豆科牧草生物固氮20101017

8.5 豆科牧草—根瘤菌的共生固氮玉永雄1何庆元21西南大学2安徽科技学院20世纪以来，单位面积上粮食产量的增加很大程度上归功于化肥的施用。

近年来氮肥的施用量越来越大，但肥料的利用率却在不断下降，大部分进入地下水，使江河湖泊富营养化。

大量施用氮肥，致使土壤板结，降低了土壤的蓄水保墒能力。

并且工业氮肥是在高温高压下生产的，消耗大量石油、煤炭等不可再生的能源，同时造成对环境的污染。

生物固氮是固氮微生物在常温常压下利用可再生能源（太阳光）固定空气中的氮素，使之能直接被生物吸收利用的过程。

生物固氮固氮量大，是工业固氮的三倍，不但可以使农作物增产而且也不会出现对环境的任何污染，同时改善土壤，降解土壤中的毒素，是可持续农业发展的重要措施。

因此，加强固氮微生物活动，利用生物固氮获得氮肥，是今后氮素肥料研究的主要方向之一。

而共生固氮是生物固氮中最重要的固氮形式，其固氮量占整个生物固氮的一半以上。

8.5.1 共生固氮的概念共生固氮是指植物和微生物相互作用，形成共生体系，在这个体系中微生物（小共生体）发挥其固氮活性，使大气中的游离的氮气转化为生物可利用的化合态氮的过程，而植物（大共生体）在此过程中为微生物提供固氮所需的场所、环境和能源，并促进微生物发挥固氮作用。

8.5.1.1 共生固氮的类型固氮生物多种多样，除了少数蓝藻外，大多是一些简单最原始的生物。

固氮生物一般分为非共生固氮和共生固氮两大类。

其中共生固氮是最重要的固氮方式，迄今为止，发现的共生固氮类型大致可分为以下五类：1）豆科共生固氮型：固氮菌为生活在豆科植物根内的细菌，如苜蓿根瘤菌，有近900个种。

2）非豆科共生固氮型：生活在非豆科植物根上和根内的菌，如与杨梅、木麻黄等近120种非豆科植物共生的固氮菌，多数为放线菌，也有真菌、蓝藻、细菌、分枝杆菌等。

3）联合固氮型：植物根际上的联合固氮微生物进行生物固氮，如生活在植物（水稻、小麦、玉米等）根表和根际的极毛杆菌、酵母、细菌等。

4）叶瘤和叶面微生物固氮型：生活在某些植物叶中的细菌（如杆菌、分枝杆菌、蓝藻等）和叶面的固氮菌（如极毛杆菌、酵母、细菌等）进行生物固氮。

5) 其他：如菌根（小球菌和放线菌），地衣（多种蓝藻），绿萍（念珠菌）等。

8.5.1.2 共生固氮研究的历史回顾和展望1) 生物固氮研究的起步阶段对生物固氮的认识和研究最先是从豆科植物共生固氮开始的。

在人们对生物固氮概念尚未明确之前，我国劳动人们在生产活动中，就知道豆科植物能够肥田。

公元前三世纪的西晋《广志》中就有利用苕子和水稻轮作增产的记载。

最先从科学上证明生物固氮的是1883年法国农业化学家J.B.Bousinggault根据田间试验和化学分析的结果指出，豆科植物可以从空气中取得氮素营养。

1866年俄国学者沃罗宁（M.C.Bopo）最先发现豆科植物根瘤中含有微生物，并指出根瘤的形成是微生物侵染的结果，但他没有把根瘤的形成和豆科植物的固氮作用联系起来，直到1886-1888年德国学者H.Hellreigel等用砂培试验证明，豆科植物只有形成根瘤时，才能固定空气中的氮素。

1888年，荷兰学者M.W.Beijerinck证明了豆科植物根瘤是由细菌引起的，并分离纯化获得了根瘤菌纯培养物。

接着，波兰学者Prazmowski用根瘤菌纯培养物接种豆科植物，形成了根瘤。

2) 生物固氮研究的飞跃发展阶段从20世纪20年代起，生物固氮研究偏重于描述各种生物固氮的类型、形态、分类和固氮菌的生理生态方面。

40年代后，则集中在生理和生物化学方面，人们对生物固氮的了解只停留在整体细胞水平上。

直至1952年，Stone和Wilson得到固氮菌的无细胞提取液，将研究推进到细胞水平，成为固氮生化的转折点。

1974年，英国Beringer等学者发现的R6845质粒在根瘤菌之间推动染色体基因的转移，进一步将根瘤菌的研究推进到共生固氮基因的水平上。

20世纪末的几十年中，由于分子生物学和生物化学飞速发展，尤其是酶学在固氮以外的其他方面所积累的大量知识，以及近代物理、化学技术的广泛应用，在固氮酶的分离、纯化、结晶、结构与功能、生物固氮的能量来源、酶促反应及催化机理、电子传递和防氧机制、化学模拟生物固氮等进行了深入的研究，取得了突破性的进展。

而20世纪以来，固氮的研究从微观上进一步深入到了分子水平，对固氮基因、结瘤基因以及固氮基因组和竞争结瘤等方面都做了大量的工作，也取得了阶段性的成绩。

从宏观上，进一步从生态的角度研究固氮作用，并且加强了对植物与固氮微生物相互关系的研究，植物光能利用率和固氮的关系将作为进一步研究的内容。

3) 共生固氮的研究方向和展望目前的共生固氮研究，正围绕着如下几个方面的问题进行：固氮生物资源的进一步开拓利用，固氮微生物的系统分类和遗传地位，现有固氮生物固氮能力的提高，寻找更高效的固氮微生物；固氮微生物的逆境生理，在环境条件胁迫下寻找高效的固氮菌；固氮遗传和遗传工程的研究，利用生物技术改造菌株，提高菌株的固氮能力；其他，如光合固氮及其与氢代谢的关系以及植物固氮相关基因的定位和克隆等。

这些研究中，学者们正期待能够实现下面一些美好的愿望：进一步增加已知的植物——微生物系统所得固氮量。

建立更好的甚至是新的植物——微生物共生关系，特别是将根瘤菌转移到其他非豆科植物上，实现固氮作用；将固氮基因转移到不固氮的植物上，使这类植物自己利用大气中的氮自己解决氮素营养问题；发展在常温常压下合成氨等。

8.5.2 根瘤的形成、结构与功能豆科植物固氮是豆科植物和根瘤菌相互作用，形成根瘤，由根瘤菌在根瘤内提供固氮活性酶，植物提供固氮所需的环境和能源的相互协作的过程。

因此，根瘤菌、植物及其相互作用都能影响共生固氮。

根瘤菌和植物的相互识别、相互作用是一个非常复杂的生理、生化过程，涉及到植物和根瘤菌的各个方面。

8.5.2.1 根瘤的形成过程豆科植物根瘤的形成是根瘤菌和植物之间对抗和协调的统一，最终成为相互有利的共生关系。

但在某些情况下，协调关系不能完全建立，如根瘤菌对豆科植物只是单纯寄生。

根瘤形成过程大体上可分为感染，根瘤的发生和根瘤的发育三个阶段。

从起源划分，根瘤又分为外生型和内生型两种。

外生型的感染局限于皮层的薄壁组织，除维管束以外，根的中柱组织和根瘤的形成无关。

内生型根瘤的组织完全是由中柱鞘的再生分化而形成的。

1）感染和侵染过程根瘤菌一般通过豆科植物的根毛对植物根部进行感染，也有直接通过细胞壁感染。

还有一些植物是由侧根穿过表皮的裂隙部位侵染植物组织内部。

而水生的豆科植物则是从表皮层细胞侵染根部。

感染形成的根瘤一般有两种类型，一种无限生长型根瘤（如：三叶草、苜蓿、豌豆等），具有顶端分生组织，在根瘤成熟后能继续生长，使根瘤体积增大，以致分叉。

另一种是在有限生长型根瘤，没有分生组织，生长发育一段时间后，各部分同时分化成熟，根瘤体积不再增大（如大豆、豇豆、山麻黄、花生等），如图8-1。

无限型根瘤有限型根瘤图8-1 无限型根瘤和有限型根瘤（（引自李阜棣，2000）根瘤菌和豆科植物相互作用时，首先是豆科植物根系在土壤中生长，刺激相应的根瘤菌向根际移动并大量繁殖。

根的这种影响甚至可以达到2-3厘米远的距离。

这时，许多根瘤菌吸附在根的表面。

这种吸附不是简单的物理过程，而是豆科植物与相应的根瘤菌之间的特定识别作用。

其基本过程为：1）植物分泌特异的黄酮或类黄酮物质；2）根瘤菌合成和释放类似几丁质的寡聚多糖（胞外多糖）；被称之为结瘤因子；都含有3～5个糖苷基单位组成的 -1,4-N乙酰葡萄糖胺骨架；在非还原段C-2位上有一脂肪酸链；因菌种不同，两端的其它碳位上具有不同基团，它们决定结瘤作用的特异性；3）如果结瘤因子能够正确识别出黄酮或类黄酮物质，就会激活其它的nod基因，然后这些基因的编码蛋白共同形成结瘤因子；4）植物再识别并确认正确的结瘤因子，这样，结瘤因子就启动了结瘤的早期过程；5）除结瘤因子之外，根瘤菌的胞外多糖可能在以后结瘤过程中(细菌侵染植物细胞)起到重要的识别作用。

根瘤菌进入根毛细胞的部位，根毛细胞壁内陷，并开始分泌一种含纤维质的物质，将根瘤菌包围起来，随着根瘤菌向前推进，形成一条管状的分枝或不分枝的纤维素鞘，称着侵染线。

在显微镜上可看到根瘤菌在卷曲的根毛壁上形成一个明显的点，并不断膨大。

侵染线不断延伸，直到根的内皮层。

在适宜的寄主细胞中，侵染线细胞破裂，细菌释放到寄主细胞的细胞质中，然后，每个细菌由寄主植物产生膜包围起来，膜和膜之间留有空隙，可以让植物细胞内氧、氢和二氧化碳等气体，有时包括氨气体通过，以适应生物固氮的需要。

根瘤菌侵染线形成和发展过程中，根毛细胞核具有十分重要的作用，如果最初侵染点上没有细胞核，侵染线就不能发育而造成其凋亡。

侵染线使根毛生长速率减少7-10 μm h-1。

McCoy’s (1932)对紫花苜蓿的研究表明，侵染线在化学结构上与根毛壁是相似的。

侵染线的形成频率相当低，在这些侵染线中，根瘤菌分开被包围在一种尚未成型的结构中。

这种结构由细菌外多糖和植物糖蛋白组成。

侵染线的尖端是开放的。

侵染线尖端的封闭会导致其不能形成。

Vance (1983)认为，侵染线的根毛细胞壁对试图穿透或机械伤害产生应答性生长，这与对疾病的抵抗反应是类似的。

根瘤菌在侵染线内不断繁殖，侵染线也就不断伸长，向根毛基部和表皮细胞推进。

每小时约可前进5-8μm，1-2天内到达表皮细胞。

通常每条根毛有一根或几根侵染线，但只有个别侵染线能够持续发展。

当侵染线到达根毛细胞基部的细胞壁时，侵染线壁同细胞壁联接起来，穿过表皮细胞壁向根内推进。

侵染线到达根的皮层后就分枝发育，侵染线侵入根的皮层组织的深度随植物种类和入侵位置而异。

在大豆主根中，侵染线只能达到皮层第5-6层薄壁细胞；在侧根中，由于皮层细胞的抵抗力较弱，侵染线可直达到中柱鞘细胞层。

2）根瘤的发生和发育当侵染线到皮层3-6层细胞时，位于前方靠近内皮层的细胞受到影响，开始分裂，成为根瘤的分生组织。

而寄主根部皮层细胞进一步分裂发育增长形成纤维厚壁组织，在外观上凸出到根的表层上，成为“疙瘩”，即所谓的根瘤。

不断长大的根瘤分化为外皮层组织和内部组织，并形成维管束与根的维管束接连起来，建立了共生关系。

共生开始后，根瘤菌聚集在寄主细胞的细胞质外围，大量繁殖，变成环带状的肿大类菌体。

在圆球状有限型生长根瘤中，如Lotus, Glycine, Phaseolus 和Vigna，结瘤分生组织在外皮层开始。

然后，在内皮层细胞也产生分裂。

这些分生组织融合，形成初始根瘤体。

通过细胞膨大向四周分裂，产生圆球状根瘤。

分生组织仅在根瘤发育的早期发挥短期（8-14天）作用。

成熟有限生长型根瘤组织没有分生能力。

相反，在无限生长型的根瘤里，如苜蓿和三叶草，根瘤分生组织发育是在邻接内皮层的内皮部。