微生物细胞的破碎技术

加低浓度变 性剂洗滤
除变性剂 复性
加变性剂 溶解
于绝大部分非蛋白类的物质；
• 酶解法
✓利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的
键，从而达到破壁的目的。
✓优点：专一性强，发生酶解的条件温和。
✓缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于
小规模的实验室研究。
✓溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分
解 细 胞 壁 上 糖 蛋 白 分 子 的 α-1 ， 4 糖 苷 键 ， 使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞 移至低渗溶液中使细胞破裂。
2. 细胞壁的组成和破碎阻力
细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自
于肽聚糖的网状结构。
酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻
力来自于壁结构交联的紧密程度和厚度。
丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几
丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结 构。
各种微生物细胞壁的结构与组成
3.微生物细胞的破碎技术
✓ 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等
化学法
优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少， 核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备 等优点，故使用较多。 缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随 后产物的纯化带来困难
总结：①酸碱容易造成产物水解或变性，慎用； ②表面活性剂以及丁酯、丁醇、丙酮等有机溶剂适合
• 渗透压冲击
✓是较温和的一种破碎方法，将细胞放在
高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或 蔗糖溶液)，达到平衡后，介质被突然稀 释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由 于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞 内，引起细胞壁的破裂。
✓渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的
菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成 受抑制而强度减弱时才是合适的。
• 冻结-融化法
✓将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融
化，反复多次而达到破壁作用。
✓对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。
但通常破碎率很低即使反复循环多次也 不能提高收率。另外，还可能引起对冻 融敏感的某些蛋白质的变性。
• 干燥法
✓可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥
和冷冻干燥等。
✓空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥
来自百度文库
影响因素
• 操作压力（50～70MPa） • 细胞浓度（20％） • 温度 • 循环次数(2~5)
高压匀浆器
珠磨法
珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮 液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。 这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温 度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器 可得到部分解决。
• 超声波法
✓细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产
生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘 滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应 力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破 碎。
✓影响因素:功率、发射时间、次数、细胞悬浮
液体积
✓对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不
同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比 革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果 极差。
第3章 微生物细胞的破碎
知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的 破碎技术，破碎率的测定。
重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的 原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情 况予以合理的选择。
难点：常用破碎方法的合理选用。
1. 微生物细胞的破碎技术概述
胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物 细胞本身： 单细胞蛋白（SCP） 胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产 物等
适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较 不稳定的生化物质。
✓干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白
质或其它组织变性。
机械破碎法与非机械法比较
4 破碎方法的选择
✓ 细胞的量 ✓ 破碎条件——目标产物对破碎条件的 敏感性 ✓ 破碎目标——待破碎细胞的机械强度
破碎率的测定
1.直接测定法 2.测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导 率
破碎技术的新进展
①多种破碎方法相结合：冻融法与匀浆法结合 破碎酵母，有效提高破碎率
②与上游过程相结合：利用病毒进行裂解溶胞 ③将细胞破碎与后续分离结合：珠磨法与双水 相萃取
5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性
➢ 什么是包含体 外源蛋白质基因在受体菌中表达时形成的
没有活性的蛋白质聚集体称为包含体。包含 体内除目标蛋白外还有微量的质粒，rRNA 和RNA聚合酶。
包含体蛋白的一级结构是正确的，但空间 折叠错误，故没有生物活性。
5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性
➢ 包含体形成的原因 1.缺少某些折叠的协助因子; 2.局部微环境不适宜，不能正确的形成次级键; 3.包含体蛋白表达速度过快，表达量过高
5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性
高速珠磨机
珠磨法特点
• 破碎率较高 • 适合大规模细胞破碎 • 碎片较小，胞内物质释放完全 • 温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备 • 相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和
藻类
影响细胞破碎的因素
• 搅拌速度（700～1450r/min） • 料液的循环速度（50～500L/h） • 细胞浓度（0.3～0.5g/mL） • 珠粒大小和填充量 （0.45～1mm；70％～90％)
高压匀浆法
• 高压匀浆器
采用高压匀浆器是 大规模破碎细胞的 常用方法，利用高 压迫使细胞悬浮液 通过针形阀，由于 突然减压和高速冲 击撞击环造成细胞 破裂
高压匀浆法特点
• 破碎率较高 • 适合大规模细胞破碎 • 碎片细小，胞内物质释放完全 • 适合格兰氏阳性菌和酵母的破碎;不适合霉
菌,因为容易造成堵塞;对革兰氏阳性菌破碎 效果较差
➢ 包含分离的工艺路线
机械 破碎
离心提取 包含体
加变性剂 溶解
除变性剂 复性
化学破碎，溶解包 含体（加变性剂）
离心除细 胞碎片
除变性剂 复性
5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性
➢ 包含分离的工艺路线
机械 破碎
洗滤去除 可溶杂质
加变性剂 溶解
除变性剂 复性
机械 破碎
洗滤去除 可溶杂质
✓该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入
很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。
电声超声波发生器
• 化学法
• 化学法
采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞 内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有 机溶剂等化学试剂
✓ 酸使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱
和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分 从细胞内渗漏出来。常用表面活性剂有胆酸盐、磷脂、 SDS、CTAB、