性，提高了外源植物与之交配的难度。而且小麦与球茎大麦杂交后，球茎大麦染色体并不完全消失，来自父本的某些不利基因的进入受体小麦中。利用小麦与玉米远缘杂交诱导小麦双单倍体主要依赖于单倍体胚产生频率、单倍体植株的获得频率以及单倍体植株的加倍成功率。由于原胚的分裂和2,4-D的作用获得了小麦单倍体胚方法的广适性更好。

通过解剖开外种皮后，白色的胚漂浮在种皮包被的水囊里，而胚乳极核留在细胞质中没有发育到细胞阶段，形成缺乏胚乳的种子是鉴别小麦多元单倍体胚的基本特征[15]。鉴定小麦(Triticum aestivum L.)×玉米(Zea mays L.)产生的杂种子代的单倍性，采用形态学和细胞学鉴定相结合的方法发现杂种子房内均无胚乳，仅在少数子房内观察到1个游离的球形幼胚且发育成植株后在花期花药退化或花粉败育[16]，可作为杂交后代单倍性的形态学标记。

2.1转化率影响因素

2.1 亲本的选配

小麦和玉米基因型对多元单倍体胚形成到小苗再生具有显著的影响。Suenaga[17,18]等评估来自不同地理区域(亚洲、欧洲、北美和澳大利亚)的47个小麦基因型55个玉米品种(品系)，其产生胚的能力上存在显著的基因型差异。研究结果显示不同组合的单倍体胚平均形成率是15.2%，但胚形成率变化幅度相当大(以色列低聚糖麦秆的形成率为0.9%，日本Hiyoku-komugi 的形成率为35.8%)。

2.1.1 小麦基因型

Inagaki等[19]认为不同小麦基因型的单倍体得胚率存在明显差异，Kisan N.S.等[20]、陈新民等[21]认为不同小麦基因型对单倍体得胚率无显著影响。蔡华等[2]用100多个小麦F1代组合与玉米杂交结果显示不同基因型小麦对得胚率存在显著差异,最高单倍体得胚率达3O%以上，最低在5%以下。小麦基因型之间的差异对杂交诱导的影响最为重要。张新玲等[22]验证得玉米

花粉诱导六倍体普通小麦得胚率为5.4%，明显高于四倍体。杀配子染色体杂种材料与玉米的杂种成胚率有待研究。利用杀配子染色体材料的杂交后代不同基因型小麦材料(母本)与滇超甜2号玉米(父本)杂交杂种成胚率无显著差异[23]。

2.1.2 玉米基因型

相比小麦基因型，玉米基因型操纵主动性更强，良好的玉米基因型明显提高诱导单倍体得胚率。不同基因型花药诱导愈伤组织的诱导率差异很大[24]。陈新民等[5]用三个玉米单交种给同一小麦品种授粉，结果得胚率在13.3-33.1%，且各处理组合间存在显著差异。蔡华等[2]用35个小麦F1代组合与4个不同玉米基因型进行杂交，结果也很明显。同时，王广金[25]用甜玉米，糯玉米，普通玉米三种基因型和两个小麦杂交组合进行试验，得到平均得胚率为甜玉米(8.71%)>糯玉米(6.54%)>普通玉米(5.65%)。所以发掘和选择具有高受精率、易成胚的玉米基因型是研究中的关键环节。

2.2 生长环境

自然生长环境条件对得胚率影响最大的因素是温度和光照。Campbell等[26]研究结果显示对单倍体诱导的最佳温度为白天22℃．夜晚17℃；最佳光强为1000mol-1.m.s.PAR，16h/d。因此，控制授粉后15d左右的光温条件对于幼胚的生长发育非常重要。光照是影响得胚率的重要因素，连续阴雨造成的极端寡照显著降低小麦单倍体胚的得胚率[27]。此外，小麦的生长环境的湿度、生长期间的水肥及植株生理状态也会影响到单倍体得胚率和出苗率。在低湿度状态下平均生产的颖果数和胚数是高湿度状态下的2倍，而且单倍体株数较多，因为低湿度状态下胚细菌感染率仅为5%远小于高湿度状态下的50%[28]。

在最适宜培养条件下，室内离体培养法平均成胚率(23.6%)高于常规杂交法(18.1%)，且以2O℃、光照3000Lx、12h/d、相对湿度7O%条件下离体培养杂交穗14d获得的成胚率最高(28.6%)，授粉后获得最高成胚率的T>1O℃有效积温在187.9-254.9℃之间[29]。一定的积温对于诱导成功率有促进作用。

2.3 花粉活力

玉米和小麦花期相遇是利用小麦×玉米诱导小麦单倍体、进行小麦育种的前提[30]。正常生育条件下两者生长状况差异巨大。冬春季适合小麦生长，玉米一般植株矮小，花粉量少，育性差；而在的夏秋季节，玉米生长旺盛，小麦常因春化条件及环境因素使得植株整体农艺性状不佳，授粉状态不理想。生产上常采用分期播种并配合适当的设施条件以及加强肥水管理等方法来调节花期，促使植株健壮，提高花粉活力，并可对玉米进行温床育苗、大田移栽。蔡东明等[30]对陕西关中地区冬小麦与玉米杂交的花期调节进行了研究，认为1月27日至2月7日室内营养钵分期点播，3月l日移栽至大棚，在小麦花期便可获得持续的、多类型玉米花粉，确保杂交顺利进行。供体花粉的活力及受体柱头识别、接受异源花粉的能力决定杂交的最终成败。王艳哲等[31]发现常温条件下玉米花粉具有授精能力，高温(32-35℃)条件花粉失水干